枸杞（Lycium barbarum L.）系茄科枸杞属落叶灌木植物，是我国传统的中药材，富含多种活性成分如多糖、黄酮类化合物、生物碱、枸杞色素、氨基酸类等。大量研究表明，枸杞多糖具有抗氧化[1-2]、保护肝功能[3-4]、降低血糖[5]、修复心肌损伤[6]、抗病毒[7]、抗肿瘤[8]、抗衰老[9]和增强免疫力[10-11]等功效。目前，多糖提取大多采用的是酶法提取、超声提取、酶提取、酸碱提取、热水提取等技术手段[12]。酶法提取技术具有反应条件温和、不影响产物的生物活性、产率高、成本低以及绿色环保等多种提取优势[13]。而在酶法提取过程中，多使用纤维素酶、中性蛋白酶、半纤维素酶和木瓜蛋白酶进行酶解[14]。并且，使用以上酶的复合酶比使用单酶的酶解效果更佳。此外，为了进一步提升多糖纯度和提取率，很多研究将其他方法与酶法提取联用，以弥补各种提取技术的缺陷。例如，将超滤分离技术与酶法提取联合使用可以实现对不同分子量多糖的分离和纯化，可以得到分子量相对均一的多糖[15]。其中，超滤是一种经典的物理膜分离技术[16]，具有设备易操作[17]、过程无相变、无化学反应发生等优点，此过程可以最大限度保持多糖的生物活性。迄今为止，关于利用酶法和超滤技术联合提取枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide，LBP）的研究还未有报道。基于此，本文在单因素试验（加酶量、提取温度、料液比和pH）的基础之上，采用正交试验对枸杞多糖的酶法提取进行优化；其次，通过考察超滤时间、质量浓度以及超滤压力对超滤过程的影响，得到对枸杞多糖分级的最佳超滤工艺；最后通过测定枸杞多糖的DPPH自由基、ABTS+自由基、超氧阴离子自由基的清除能力，探究不同级分枸杞多糖的抗氧化活性。本研究最终可以为枸杞多糖的进一步开发和研究提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
枸杞：市售；纤维素酶（7 000 U/g）、中性蛋白酶（120 000 U/g）、木瓜蛋白酶（100 000 U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；3.5 kDa和10 kDa的中空纤维素超滤膜：国初科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、氯化硝基四氮唑蓝（nitro-blue tetrazolium chloride，NBT）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）、2，2′-联氮-双（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2，2′-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）、过硫酸钾、维生素 C：中国医药集团有限公司；所有使用的试剂均为分析纯。
1.2 仪器设备
UV1000紫外分光光度计：上海天美科学仪器有限公司；GCM-S-02卷式膜小试设备：国初科技有限公司；H1850R高速冷冻离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；SIL-20AT液相色谱仪：日本岛津仪器有限公司；DF-15超高速粉碎机：温岭市林大机械有限公司。
1.3 方法
1.3.1 枸杞多糖提取率测定
利用苯酚-硫酸法[18]测定枸杞多糖提取率。绘制所得葡萄糖的标准曲线为Y=6.6043X+0.0086（R2=0.9993）；其中，Y代表吸光值；X代表多糖的浓度，mg/mL。
1.3.2 复合酶辅助提取枸杞多糖工艺优化
参考Giacobbo等[19]方法提取枸杞多糖，将枸杞置于70℃烘箱烘干至恒重，利用超高速粉碎机少量多次粉碎，过150目筛，枸杞粉末置于干燥器内保存。称取5 g枸杞粉于烧杯中，按照料液比加入离子水和一定比例的复合酶，水浴提取，结束后于95℃下灭酶15 min，离心，测定上清液多糖含量。以枸杞多糖提取率为评价指标，首先对木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、半纤维素酶和纤维素酶进行复合酶种类和质量比的筛选；然后利用单因素和正交试验考察总加酶量、料液比、pH值和提取温度对提取率的影响，确定复合酶提取枸杞多糖的最优工艺参数，并进行验证试验。正交试验因素及水平见表1。
表1 酶法提取枸杞多糖正交试验设计
