丹参是指唇形科鼠尾草属植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）干燥后的根或根茎，在我国是一种应用广泛的传统中药材，本草纲目中记载丹参具有活血、通心包络、治疝痛等功效[1-3]。在临床治疗中，丹参及其制剂常用于治疗心脉阻滞所致的心绞痛。据报道，采用丹参注射液静脉滴注的方法抢救心肌梗塞患者可扭转部分病员心肌缺血的状况，并能降低血脂[4-5]。丹参也能够降低冠心病患者的血小板活化程度，可有效改善患者的凝血功能[6]。丹参还是养生食疗中常见的材料[7]。丹参与酸枣仁配伍生产的茶饮能够镇静催眠，可以改善饮用者的睡眠质量[8-10]。丹参也可用于泡制具有保健功效的药酒，在《千金翼方》、《圣济总录》等古代中医学经典著作中就记录有牛膝丹参酒、丹参地黄酒、狗脊酒等多种以丹参为主要原料的药酒配方[11]。酒精是良好的极性有机溶剂，丹参中的各种有效成分都易溶于其中。山东某酒厂采用先进的全封闭热回流技术提取以临朐沂山丹参为主的多种中药材的有效成分，配制成一种低度营养保健酒[12-13]。武纪天等[14]以总黄酮和总酚酸含量为评价指标，对以丹参和赤砂糖为主要原料发酵生产丹参保健酒的工艺条件进行了优化，在最优条件下总黄酮和总酚酸含量分别能够达到506 mg/L和354 mg/L。
丹参中的活性成分根据溶解性不同可分为水溶性的酚酸类化合物和脂溶性的二萜醌类化合物[15]。从丹参中陆续分离鉴定到丹参酸甲（又名丹参素）、丹参酸乙、丹参酸丙、紫草酸、异阿魏酸和迷迭香酸等20多种酚酸类化合物[16-18]。丹参活性成分中水溶性的酚酸类化合物是其主要药效活性成分，这些化合物多具有抗肿瘤、抗氧化以及抗炎等药理活性，对心、脑、肝、肾等多组织器官均具有明显的保护作用，因此以丹参为原料开发的保健蒸馏酒、酿造酒对冠心病、心绞痛等疾病应具有一定的治疗效果[12]。目前，济宁市建有多个丹参种植基地，种植面积多达数千亩，助力了当地乡村振兴发展。“鱼台大米”也是济宁市著名特产之一，2008年12月“鱼台大米”被认定为“中国地理标志产品”[19]。中医认为鱼台大米可入脾、胃、肺经，具有补中益气、健脾和胃、滋阴润肺、除烦渴之功效，并且济宁当地一直有使用鱼台大米酿造白酒的传统。因此本研究以鱼台大米白酒为溶媒浸取丹参中活性成分，开发一种丹参白酒，并建立利用酶标仪快速检测丹参白酒中水溶性酚酸总量的测定方法，可用于丹参白酒的质量控制，为当地丹参产业的发展提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 酒曲
酒曲（安琪小曲）、复合功能菌（金装，主要的微生物为酿酒酵母、根霉和酯化红曲霉等）：安琪酵母股份有限公司。
1.1.2 原料
丹参：济宁学院酿酒工程实验室种植于济宁学院试验田，收获后干燥并粉碎成小于200目的颗粒；鱼台大米（津稻263）：济宁鱼台县乡情谷物种植专业合作社。
1.1.3 试剂
原儿茶醛标准品（纯度≥98.0%）：江苏永健医药科技有限公司；冰醋酸、十二烷基硫酸钠、无水乙醇、铁氰化钾、三氯化铁（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
Infinite M200 Pro型多功能酶标仪：瑞士TECAN公司；BSA224S电子天平：德国赛多利斯公司；5804R型离心机、20 μL～200 μL、100 μL～1 000 μL 单道可调微量移液器：德国Eppendorf公司；MQD-S3NR振荡培养箱：上海旻泉仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 鱼台大米白酒酿造
鱼台大米白酒的酿造采用半固态发酵工艺，酿造过程如图1所示。
图1 鱼台大米白酒酿造流程
Fig.1 The workflow of Yutai rice Baijiu production
