小麦是世界范围内主要的粮食作物，小麦蛋白（wheat protein，WP）是小麦粉中最主要的副产物，蛋白质含量高达72%～85%，主要由醇溶蛋白和麦谷蛋白两种蛋白组成[1]。小麦蛋白水解物（wheat protein hydrolysate，WPH）及其肽具有抗氧化、抑菌、免疫调节和促进肠道健康等生理活性[2-5]。锌是人机体生长发育的必不可少的微量元素之一，是超过300种酶的催化活化中心的重要组成部分，可以调控细胞信号的传导过程，对人体的代谢、生长发育的催化具有重要作用[6-7]。许多发展中国家的儿童和孕妇存在锌缺乏症，高效、安全地补锌已经成为全球急需解决的公共营养问题[8]。由于锌离子可以和多肽、蛋白质形成稳定的配合物，因此锌与蛋白或者肽形成的螯合物与无机锌和有机酸锌相比更容易被人体吸收利用[9-10]。
本文以WP为原料，经超声协同酶解得到WPH，采用响应面试验优化WPH螯合锌的工艺技术参数，利用紫外光谱法和傅里叶-红外光谱法对其结构特征进行初步分析，最后考察螯合前后的基本理化性质。缺锌会直接影响人体健康，开发具有营养和补锌等多重功能的锌补充剂，具有良好的市场发展前景，同时对农副产品的高值化利用也具有重要的意义。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
谷朊粉（WP含量为83.5%）：河南瑞祥生物科技开发有限公司；碱性蛋白酶（200 U/mg）：上海源叶生物有限公司；二甲酚橙、七水合硫酸锌、盐酸、六次亚甲基四胺、干酪素：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；氢氧化钠、硫酸铜、酒石酸钾钠：洛阳昊华化学试剂有限公司；十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）：天津市科密欧化学试剂有限公司，以上试剂均为分析纯。
TG16-WS台式离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；FT-IR5500傅里叶变换红外光谱仪：江苏天瑞仪器股份有限公司；UV752N紫外分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；FSH-2A均质机：新飞电器有限公司；FA224电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；3S三频超声波反应器：昆山市超声仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 小麦蛋白酶解及螯合工艺流程
谷朊粉→调浆 [料液比1∶10（g/mL）]→超声处理（40 Hz、30 min）→酶解处理（加酶量 9 000 U/g、温度55℃、pH8.0、时间2.5 h）→灭酶→冷却→离心→取上清→干燥（WP）→WP+ZnSO4+蒸馏水→螯合反应→冷却→离心→取上清→醇沉→离心→沉淀物→干燥（WPH-Zn）
1.2.2 WPH-Zn制备工艺条件优化
参考李晨等[9]、吴家劲等[7]的研究方法，分别研究锌与蛋白质量比、螯合时间、螯合温度3个因素对锌螯合率的影响，在此基础上，以锌螯合率为指标，对锌与蛋白质量比、螯合时间、螯合温度进行响应面优化，利用Design-Expert设计软件设计三因素三水平响应面分析试验，试验因素及水平如表1所示。
表1 响应面分析因素与水平
Table 1 Levels and factors of response surface design
水平 因素A锌与蛋白质量比 B螯合时间/min C螯合温度/℃-1 1∶1 50 50 0 3∶2 60 60 1 2∶1 70 70
1.2.3 锌含量的测定
采用EDTA络合滴定法测定WPH-Zn中的锌含量[11]。
1.2.4 WPH-Zn结构表征
1.2.4.1 紫外光谱分析
配制WPH和WPH-Zn溶液，在190 nm～800 nm波长范围内扫描得到紫外可见光谱图，对比螯合前后光谱特征，初步判定蛋白/肽与锌离子是否发生了螯合反应[12]。
