黄秋葵籽含油率为20%左右，其油富含不饱和脂肪酸且比例均衡，是一种潜在的优良油料[1-3]。黄秋葵籽油中含有丰富的脂肪酸，其中含量最高的是人体必需的不饱和脂肪酸—亚油酸，其次是油酸、棕榈酸。其饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸比例合适，接近1∶1∶1的理想模式，具有降低血压、降低胆固醇、降低血脂、软化血管以及促进微循环的作用；此外黄秋葵籽油中还含有丰富的抗氧化物质，具有清除自由基、保护肝脏、修复胃黏膜等功效，是一种保健功能和开发价值较高的油脂[4-6]。
目前黄秋葵籽油的提取方法已有研究，主要包括有机溶剂萃取法、超临界CO2萃取法、水酶法等，近几年研究较多的是有机溶剂萃取法，但对于水酶法提取黄秋葵籽油的研究却较少。水酶法是近年来新兴的一种环保提油技术，油脂科学界将水酶法提油技术称为“一种油料资源的全利用技术”。与传统制油技术相比，水酶法可以同时得到黄秋葵籽油和蛋白质，缩短工艺路线；操作条件温和、耗能低、投资低、出油率高；不使用有机溶剂，低碳安全环保[7]。
超声波辅助水酶法提取技术是一种新兴的提取分离技术，能够强化植物中油脂的提取，加速传热和传质过程[8]。在超声波作用下，产生的空泡在爆裂时可以产生巨大的剪切力，因此可有效地破坏油料的细胞壁，并使细胞壁内的物质得到释放[9]。本试验对超声波辅助水酶法提取黄秋葵籽油进行研究，在单因素试验的基础上选出最佳的超声波预处理条件和酶解条件，再利用正交试验法进行优化，得出最佳的黄秋葵籽油提取工艺，为黄秋葵籽油工业发展奠定一定的研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黄秋葵籽：市售。
中性蛋白酶（酶活0.8 AU/g）、碱性蛋白酶Alcalase 2.4 L（酶活 2.4 AU/g）、磷脂酶（酶活 10 KLU/g）、果胶酶（酶活 3 300 PGNU/g）、纤维素酶（酶活 700 EGU/g）、复合蛋白酶（酶活1.6 AU/g）：丹麦Novo公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
ESJ205-4电子分析天平：普利赛斯国际贸易有限公司；FW-100高速万能粉碎机：上海科恒实业发展有限公司；JY92-IIN型超声波细胞粉碎机：北京泰亚赛福科技发展有限责任公司；DW-86L386立式超低温保存箱：青岛海尔特种电器有限公司；GL-16G-II高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；HZS-H水浴振荡器：哈尔滨市东联电子开发有限公司；PHS-3C型pH计：杭州齐威仪器有限公司；JOYN-H1C1微波化学试验炉：上海乔跃电子有限公司；KDN-103F自动定氮仪、HYP-10404十孔消化炉：上海纤检仪器有限公司；SCT-02索氏抽提器：天津玻璃仪器厂；SX-4-10箱式电阻炉：天津市泰斯特仪器有限公司；WSL-2罗维朋比色计：浙江托普仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 试验工艺流程
水酶法提取黄秋葵籽油工艺流程见图1。
图1 水酶法提取黄秋葵籽油工艺流程图
Fig.1 Process for aqueous enzymatic extraction of okra seed oil
1.3.2 黄秋葵籽主要成分的测定
水分根据GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》测定[10]；粗脂肪根据GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》测定[11]；粗蛋白根据GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》测定[12]；灰分根据GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》测定[13]。
1.3.3 酶制剂的选择
本试验选择了中性蛋白酶、磷脂酶、果胶酶、纤维素酶、碱性蛋白酶Alcalase 2.4L、复合蛋白酶6种酶。在料液比 1∶6（g/mL）、加酶量 2.0%、酶解时间 4 h、酶解pH值分别为中性蛋白酶pH 6.5、磷脂酶pH 6.0、果胶酶pH5.0、纤维素酶pH5.2、碱性蛋白酶Alcalase2.4LpH 7.7和复合蛋白酶pH 7.0的条件下分别研究酶制剂对黄秋葵籽油提取率的影响，最终确定最佳酶制剂。
1.3.4 超声波预处理试验