按大米浸泡前的初始质量加入0.4%安琪小曲和0.1%复合功能菌。发酵7 d～8 d后进行蒸馏，分段蒸馏收集酒头、基酒和酒尾，采用气相色谱以乙酸正戊酯为内标物对其中酯类等物质的含量进行测定。
1.3.2 酚酸含量测定
在黄喜茹等[20]建立的酚酸含量测定方法基础上，针对酶标仪的特点进行优化。准确称量干燥至恒重的原儿茶醛标准品1.00 mg，用50%乙醇溶液溶解后配制成浓度为10 μg/mL的标准溶液，并按照表1稀释成不同浓度梯度，每个浓度梯度做3个平行。
表1 配制不同浓度的原儿茶醛溶液
Table 1 Preparation of protocatechualdehyde solutions with different concentrations
编号 1 0 μ g/m L 标准原儿茶醛溶液/μ L蒸馏水/μ L浓度/（μ g/m L）0 0 2 0 0 0 1 4 0 1 6 0 2 2 8 0 1 2 0 4 3 1 2 0 8 0 6 4 1 6 0 4 0 8 5 2 0 0 0 1 0
分别精密吸取不同浓度梯度的原儿茶醛溶液200 μL，加入 0.01 mol/L 十二烷基硫酸钠溶液 80 μL，铁氰化钾-三氯化铁显色剂（0.55 mol/L的铁氰化钾溶液与0.55 mol/L的三氯化铁溶液按体积比1∶1混合）40 μL，摇匀后于暗处静置5 min，用1 mol/L的冰醋酸稀释至1 mL（加入680 μL），摇匀后于暗处静置30 min。向每个酶标孔精确加入200 μL反应溶液，在波长为720 nm处测定吸光度。以原儿茶醛浓度为横坐标，720nm波长下测定的OD值为纵坐标，绘制标准曲线见图2，得到回归方程为y=0.052 3x+0.266 1（R2=0.997 4）。
图2 标准曲线
Fig.2 Standard curve
1.3.3 鱼台大米白酒提取丹参水溶性酚酸工艺参数单因素优化试验
分别用不同酒精度的鱼台大米白酒，设置不同的提取温度和料液比，考察酒精度、提取温度和料液比对丹参中水溶性酚酸提取效果的影响，提取时间为72 h，反应液中水溶性酚酸浓度的测定参考方法1.3.2，含量以原儿茶醛计。以料液比为1∶100（g/mL）、酒精度50%vol、提取温度30℃和提取时间72 h条件下从丹参中提取出来的水溶性酚酸的量为基准，按照下列公式计算不同条件下鱼台大米白酒对丹参中水溶性酚酸的提取率。
式中：V1为鱼台大米白酒体积，mL；C1为提取液中水溶性酚酸浓度，μg/mL；m1为原料丹参质量，g；C2为料液比为1∶100（g/mL）时提取液中水溶性酚酸浓度，μg/mL。
1.3.4 鱼台大米白酒提取丹参水溶性酚酸工艺参数响应面优化试验
按照Box-Behnken的试验设计原理，以丹参水溶性酚酸提取率（Y）为响应值，选择提取温度（A）、鱼台大米白酒的酒精度（B）以及料液比（C）为影响因素，进行三因素三水平响应面试验，因素与水平见表2。
表2 Box-Behnken试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments
水平A提取温度/℃B酒精度/%v o l C料液比/（g/m L）-1 3 5 5 0 1∶8 0 4 0 5 5 1∶9 1 4 5 6 0 1∶1 0
1.4 数据处理
每组试验均设置3个平行，并使用Excel 2010软件计算平均值和标准差，使用Design-Expert V8.0.6软件设计响应面试验方案并进行统计分析，采用Origin 2015软件绘图，图中误差线表示标准差的大小。
2 结果与分析
2.1 鱼台大米基酒生产工艺
采用乙酸正戊酯内标法对分段摘取的酒头、基酒及酒尾进行检测，结果见表3。
表3 鱼台大米白酒分析结果
Table 3 Detection results of Yutai rice Baijiu
品名己酸乙酯酒头 621 1 006 1453 2 7 0基酒 99 283 87 0 24 0酒尾 55 130 39 0 37 0含量/（μg/mL）乙醛 甲醇 乙酸乙酯丁酸乙酯乳酸乙酯