1.2.4.2 红外光谱分析
取干燥后的WPH与WPH-Zn，分别与KBr混合均匀并制成透明薄片，在4 000 cm-1～500 cm-1范围内扫描得到红外光谱图[13]。比对螯合前后红外光谱图谱，初步推断锌与蛋白/肽的螯合位点。
1.2.5 WPH-Zn与WPH的理化性质分析
1.2.5.1 起泡性与泡沫稳定性的测定
参考丁小强[14]的方法，略作修改。取20 mL不同pH值（2、4、6、8、10）的 WPH-Zn 与 WPH 溶液（10 mg/mL），10 000 r/min条件下剪切1 min，然后测量生成的泡沫体积记为V0，静置10 min后记泡沫体积为V10。起泡性与泡沫稳定性计算公式如下。
1.2.5.2 乳化性与乳化稳定性的测定
参考马敬[15]的方法，略作修改。取不同pH值（2、4、6、8、10）的 WPH-Zn 与 WPH 溶液（10 mg/mL）各 12 mL，按照体积比3∶1的比例加入4 mL大豆油，10 000 r/min均质2 min，然后在0、30 min时，取底部50 μL乳化液，加入5 mL的0.1%十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液，振荡使其均匀混合，在波长为500 nm下测定紫外吸光度，0 min时的吸光度记为A0，30 min 时的吸光度记为 A30，T 为 2.303，φ 为乳化液中油相的体积分数0.25，C为未形成乳化液的样品浓度（mg/mL），N为稀释倍数。乳化性与乳化稳定性计算公式如下。
1.2.5.3 溶解性的测定
配制不同 pH 值条件下（pH 值分别为 2、4、6、8、10）的WPH-Zn与WPH溶液（10 mg/mL），然后6 000 r/min离心15 min，测定上清液中蛋白含量，计算WPH-Zn与WPH在不同pH值条件下的溶解性[16]。计算公式如下。
式中：Wa为上清液中的蛋白质含量，g；Wb为样品中总的蛋白质含量，g。
1.3 数据处理
采用SPSS 21.0软件进行数据分析，试验计量数据采用平均值±标准差表示，通过单因素和双因素方差分析进行比较，差异显著水平为0.05。
2 结果与讨论
2.1 WPH-Zn制备工艺条件研究
2.1.1 响应面试验结果
在单因素试验基础上，对WPH-Zn制备工艺条件进行优化，响应面试验设计结果见表2。回归模型方差分析见表3。
表2 响应面试验结果
Table 2 Results of response surface experiments
编号 螯合率/%A锌与蛋白质量比B螯合时间/min C螯合温度/℃1 3∶2 60 60 63.5 2 3∶2 50 70 54.2 3 3∶2 60 60 66.7 4 1∶1 60 50 49.2 5 1∶1 50 60 47.6 6 3∶2 70 50 51.7 7 3∶2 60 60 64.6 8 2∶1 50 60 49.3
续表2 响应面试验结果
Continue table 2 Results of response surface experiments
编号 螯合率/%9 3∶2 60 60 64.0 10 2∶1 60 70 61.4 11 3∶2 60 60 67.7 12 3∶2 50 50 40.0 13 1∶1 60 70 60.5 14 1∶1 70 60 53.8 15 3∶2 70 70 60.0 16 2∶1 60 50 62.8 17 2∶1 70 60 60.0 A锌与蛋白质量比B螯合时间/min C螯合温度/℃
表3 回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance in response surface test