1.3.4.1 超声波预处理单因素试验
分别以料液比[1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8（g/mL）]、超声时间（15、25、35、45、55 min）、超声功率（总功率为500 W）（50%、60%、70%、80%、90%）、超声温度（15、25、35、45、55℃）为单因素，考察各因素对黄秋葵籽油提取率的影响。
1.3.4.2 超声波预处理正交试验
在单因素试验基础上，根据结果确定正交试验条件范围，以料液比、超声时间、超声功率和超声温度为因素，以黄秋葵籽油提取率为指标，进行四因素三水平正交试验，确定最佳超声波预处理条件。超声波预处理正交试验因素与水平见表1。
表1 超声波预处理正交因素水平
Table 1 Factors and levels of the orthogonal test for ultrasound pretreatment
水平D超声温度/℃1 1∶5 35 50 35 2 1:∶6 45 60 45 3 1∶7 55 70 55因素A料液比/（g/mL）B超声时间/min C超声功率/%
1.3.5 酶解条件选择
1.3.5.1 酶解单因素试验
分别以加酶量（1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）、酶解时间（1、2、3、4、5 h）、酶解 pH 值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）为单因素，考察各因素对黄秋葵籽油提取率的影响。
1.3.5.2 酶解正交试验
酶解正交试验因素与水平见表2。
表2 酶解正交因素水平
Table 2 Factors and levels of the orthogonal test for enzymatic hydrolysis
水平 因素A加酶量/% B酶解时间/h C酶解pH值1 1.5 3 6.5 2 2.0 4 7.0 3 2.5 5 7.5
1.3.6 黄秋葵籽油提取率测定
按照试验设计加入酶制剂进行酶解，酶解过程用2 mol/L NaOH溶液和2 mol/L HCl溶液调整酶解过程的pH值。酶解结束后进行离心操作（转速10 000 r/min、时间20 min、温度4℃），离心后分为4层（游离油1、乳状液、水解液、残渣），取出乳状液进行冷冻、微波解冻处理，进行二次离心，得到游离油2，最后将两次得到的游离油称量计数。黄秋葵籽油提取率计算公式如下。
1.3.7 数据处理
所有的试验至少进行3次，利用Origin 8.5软件进行作图。
2 结果与分析
2.1 黄秋葵籽的主要成分含量
黄秋葵籽的主要成分含量见表3。
表3 黄秋葵籽的主要成分
Table 3 Main components of the okra seeds
成分 质量分数/%水分 7.34±0.09粗脂肪 18.35±0.15粗蛋白 24.67±0.08灰分 4.46±0.02
如表3所示，本试验的黄秋葵籽主要成分：水分约为7.34%，粗脂肪约为18.35%，粗蛋白约为24.67%，灰分约为4.46%。
2.2 酶种类的选择
不同种类酶制剂对黄秋葵籽油提取率的影响见图2。
图2 不同种类酶制剂对黄秋葵籽油提取率的影响
Fig.2 Effect of enzyme species on yield of okra seed oil
由图2可知，在料液比、加酶量、酶解时间相同的情况下，复合蛋白酶的黄秋葵籽油提取率最高，为42.96%，因此，最佳酶制剂是复合蛋白酶。
2.3 超声波预处理试验结果
2.3.1 超声波预处理单因素试验结果
2.3.1.1 料液比对黄秋葵籽油提取率的影响
不同料液比对黄秋葵籽油提取率的影响见图3。
图3 不同料液比对黄秋葵籽油提取率的影响
Fig.3 Effects of material-to-liquid ratio on yield of okra seed oil
由图3可知，随着溶液体积的增加，黄秋葵籽油提取率呈现先增大后减小的趋势；当料液比为1∶6（g/mL）时，黄秋葵籽油提取率最高，为42.37%。当料液比较小时，体系黏度较高，不利于酶分子的迁移和油分子的释放，而当料液比较大时，降低了酶与底物发生碰撞的几率[14]。因此，确定最佳料液比为 1∶6（g/mL）。
2.3.1.2 超声时间对黄秋葵籽油提取率的影响
不同超声时间对黄秋葵籽油提取率的影响见图4。
图4 不同超声时间对黄秋葵籽油提取率的影响
Fig.4 Effect of ultrasonic time on yield of okra seed oil
