牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）是芍药科、芍药属植物，别名鼠姑、鹿韭、木芍药，为多年生落叶灌木。它的种植地主要集中于我国菏泽、洛阳、铜陵等[1]。牡丹除了具有观赏价值外，其花、籽和根还具有重要的食用和药用价值[2]。2011年我国将牡丹籽油列为新资源食品，但是牡丹籽榨油后产生的大量牡丹籽粕通常被随意堆放、丢弃或用作肥料、动物饲料等，综合利用率极低。因此，针对牡丹籽粕进行综合开发利用具有重要的市场应用价值。现代研究表明，牡丹籽粕中含有大量多糖，具有抗肿瘤、抗氧化和抗菌等作用[3-5]。但目前关于从牡丹籽粕中提取多糖的工艺研究较少，限制了其进一步的开发应用。
目前多糖的提取方法主要有超声辅助热水提取法[6]、生物酶提取法[7]、热水浸提[8]、生物发酵提取法[9]等。其中超声辅助热水浸提法具有操作简单、对设备要求较低、提取耗时短、不会有试剂残留造成多糖损耗等特点[10]。因此，本研究以牡丹籽粕为原料，采用超声辅助热水浸提的方法提取牡丹籽多糖，通过响应面分析技术确定牡丹籽粕中多糖的最佳提取工艺，并通过苯酚-硫酸法测定多糖的含量，同时通过DPPH自由基和ABTS+自由基的清除试验评价牡丹籽多糖的抗氧化活性。以此为提高牡丹籽多糖的开发利用提供技术支撑，并为牡丹籽多糖的生物活性研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牡丹籽粕：华瑞科技有限公司；2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 [2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：上海源叶生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡萄糖：天津市科密欧化学试剂有限公司，以上试剂均为优级纯。石油醚、无水乙醇：天津市富宇精细化工有限公司；无水乙醚、硫酸、三氯甲烷：烟台远东精细化工有限公司；丙酮、苯酚、VC：国药集团化学试剂有限公司；正丁醇：西陇科学股份有限公司，以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
湘仪离心机（H2050R）：湘仪离心机仪器有限公司；数显恒温水浴锅（DP6）：北京亚欧德鹏科技有限公司；酶标仪（INFINITE 200 PRO）：勒菲生物科技（上海）有限公司；循环水式多用真空泵（SHZ-D111）：巩义市英裕高科仪器厂；数控超声波清洗器（12-1533）：宁波新芝生物科技有限公司；冷却水循环装置（CCA-1112A）、旋转蒸发装置（RV 8 S096）：上海爱朗仪器有限公司；双光束紫外可见光光度计（TU-1901）：北京普析通用仪器有限责任公司。
1.3 牡丹籽多糖的制备方法
1.3.1 脱脂处理
参照王守现等[11]脱脂的方法。将牡丹籽粕研磨成粉，称取牡丹籽粕粉末7 g用滤纸包好，石油醚为脱脂液，60℃下索氏回流脱脂6 h，然后将石油醚挥发完全后烘干待用。
1.3.2 粗多糖的提取
称取脱脂后的牡丹籽粕粉末2.0 g，按 1∶30（g/mL）的料液比加入蒸馏水充分混匀，超声30 min，然后在70℃下水浴2 h，最后在8 000 r/min下离心15 min。滤液用旋转蒸发装置浓缩至原体积的三分之一。
1.3.3 脱蛋白处理
利用Sevag法脱蛋白，将三氯甲烷和正丁醇按体积比5∶1混匀，与粗多糖溶液按体积比1∶5充分混合均匀，然后在8 000 r/min下离心15 min，取上清液，重复上述操作5次。上清液用4倍体积的95%乙醇在4℃醇沉24 h，然后离心取沉淀，用无水乙醇、丙酮、无水乙醚依次洗涤沉淀，在60℃下烘干，磨粉待用。
1.4 标准曲线的绘制
以葡萄糖为对照品，参照苯酚-硫酸显色法[12]。精密称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖10.00 mg，置100 mL容量瓶中，配成0.1 mg/mL葡萄糖标准溶液。精密吸取配好的葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，分别置于10 mL玻璃试管中，加蒸馏水补至2 mL，然后分别加入1.0 mL6%苯酚和5 mL浓硫酸，混合均匀，沸水浴20 min，最后冷却至22℃～25℃。用蒸馏水做空白对照，在490 nm波长处测吸光度。
1.5 多糖含量的测定