注：**表示差异极显著（P＜0.01）；*表示差异显著（P＜0.05）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 942.26 9 104.7 19.05 0.000 4 **A 62.72 1 62.72 11.41 0.011 8 *B 147.92 1 147.92 26.91 0.001 3 **C 131.22 1 131.22 23.87 0.001 8 **AB 5.06 1 5.06 0.9211 0.369 2 AC 40.32 1 40.32 7.34 0.030 3 *BC 8.7 1 8.7 1.58 0.248 6 A2 33.31 1 33.31 6.06 0.043 4 *B2 405.41 1 405.41 73.76 ＜0.000 1 **C2 67.79 1 67.79 12.33 0.009 8 **残差 38.47 7 5.5失拟项 25.33 3 8.44 2.57 0.191 9纯误差 13.14 4 3.29总差 980.74 16 104.7
对试验结果进行二次回归分析，计算得到回归方程：螯合率/%=65.30+2.80A+4.30B+4.05C+1.12AB-3.17AC-1.48BC-2.81A2-9.81B2-4.01C2。由表3可以看出该模型的P＜0.000 1，表示该模型极显著，且失拟项=0.191 9＞0.05不显著，说明该模型的拟合水平好，该模型可以被用于WPH-Zn制备工艺条件的优化。
2.1.2 响应面试验的交互因素分析
响应面试验的交互因素分析见图1。
图1 各因素交互作用图
Fig.1 Contour plots of response surface analysis
由图1可知，所有响应面交互图呈凸起状，这说明锌与蛋白质量比、螯合时间和螯合温度之间的交互性都对锌螯合率有明显的影响。方差分析结果显示锌与蛋白质量比对锌螯合率影响显著（P＜0.05），螯合时间和螯合温度对锌螯合率影响极显著（P＜0.01）。交互作用分析表明，A锌与蛋白质量比与C螯合温度交互作用显著（P＜0.05），AB及BC 的交互作用不显著（P＞0.05）。
2.1.3 模型的优化及验证试验
通过Design-Expert软件对试验进行优化，按照回归模型预测可得到最佳螯合工艺条件为锌与蛋白质量比1.68∶1、螯合温度63.2℃、螯合时间62.1 min，在此条件下锌螯合率可达到66.92%。结合实际操作，工艺参数调整为锌与蛋白质量比1.7∶1、螯合温度65℃、螯合时间60 min，在此条件下，经3组平行试验得到锌螯合率为66.88%，与预测结果无显著性差异（P＞0.05），说明回归模型可靠。
2.2 光谱分析
2.2.1 紫外可见光谱分析
在波长为190 nm～800 nm条件下对WPH和WPHZn配制的水溶液进行紫外扫描，结果见图2。
图2 WPH与WPH-Zn的紫外可见光谱吸收图
Fig.2 Ultraviolet visible spectra of WPH and WPH-Zn
由图2可知，WPH与Zn2+螯合后，193 nm处吸收峰移至197 nm，这可能是因为Zn2+与N、O键配对后改变了肽键上羰基的π→π*跃迁；256 nm处吸收峰移至282 nm处，这可能是与Zn2+螯合后改变了N-C-O配体的π→π*跃迁所致[17-19]。
2.2.2 红外光谱分析
WPH与WPH-Zn在波长4 000 cm-1～500 cm-1的红外光谱见图3。
图3 WPH与WPH-Zn的红外光谱吸收图
Fig.3 Infrared spectra of WPHandWPH-Zn
由图3可知，与WPH相比WPH-Zn红外光谱主要变化有3 350 cm-1处吸收峰红移至3 320 cm-1处，此处吸收峰是由NH对称伸缩振动引起，说明WPH中的氨基参与了Zn2+的配对；2 930 cm-1处吸收峰红移至2 920 cm-1处，此处吸收峰是由CH2的非对称性伸缩振动引起，说明CH2上的氢离子有可能被锌离子取代；1 430 cm-1处吸收峰出现明显增强，而此处吸收峰是由酰胺键的C-N伸缩振动和N-H变形振动以及CH2基团的非平面摇摆振动引起，说明上述活性基团有可能均参与了螯合反应。以上分析说明Zn2+可能与肽链上的NH和CH2等基团发生了配对反应[20]。
2.3 WPH与WPH-Zn理化性质分析
2.3.1 溶解性分析
溶解性结果见图4。