由图4可知，当超声时间小于45 min时，随着超声时间的延长，黄秋葵籽油提取率逐渐增加，这是因为在初始阶段超声对细胞的破坏作用相对较大，使得黄秋葵籽油提取率增加；当超声时间为45 min时，黄秋葵籽油提取率最高，为42.95%；超声时间在45 min以后，黄秋葵籽油提取率反而下降，其原因一方面是超声波从黄秋葵籽外部向内部扩散，扩散区域减小，距离增大，扩散率相应减小[15]；另一方面超声时间长会使体系温度急剧升高，导致油分解或挥发，使得黄秋葵籽油提取率下降[16]。因此，最佳超声时间为45 min。
2.3.1.3 超声功率对黄秋葵籽油提取率的影响
不同超声功率对黄秋葵籽油提取率的影响见图5。
图5 不同超声功率对黄秋葵籽油提取率的影响
Fig.5 Effect of ultrasonic power on yield of okra seed oil
由图5可知，当超声功率小于60%时，由于超声功率在不断地增加，使得黄秋葵籽油提取率大幅度升高。这是因为超声波通过溶液产生大量气泡，气泡瞬间破裂形成局部瞬时压力，产生强大的冲击作用破坏细胞壁，从而提高出油率[17]；当超声功率为60%时，黄秋葵籽油提取率最高，为41.91%；超声功率大于60%时，黄秋葵籽油提取率反而下降，这可能是由于产生了自由基导致油降解[18]。因此，最佳超声功率为60%。
2.3.1.4 超声温度对黄秋葵籽油提取率的影响
不同超声温度对黄秋葵籽油提取率的影响见图6。
图6 不同超声温度对黄秋葵籽油提取率的影响
Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on yield of okra seed oil
由图6可知，当超声温度低于45℃时，随着超声温度的增加，黄秋葵籽油提取率逐渐增加，这可能是由于小分子扩散运动和油料空化作用不够完全，而使黄秋葵籽油提取率较低；当超声温度为45℃时，黄秋葵籽油提取率最高，为42.34%；超声温度高于45℃后，黄秋葵籽油提取率呈下降趋势。可能是温度过高导致物料轻微糊化及变性，不利于油脂的释放，继而使得提取率降低[19]。因此，最佳超声温度为45℃。
2.3.2 超声波预处理正交试验结果
超声预处理正交试验结果见表4。
表4 超声预处理正交试验结果及数据分析
Table 4 Orthogonal test results for ultrasound pretreatment and data analysis
编号 A料液比 B超声时间黄秋葵籽油提取率/%1 1 1 1 1 3 6.2 5 2 1 2 2 2 4 0.9 6 3 1 3 3 3 4 1.7 5 C超声功率D超声温度
续表4 超声预处理正交试验结果及数据分析
Continue table 4 Orthogonal test results for ultrasound pretreatment and data analysis
编号 A料液比 B超声时间黄秋葵籽油提取率/%4 2 1 2 3 39.32 5 2 2 3 1 35.11 6 2 3 1 2 44.61 7 3 1 3 2 46.46 8 3 2 1 3 38.34 9 3 3 2 1 45.76 K1 118.96 122.03 119.20 117.12 K2 119.04 114.41 126.04 132.03 K3 130.56 132.12 123.32 119.41 k1 39.653 40.677 39.733 39.040 k2 39.680 38.137 42.013 44.010 k3 43.520 44.040 41.107 39.803 R 3.867 5.903 2.280 4.970最佳 A3 B3 C2 D2 C超声功率D超声温度
由表4可知，由正交试验结果分析最优水平为7号组合，即A3B1C3D2；按照极差R值的大小确定各因素的主次顺序为RB＞RD＞RA＞RC。即影响黄秋葵籽油提取率因素的主次关系依次是超声时间、超声温度、料液比、超声功率；再根据k值分析得出的最佳水平组合为A3B3C2D2未出现在9组试验中，因此增加验证试验，结果见表5。
表5 验证试验结果
Table 5 Verification results
编号 A料液比 B超声时间黄秋葵籽油提取率/%1 3 1 3 2 4 6.4 6±0.4 6 2 3 3 2 2 4 4.9 5±0.3 7 C超声功率D超声温度
由表5可知，A3B1C3D2组合更优于A3B3C2D2组合，因此得到超声预处理最佳条件为料液比1∶7（g/mL）、超声时间35 min、超声功率70%、超声温度45℃，此条件下黄秋葵籽油提取率最高，为46.46%。