Table 1 Orthogonal experimental design of enzymatic extraction on Lycium barbarum polysaccharides
水平（g/m L） C p H值 D提取温度/℃1 1 1∶2 0 4 4 0因素A总加酶量/%B料液比/2 1∶3 0 5 5 0 3 3 1∶4 0 6 6 0 2
1.3.3 超滤法分离枸杞多糖工艺优化
选用截留分子量为10 kDa和3.5 kDa的两种聚砜中空纤维超滤膜材料，进行超滤，以膜通量为考察指标，考察枸杞多糖质量浓度（2 g/L～6 g/L）、超滤时间（10 min～80 min）和超滤压力（0.1 MPa～0.6 MPa）对膜通量的影响，以此对超滤条件进行优化，并对Mw＜3.5 kDa、3.5 kDa＜Mw＜10 kDa和 Mw＞10 kDa的多糖组分截留收集。通过如下公式计算膜通量。
式中：J为膜通量，L/（m2/h）；V为渗透液体积，L；S为超滤膜面积，m2；t为超滤时间，h。
1.3.4 相对分子量的测定
利用凝胶排阻色谱测定多糖分子量[20]。色谱柱：TSK gel G2000 SWXL（300 mm×7.8mm，5 μm）；流动相：蒸馏水；流速：0.5 mL/min；进样量：20 μL；样品浓度：1 mg/mL。
1.3.5 体外抗氧化能力测定
1.3.5.1 O2-·清除能力测定
采用Li等[21]的方法测定多糖的超氧阴离子自由基的清除能力。
1.3.5.2 DPPH·清除能力测定
采用Kan等[22]的方法测定多糖的DPPH自由基的清除能力。
1.3.5.3 ABTS+·清除能力测定
根据Yang等[23]的测定方法，对ABTS+自由基清除率进行测定。
1.4 数据分析统计
所有试验结果均采用平均值±标准偏差进行统计，利用Origin 2019b数据处理及绘图，显著性分析采用的是SPSS19.0统计分析软件，p＜0.05代表差异显著，p＜0.01代表差异极显著。
2 结果与分析
2.1 枸杞多糖的复合酶法提取工艺优化
2.1.1 酶的筛选
酶的种类及质量比对枸杞多糖提取率的影响见图1。
图1 酶的种类及质量比对枸杞多糖提取率的影响
Fig.1 Effects of enzyme types and ratio on extraction rate of LBP
A～H分别代表纤维素酶、半纤维素酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、纤维素酶和木瓜蛋白酶、纤维素酶和中性蛋白酶、半纤维素酶和木瓜蛋白酶、半纤维素酶和中性蛋白酶。图中不同的小写字母代表不同组之间的差异显著，p＜0.05。
如图1所示，复合酶法对枸杞多糖的提取率比单酶的提取率要高，其中通过纤维素酶和木瓜蛋白酶复配时，对枸杞多糖的提取率达到最大值（6.73%），并与其他组之间具有显著差异（p＜0.05）。此外，当纤维素酶和木瓜蛋白酶的质量比为1∶1.5（g/g）时，提取率最高（6.81%），与其它质量比的提取率之间具有显著差异（p＜0.05），其原因可能在于纤维素酶和木瓜蛋白酶之间的相互作用，并且木瓜蛋白酶占主导地位，通过将蛋白聚糖中的游离蛋白进行水解，促进了多糖的溶出。因此，确定纤维素酶和木瓜蛋白酶的质量比为1∶1.5进行后续的试验研究。
2.1.2 单因素试验结果及分析
单因素试验结果见图2。
图2 总加酶量、料液比、pH值和提取温度对枸杞多糖提取率的影响
Fig.2 Effects of total enzyme dosage，solid-liquid ratio，pH value and extraction temperature on the yield of LBP
A～D分别为总加酶量、料液比、pH值、提取温度对提取率的影响。不同小写字母代表不同组之间差异显著，p<0.05。
如图2A所示，随着总加酶量的提高，枸杞多糖的提取率相应提高。当总加酶量为2%时，枸杞多糖的提取率最高，为6.81%，且与其他组之间具有显著差异（p<0.05）。继续提高酶用量时，提取率缓慢降低，可能是复合酶的添加量在该底物浓度下趋于饱和状态，因此选择复合酶最佳添加量为2%。如图2B所示，提取率随溶液体积的增大呈先上升后下降的趋势，料液比1∶30（g/mL）时，提取率达到最大值（6.92%），与其他组之间有显著性差异（p<0.05）。当溶剂用量继续增大，对底物形成稀释作用，降低了碰撞概率，导致提取率降低，所以最优的料液比确定为1∶30（g/mL）。如图2C所示，pH值为5时，提取率达到最高值（6.85%），与其他组相比有显著性差异（p<0.05）。继续增大pH值时，提取率明显下降。不处于最适pH值范围时，酶分子的解离状态发生改变，酶的反应速率降低，多糖提取率降低[24]，因此选择最佳pH值为5。如图2D所示，多糖提取率随提取温度的升高逐步上升，提取温度为50℃时，多糖提取率达到最高值（6.73%），与其他组有显著性差异（p<0.05）。而提取温度超过50℃时，枸杞多糖的提取率明显降低。原因在于提取温度会对酶的活性产生重要影响，不同的酶具有各自最适的温度范围。当温度低于温度范围，酶的活性不能充分发挥；而高于温度范围，则易引起酶失活。因此选择最佳温度为50℃。