图4 不同pH值条件下WPH与WPH-Zn的溶解度
Fig.4 Solubility of WPH and WPH-Zn under different pH conditions
由图4可知，WPH和WPH-Zn在不同pH值条件下的溶解性趋势一致。随pH值的增大，均呈现先上升后稳定的趋势。pH值为2时，两者溶解性均较小，这可能与其等电点有关。pH 6～pH 10时，溶解度均接近100%。
2.3.2 起泡性与泡沫稳定性分析
起泡性与泡沫稳定性结果见图5和图6。
图5 不同pH值条件下WPH与WPH-Zn的起泡性
Fig.5 Foaming capacity of WPH and WPH-Zn under different pH conditions
图6 不同pH值条件下WPH与WPH-Zn的泡沫稳定性
Fig.6 Foaming stability of WPH and WPH-Zn under different pH conditions
由图5可知，在pH4～10范围内，WPH与WPHZn起泡性较好，pH值为2时，两者的起泡性均较差。这主要是因为小麦蛋白经酶解后，大分子蛋白降解为小分子蛋白、肽与氨基酸，黏度及表面张力降低，因此起泡性较好，而在pH值为2时，其溶解度降低，起泡性也随之降低。
由图6可知，WPH与WPH-Zn的泡沫稳定性随pH值的增大，均先降低后升高。这是由于反应体系在碱性条件下，蛋白质或者肽的构象发生了变化，大量的疏水基团暴露在表面，WPH与WPH-Zn的泡沫稳定性也随之逐渐增大[21]。
2.3.3 乳化性与乳化稳定性分析
由乳化性和乳化稳定性可以分析蛋白在油-水两相界面的吸附能力，乳化性越好则吸附能力越强，乳化稳定性越好，说明蛋白抗拒外界条件的应变能力越强[22]。乳化稳定性与乳化性见图7和图8。
图7 不同pH值条件下WPH与WPH-Zn的乳化稳定性
Fig.7 Emulsion stability of WPH and WPH-Zn under different pH conditions
图8 不同pH值条件下WPH与WPH-Zn的乳化性
Fig.8 Emulsifyingactivity of WPH and WPH-Zn under different pH conditions
由图7和图8可知，在pH2～10范围内，WPH与WPH-Zn的乳化性均呈现先下降后升高的趋势。这可能是在高pH值条件下，WPH与WPH-Zn疏水性残基暴露和溶解度提高，致使其具有较好的乳化性。WPH与WPH-Zn的乳化稳定性随pH值的升高也呈现先下降后上升的趋势，在pH值为6时达到最小值，碱性条件下，两者的乳化稳定性较好。这可能是因为碱性条件下WPH与WPH-Zn亲油基团暴露较多，界面膜较稳定且黏度较大，形成致密的网络结构后使其乳化稳定性提高[23]。
3 结论
富锌小麦蛋白水解物的最佳螯合工艺条件为锌与蛋白质量比1.7∶1、螯合温度65℃、螯合时间60 min，在该螯合工艺条件下，螯合率可达66.88%。光谱分析结果表明小麦蛋白水解物与锌螯合前后吸收峰的位置发生了一定的变化，原因是Zn2+可能与肽链上的NH和CH2等基团发生了配对反应。理化性质研究结果表明：WPH和WPH-Zn在不同pH值条件下的溶解性趋势一致，随pH值的增大，均呈现先上升后稳定的趋势，在pH值为2时，两者溶解性均较小，在pH6～10范围内，溶解度均接近100%；在pH值为2时，两者的起泡性均较差，在pH4～10范围内，WPH与WPH-Zn起泡性较好，与酸性条件相比，WPH与WPH-Zn在碱性条件下的泡沫稳定性相对较好；在pH2～10范围内，WPH与WPH-Zn的乳化性均呈现先下降后升高的趋势，WPH与WPH-Zn的乳化稳定性随pH值的升高也呈现先下降后上升的趋势，在pH值为6时达到最小值，碱性条件下，两者的乳化稳定性较好。研究结果表明：小麦蛋白水解物与锌螯合效果较好，螯合前后理化性质相差不大，可以作为一种潜在的新型锌补充剂用于补锌的功能食品中。
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