使用安琪小曲和复合功能菌共同培菌发酵工艺生产的基酒中乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量为87 μg/mL和24 μg/mL，与单用安琪小曲培菌发酵工艺相比分别提高了110.7%和18.8%。
2.2 丹参水溶性酚酸浸提条件优化单因素试验
丹参在生长过程中合成的酚酸主要是以酯键与细胞壁多糖结合的不溶性酚酸，对其干燥能够转化成游离酚酸[21-22]。因此为了保证较高的提取率，将丹参原料在使用前进行干燥脱水并粉碎是必备操作。
2.2.1 酒精度对丹参水溶性酚酸提取率的影响
考察酒精度对丹参水溶性酚酸提取率的影响，结果如图3所示。
图3 酒精度对丹参水溶性酚酸提取率的影响
Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction yields of soluble phenolic acids
由图3可知，在40%vol～55%vol，提取率随酒精度的增加而逐步提高，当酒精度为60%vol时提取率比55%vol略有下降，因此选择酒精度为55%vol的鱼台大米白酒提取丹参中的水溶性酚酸。
2.2.2 提取温度对丹参水溶性酚酸提取率的影响
在30℃～50℃范围内，每间隔5℃设置梯度，考察提取温度对丹参水溶性酚酸提取率的影响，结果见图4。
图4 提取温度对丹参水溶性酚酸提取率的影响
Fig.4 Effect of extract temperature on the extraction yields of soluble phenolic acids
由图4可知，随着提取温度提升，鱼台大米白酒对丹参中水溶性酚酸的提取率呈增加趋势。但当提取温度提升到40℃以上时，提取率增加的趋势较为平缓。考虑到提取温度越高，酒精的挥发性越强，并且酚酸类物质易被氧化[23-24]，因此选择较低的提取温度比较合适，确定提取温度为40℃。
2.2.3 料液比对丹参水溶性酚酸提取率的影响
按照丹参与鱼台大米白酒的比例分别为1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10（g/mL）进行浸提试验，结果如图5所示。
图5 料液比对丹参水溶性酚酸提取率的影响
Fig.5 Effect of liquid to raw material on the extraction yields of soluble phenolic acids
当溶剂量较低时，浸提液中水溶性酚酸的浓度较高，而当溶剂量较高时，可以达到比较高的提取率。同时考虑水溶性酚酸浓度和提取率这两个指标，料液比选择1∶9（g/mL）比较合适，此时水溶性酚酸浓度为2 103.35 μg/mL，提取率 79.06%。
2.3 丹参水溶性酚酸浸提条件响应面优化试验
2.3.1 响应面试验结果与分析
利用Box-Behnken响应面优化法进一步提高鱼台大米白酒对丹参水溶性酚酸的提取率[25]。根据单因素试验的结果，以提取温度、鱼台大米酒精度和料液比作为响应面试验的优化因素，试验设计方案以及提取率的测定结果见表4。
表4 响应面试验设计与测定结果
Table 4 Design and results of response surface experiments and assay results
序号 A提取温度/℃B酒精度/%vol C料液比/（g/mL） Y提取率/%35 50 1∶9 77.38 2 45 50 1∶9 77.62 3 35 60 1∶9 76.17 4 45 60 1∶9 77.99 5 35 55 1∶8 70.69 6 45 55 1∶8 72.94 7 35 55 1∶10 77.34 8 45 55 1∶10 78.87 9 40 50 1∶8 72.15 10 40 60 1∶8 70.62 11 40 50 1∶10 77.21 12 40 60 1∶10 79.02 13 40 55 1∶9 77.31 14 40 55 1∶9 77.19 15 40 55 1∶9 77.43 1