称量提取的粗多糖10.00 mg，加入蒸馏水定容至100 mL，吸取配好的样品溶液2 mL至试管中，按1.4的方法进行处理，在490 nm处测定溶液的吸光度，通过标准曲线方程计算多糖的含量。计算公式如下。
式中：C为供试品溶液的葡萄糖浓度，mg/mL；D为供试品溶液的稀释倍数；F为换算因子；W为供试品质量，mg。
1.6 换算因子的测定
用葡萄糖作标准曲线计算多糖含量存在系统误差，所以采用测定换算因子的方法来消除以葡萄糖作标准曲线引起的误差，使测定结果更加接近真实值[13]。
精密吸取配好的牡丹籽多糖溶液1 mL于玻璃试管中，加入蒸馏水使其浓度变为0.05 mg/mL。精密吸取稀释的多糖溶液0.2 mL，加蒸馏水补至2.0 mL，按1.4的方法在490 nm下测定多糖溶液的吸光度，代入标准曲线中求出葡萄糖浓度。换算因子的计算公式如下。
式中：W为多糖的质量，mg；C为多糖中测量出的葡萄糖浓度，mg/mL；D为多糖的稀释倍数。
1.7 体外抗氧化活性的测定
1.7.1 DPPH自由基清除能力的测定
根据谢建华[14]的方法，称取10.00 mg的DPPH用无水乙醇溶解定容至100 mL容量瓶中。取0.5 mL不同浓度的多糖溶液（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL）于试管中，加入2.0 mL DPPH溶液，然后再加入1.5 mL蒸馏水充分混匀，在22℃～25℃下避光放置30 min，以等体积的无水乙醇和蒸馏水做空白，抗坏血酸（VC）作为阳性对照，平行测定3次，在517 nm处测定吸光度。DPPH自由基清除率的计算公式如下。
式中：A0为2 mLDPPH溶液＋2 mL蒸馏水的吸光度；A1为2 mLDPPH溶液＋0.5 mL多糖样品溶液＋1.5 mL蒸馏水的吸光度；A2为2 mL乙醇＋0.5 mL多糖样品溶液＋1.5 mL蒸馏水的吸光度。
1.7.2 ABTS+自由基清除能力的测定
按照徐韧博[15]的方法，配制ABTS+储存液：称取0.038 4 g ABTS用蒸馏水定容至10 mL；称取0.013 4 g过硫酸钾用蒸馏水定容至10 mL。将二者按体积比1∶1混合，避光储存12 h后制得ABTS+储存液。使用时用水稀释ABTS+储存液至吸光度为0.7±0.02（734 nm），即可进行自由基清除能力的测定。吸取0.2 mL不同浓度的多糖溶液（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL）于试管中，加入3.8 mL ABTS+储存液混合均匀，静置6 min，以蒸馏水做空白，抗坏血酸（VC）作为阳性对照，平行测定3次，在734 nm处测定吸光度。ABTS+自由基的清除率的计算公式如下。
式中：A0为0.2 mL蒸馏水＋3.8 mL ABTS+储存液的吸光度；A1为0.2 mL多糖溶液＋8 mL ABTS+储存液的吸光度；A2为0.2 mL多糖溶液＋3.8 mL蒸馏水的吸光度。
1.8 多糖提取工艺的优化
1.8.1 单因素试验
1.8.1.1 料液比对多糖得率的影响
称取脱脂后的牡丹籽多糖2.0 g，料液比选择1∶30、
式中：m为提取后牡丹籽粕多糖的质量，g；M为提取前牡丹籽粕的质量，g。
1.8.1.2 水浴温度对多糖得率的影响
称取脱脂后的牡丹籽多糖2.0 g，按料液比为1∶30（g/mL）充分混匀，超声 30 min，水浴温度选择 50、60、70、80、90℃水浴2 h，按1.3多糖的制备方法进行处理，平行提取3次，获取的沉淀在60℃下烘干，冷却至22℃～25℃后精确称量，按照多糖得率的计算公式计算。
1.8.1.3 超声时间对多糖得率的影响
称取脱脂后的牡丹籽多糖2.0 g，在料液比为1∶30（g/mL）、70℃水浴2h的条件下，超声时间选择30、40、50、60、70 min，按 1.3 多糖的制备方法进行处理，平行提取3次，获取的沉淀在60℃下烘干，冷却至22℃～25℃后精确称量，按照多糖得率的计算公式计算。
1.8.1.4 提取次数对多糖得率的影响
称取脱脂后的牡丹籽多糖2.0 g，在料液比为1∶30（g/mL）、超声 30min，70℃水浴 2h 下，提取次数选择 1、2、3、4、5，按 1.3 多糖的制备方法进行处理，平行提取3次，获取的沉淀在60℃下烘干，冷却至22℃～25℃后精确称量，按照多糖得率的计算公式计算。
1.8.2 响应面设计试验