2.1.3 正交试验结果及分析
枸杞多糖酶法提取正交直观分析见表2，枸杞多糖酶法提取正交方差分析见表3。
表2 正交直观分析
Table 2 Orthogonal visual analysis
（g/m L） C p H值 D提取温度/℃1 1 1∶2 0 4 4 0 5.7 8 2 1 1∶3 0 5 5 0 5.8 7 3 1 1∶4 0 6 6 0 5.8 0 4 2 1∶2 0 5 6 0 6.5 8 5 2 1∶3 0 6 4 0 6.8 0 6 2 1∶4 0 4 5 0 7.2 8 7 3 1∶2 0 6 5 0 5.8 0 8 3 1∶3 0 4 4 0 6.5 0 9 3 1∶4 0 5 6 0 6.0 0 K 1 1 7 4.7 5 1 8 1.8 0 1 9 5.6 3 1 8 5.9 4 K 2 2 0 6.7 0 1 9 1.7 3 1 8 4.6 5 1 8 9.7 2 K 3 1 8 3.0 3 1 9 0.9 5 1 8 4.2 1 8 8.8 2 k 1 5 8.2 5 6 0.6 0 6 5.2 1 6 1.9 8 k 2 6 8.9 0 6 3.9 1 6 1.5 5 6 3.2 4 k 3 6 1.0 1 6 3.6 5 6 1.4 0 6 2.9 4最优水平 A 2 B 2 C 1 D 2极差 1 0.6 4 3.3 1 3.8 1 1.2 6序号A总加酶量/%B料液比/因素 提取率/%
表3 方差分析
Table 3 Orthogonal variance analysis
注：*表示差异显著，p<0.05。
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性A总加酶量 1 8 3.0 8 2 1 0.8 0 5.1 4 *B料液比 2 0.3 2 2 1.2 0 5.1 4 C p H值 2 7.9 3 2 1.6 5 5.1 4 D温度 2.6 2 2 0.1 5误差 5 0.8 7 8
由表2和表3可知，不同因素对枸杞多糖提取率影响的主次顺序为总加酶量＞pH值＞料液比＞提取温度，且总加酶量对试验结果有显著影响，其他3种因素对试验结果无显著影响。由K值所得最佳工艺为A2B2C1D2，即总加酶量2%，提取温度50℃，pH4，料液比 1∶30（g/mL），测得多糖提取率为（7.28±0.12）%。验证试验所得的枸杞多糖提取率为（7.54±0.08）%，高于9组正交试验结果，并且与预测结果比较接近，说明本工艺的稳定性较好、可行性强。
2.2 超滤对枸杞多糖的分级优化试验结果
超滤时间、超声压力、枸杞多糖质量浓度对膜通量的影响见图3。
图3 超滤时间、超声压力、枸杞多糖质量浓度对膜通量的影响
Fig.3 Effect of ultrafiltration time，ultrafiltration pressure and LBP mass concentration on membrane flux
如图3所示，膜通量随超滤时间的延长而增大，而当超滤时间达到60 min之后，膜通量的增幅降低，原因在于过长的超滤时间会使膜表面的浓度差出现极化，造成膜组件受损，因此确定超滤时间为60 min。随着超滤压力的增加膜通量随之增大，当达到0.25 MPa的压力时，膜通量达到稳定状态，若此时继续增压，则可能会对膜造成污染，甚至会对膜的结构造成破坏，因此确定超滤压力为0.25 MPa。膜通量随多糖质量浓度先增大后减小，多糖质量浓度为3 g/L时，膜通量达到最大值。此外，随多糖质量浓度增加，膜的表面会对料液中的大分子多糖进行吸附而聚集，增大传质阻力，进一步造成膜的污染[25]，因此选择多糖质量浓度3 g/L。综合超滤分级单因素结果，超滤分级最佳工艺条件为超滤时间60 min，枸杞多糖质量浓度3 g/L，超滤压力0.25 MPa。
2.3 超滤分级组分分子量测定
超滤分级组分分子量见表4。