2.4 酶解试验结果
2.4.1 酶解单因素试验结果
2.4.1.1 加酶量对黄秋葵籽油提取率的影响
加酶量对黄秋葵籽油提取率的影响见图7。
图7 加酶量对黄秋葵籽油提取率的影响
Fig.7 Effect of enzyme dosage on yield of okra seed oil
由图7可知，当加酶量小于2.0%时，黄秋葵籽油提取率不断升高，其原因可能是增加加酶量，酶与底物作用会更加充分，酶会分解细胞中脂蛋白、脂多糖，使油脂从物料中提取出来[20]。当加酶量大于2.0%时，黄秋葵籽油提取率略有下降，这是因为酶与底物反应达到最大平衡，多余的酶反而与油脂吸附，使油脂得率降低。因此，最佳加酶量为2.0%。
2.4.1.2 酶解时间对黄秋葵籽油提取率的影响
酶解时间对黄秋葵籽油提取率的影响见图8。
图8 酶解时间对黄秋葵籽油提取率的影响
Fig.8 Effect of enzymatic hydrolysis time on yield of okra seed oil
由图8可知，随着酶解时间的延长，黄秋葵籽油提取率逐渐增加；当酶解时间为4 h时，黄秋葵籽油提取率最高为44.67%；当酶解时间在4 h以后，黄秋葵籽油提取率出现下降趋势。当酶解时间较短时，酶与底物反应不充分，提取率较低。随着酶解时间的延长，酶与底物长时间进行充分反应，油脂提取率会提高，但持续延长酶解时间会增加提取成本，过长时间的酶解还会影响油脂的质量[21]。因此，最佳酶解时间为4 h。
2.4.1.3 酶解pH值对黄秋葵籽油提取率的影响
酶解pH值对黄秋葵籽油提取率的影响见图9。
图9 酶解pH值对黄秋葵籽油提取率的影响
Fig.9 Effect of enzymatic hydrolysis pH on yield of okra seed oil
由图9可知，当酶解pH值小于7.0时，随着酶解pH值增大，黄秋葵籽油提取率逐渐增加；当酶解pH值为7.0时，酶的活性最高，酶对底物作用效果明显，黄秋葵籽油提取率最高为44.56%，当酶解pH值大于7.0时，黄秋葵籽油提取率出现下降趋势。因此，最佳酶解pH值为7.0。
2.4.2 酶解正交试验结果
酶解正交试验结果见表6。
表6 酶解正交试验结果及数据分析
Table 6 Orthogonal test results for enzymatic hydrolysis and data analysis
编号 A加酶量 B酶解时间pH值 D空列 黄秋葵籽油提取率/%1 1 1 1 1 38.76 2 1 2 2 2 40.38 3 1 3 3 3 41.74 4 2 1 2 3 48.87 5 2 2 3 1 47.56 6 2 3 1 2 45.51 7 3 1 3 2 39.61 8 3 2 1 3 44.03 9 3 3 2 1 42.96 K1 120.88 127.24 128.30 129.28 K2 141.94 131.97 132.21 125.50 K3 126.60 130.21 128.91 134.64 k1 40.293 42.413 42.767 43.093 k2 47.313 43.990 44.070 41.833 k3 42.200 43.403 42.970 44.880 R 7.020 1.577 1.303 3.047最佳 A2 B2 C2 D3 C酶解
由表6可知，由正交试验结果分析最优水平为4号组合，即A2B1C2D3；按照极差R值的大小确定各因素的主次顺序为RA＞RB＞RC，即影响黄秋葵籽油提取率因素的主次关系依次是加酶量、酶解时间、酶解pH值；再根据k值分析得出的最佳水平组合为A2B2C2D3未出现在9组试验中，因此增加验证试验，结果见表7。
表7 验证试验结果
Table 7 Verification results
编号 A加酶量 B酶解时间pH值 D空列 黄秋葵籽油提取率/%1 2 1 2 3 48.87±0.13 2 2 2 2 3 49.98±0.22 C酶解
由表7可知A2B2C2D3组合更优于A2B1C2D3组合，因此得到酶解最佳条件为加酶量2.0%、酶解时间4 h、酶解pH7.0，此条件下黄秋葵籽油提取率最高，为49.98%。
3 结论
试验得到超声波预处理条件为料液比1∶7（g/mL）、超声时间35 min、超声功率70%（总功率为500 W）、超声温度45℃，在此条件下黄秋葵籽油提取率为46.46%；酶解条件为加酶量2.0%、酶解时间4 h、酶解pH7.0，在此条件下黄秋葵籽油提取率为49.98%。
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