对表4数据进行拟合，得到提取率（Y）对提取温度（A）、酒精度（B）、料液比（C）的三元二次回归方程为Y=-60.2-0.682A-1.614B+39.64C+0.003 53A2-0.004 87B2-2.452C2+0.015 80AB-0.036 0AC+0.167 0BC。对试验结果进行方差分析，结果如表5所示。
表5 响应面模型方差分析
Table 5 ANOVA for response surface quadratic model
来源 自由度 平方和 均方 F值 P值 显著性模型 9 115.092 12.788 0 90.87 0.000 **A 1 4.263 4.263 2 30.29 0.003 **B 1 0.039 0.039 2 0.28 0.620 C 1 84.760 84.760 2 602.28 0.000 **A2 1 0.029 0.028 8 0.20 0.670 B2 1 0.055 0.054 7 0.39 0.560 C2 1 22.193 22.193 2 157.70 0.000 **AB 1 0.624 0.624 1 4.43 0.089 AC 1 0.130 0.129 6 0.92 0.381
续表5 响应面模型方差分析
Continue table 5 ANOVA for response surface quadratic model
注：**为差异极显著，P<0.01。
来源 自由度 平方和 均方 F值 P值 显著性BC 1 2.789 2.788 9 19.82 0.007 **误差 5 0.704 0.140 7失拟 3 0.623 0.207 8 5.18 0.166纯误差 2 0.080 0.040 1合计 14 115.795
经计算，该拟合方程的决定系数和校正决定系数分别为0.993 9和0.983 0，并且失拟项P值为0.166＞0.05（不显著），说明这个模型对数据拟合非常好，可以准确反映提取率与提取温度、酒精度和料液比之间的关系。根据得到的三元二次回归方程绘制响应面分析图，以确认提取温度、酒精度和料液比对提取率的影响，响应面曲面图和等高线图见图6。
图6 各因素交互作用对丹参水溶性酚酸提取率的影响
Fig.6 Effect of multi-factors interaction on the extraction yields of soluble phenolic acids
由表5和图6可知，提取温度、料液比、酒精度与料液比的交互项、料液比的二次项为极显著影响因素（P<0.01），其他因素影响较小。
2.3.2 最优条件验证试验
根据响应面试验的结果，通过对拟合方程的分析来寻求最优工艺参数。以丹参水溶性酚酸的提取率为评价指标，得到最佳的提取工艺为提取温度45℃，酒精度 60%vol，料液比为 1∶9.8（g/mL）。在此工艺下，丹参水溶性酚酸提取率的理论值为79.90%。按照最优的提取条件，利用鱼台大米白酒提取丹参中的水溶性酚酸，重复进行3次试验，提取率与水溶性酚酸浓度分别为（79.94±0.33）%和（1 953.05±8.06）μg/mL。
3 结论
本研究利用鱼台大米白酒浸提丹参中的水溶性酚酸等药效活性成分。经单因素试验和响应面优化之后，最优的提取条件为提取温度45℃，酒精度60%vol，料液比为1∶9.8（g/mL），此时鱼台大米白酒中水溶性酚酸含量为（1 953.05±8.06）μg/mL，丹参中水溶性酚酸的提取率能够达到（79.94±0.33）%。下一步，将继续利用鱼台大米白酒浸提济宁当地特产中药材中的活性成分，并与鱼台大米丹参白酒配伍生产具有保健效果的养生酒。
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