表4 超滤多糖的分子量
Table 4 Molecular weight of ultrafiltered polysaccharides
样品条件 出峰 分子量/D a 峰面积占比/%M w＜3.5 k D a组分 峰1 1 7 8 2 6 9.9 4 6峰2 7 5 4 3 0.0 5 4 3.5 k D a＜M w＜1 0 k D a组分 峰 1 4 4 1 0 8 4.2 7 2峰2 6 8 0 1 3.7 2 8 M w＞1 0 k D a组分 峰 1 8 7 9 4 7 6.5 3 7峰2 3 5 6 2 3.4 6 3
由表4可知，Mw＜3.5 kDa、3.5 kDa＜Mw＜10 kDa、Mw＞10 kDa组分的多糖质量占粗多糖质量分数的52.46%、29.25%和 16.5%，分子量分别为 1 782、4 410、8 794 kDa。受多糖形貌、水溶性及多糖在溶剂中的分布形态的影响，经超滤分离得到的多糖组分的分子量分布与超滤膜的截留分子量不完全成对应关系[26]，但试验结果表明枸杞多糖达到了分离的初步效果。
2.4 体外抗氧化活性分析
枸杞多糖不同组分的ABTS+·、DPPH·和超氧阴离子自由基清除率见图4。
图4 枸杞多糖组分的ABTS+·、DPPH·和超氧阴离子自由基清除能力
Fig.4 ABTS+·，DPPH·and superoxide anion radical scavenging ability of LBP fractions
如图4可知，粗多糖及3种多糖组分对ABTS+自由基均具有清除效果，且清除效果与浓度呈正向线性关系。当浓度为 4 mg/mL 时，Mw＞10 kDa、3.5 kDa＜Mw＜10 kDa、Mw＜3.5 kDa、粗多糖和 VC的 ABTS+自由基清除率分别为81.27%、75.33%、69.42%、62.48%和92.61%。ABTS+自由基清除能力强弱顺序为Mw＞10 kDa、3.5 kDa＜Mw＜10 kDa、Mw＜3.5 kDa、粗多糖。当浓度从 0提高到4 mg/mL时，粗多糖及3种多糖组分的DPPH自由基清除能力迅速增加后逐渐平缓。浓度为4 mg/mL时，Mw＞10 kDa、3.5 kDa＜Mw＜10 kDa、Mw＜3.5 kDa、粗多糖和 VC的DPPH自由基清除活性分别达到85.37%、70.41%、66.12%、65.46%和92.64%。DPPH自由基清除能力强弱顺序为 Mw＞10 kDa、3.5 kDa＜Mw＜10 kDa、Mw＜3.5 kDa、粗多糖，原因在于3种多糖组分作为供氢剂，与DPPH自由基反应生成更稳定的产物，从而清除DPPH自由基，而粗多糖因其成分复杂，供氢能力较弱，与DPPH自由基结合较少[27]，从而影响了其抗氧化活性。随着多糖质量浓度的增加，各多糖组分对超氧阴离子自由基的清除效果也逐渐增强。浓度为4 mg/mL时，Mw＞10 kDa、3.5 kDa＜Mw＜10 kDa、Mw＜3.5 kDa、粗多糖和VC的超氧阴离子自由基清除率分别为70.22%、56.41%和48.43%、47.44%、91.9%。超氧阴离子自由基清除能力强弱顺序为 Mw＞10 kDa、3.5 kDa＜Mw＜10 kDa、Mw＜3.5 kDa、粗多糖。
综合对比可看出，粗多糖与3种分级多糖组分均具有较好的抗氧化活性，且与多糖浓度呈正相关性，体外抗氧化活性强弱顺序为Mw＞10 kDa、3.5 kDa＜Mw＜10 kDa、Mw＜3.5 kDa、粗多糖，说明超滤辅助复合酶法比复合酶法提取枸杞多糖的效果更佳，且多糖分子量越大，抗氧化活性越高。
3 结论
以甘肃枸杞为原料，多糖提取率为评价指标，单因素和正交试验结合优化复合酶法提取枸杞多糖工艺，得到最佳工艺条件：纤维素酶和木瓜蛋白酶质量比为 1∶1.5（g/g），总加酶量 2%，料液比 1∶30（g/mL），提取温度50℃，pH4。超滤分级优化工艺为超滤时间60 min，多糖质量浓度3 g/L，超滤压力0.25 MPa。体外抗氧化活性结果表明，枸杞多糖具有一定的抗氧化活性，且Mw＞10 kDa组分抗氧化活性最高，其次是3.5 kDa＜Mw＜10 kDa组分，Mw＜3.5 kDa组分抗氧化活性最低，但3种级分的枸杞多糖抗氧化活性均高于粗多糖。以上结果说明，超滤辅助复合酶法提取工艺方便可行，得到的枸杞多糖具有较强的体外抗氧化活性，为研究不同分子量多糖与活性的关系奠定理论基础，并为高活性枸杞多糖的制备提供了新方法。
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