在单因素试验的基础上，以水浴温度、超声时间、料液比为自变量，分别用 A、B、C 表示，以-1、0、1 分别表示自变量的低、中、高水平，多糖得率（Y）为响应值。设计三因素三水平的响应面试验方案，对牡丹籽多糖的提取进行优化。试验的因素与水平见表1。1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/mL），超声 30 min、70 ℃水浴 2 h，按1.3多糖的制备方法进行处理，平行提取3次，获取的沉淀在60℃下烘干，冷却至22℃～25℃后精确称量，按照如下公式计算多糖得率。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Response surface experimental factors and levels
水平 因素A水浴温度/℃B超声时间/m i n C料液比/（g/m L）-1 7 5 3 5 1∶5 5 0 8 0 4 0 1∶6 0 1 8 5 4 5 1∶6 5
1.9 数据分析
以上每个试验重复3次，结果以平均值±标准差表示。采用Origin 2019软件进行数据制图，应用SPSS 21软件进行单因素方差分析，利用Design-Expert软件进行响应面设计及结果分析。
2 结果与分析
2.1 牡丹籽粕中多糖含量的测定
通过苯酚-硫酸法测定牡丹籽粕中多糖含量，以标准葡萄糖浓度10 mg/mL～70 mg/mL为横坐标，吸光度为纵坐标，计算出葡萄糖标准曲线方程为y=9.277 5x+0.127 3，线性相关系数R2=0.997 1。经过标准曲线得出多糖的换算因子为 2.78，多糖含量为（44.48±1.26）%。对苯酚-硫酸法测定多糖含量进行方法学考察发现其精密试验的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为4.79%、稳定性试验的RSD为0.7%、重复性试验的RSD为1.06%，加样回收率试验为85.5%，RSD为1.91%，结果表明此法能准确用于牡丹籽多糖含量的测定。
2.2 超声时间对多糖提取效果的影响
超声时间对多糖得率的影响见图1。
图1 超声时间对多糖得率的影响
Fig.1 Influence of ultrasonic time on the yield of polysaccharide
不同字母表示多糖得率之间差异显著（P<0.05）。
如图1所示，多糖得率随着超声时间的延长先升高后降低。可能是因为超声处理使细胞裂解破碎，多糖分子溶解到溶剂中，多糖得率上升。当超声40 min时多糖得率达到最高，为（11.99±0.31）%。随着超声时间的继续延长，多糖得率逐渐下降，这可能是因为超声时间过长，超声波的强剪切作用破坏了多糖的结构，使其发生断裂从而影响了多糖得率[16]。所以40 min为最佳超声时间，选取附近的35、40、45 min进行响应面优化试验。
2.3 水浴温度对多糖提取效果的影响
水浴温度对多糖得率的影响见图2。
图2 水浴温度对多糖得率的影响
Fig.2 Effect of water bath temperature on the yield of polysaccharide
不同字母表示多糖得率之间差异显著（P<0.05）。
如图2所示，多糖得率随着水浴温度的增高先升高后降低。当水浴温度为80℃时多糖得率达到最大，为（7.32±0.18）%。可能是适宜的温度会加快多糖分子的运动，使其溶解到溶剂中，增大多糖得率。当温度超过80℃后多糖得率降低，这可能是高温使多糖糖苷键发生断裂[17]，降解多糖，从而降低多糖得率[18]。多糖提取的最佳水浴温度为80℃，所以选取75、80、85℃进行响应面优化试验。
2.4 料液比对多糖提取效果的影响
料液比对多糖得率的影响见图3。
图3 料液比对多糖得率的影响
Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of polysaccharide
不同字母表示多糖得率之间差异显著（P<0.05）。
如图3所示，多糖得率随着溶剂的增加先升高后降低。当料液比为1∶60（g/mL）时多糖得率最大，达到了（11.96±0.16）%。溶剂的增加可以有效促进水溶性多糖物质的溶出使多糖得率上升，但随着溶剂的继续增大，其他成分的溶出也相对增多，从而抑制多糖的溶出，再加上后续浓缩、沉淀等操作，会加大多糖损耗，导致多糖得率下降[19-20]。所以1∶60（g/mL）为最优料液比，选取最优料液比附近的 1∶55、1∶60、1∶65（g/mL）进行响应面优化试验。
2.5 提取次数对多糖提取效果的影响
提取次数对多糖得率的影响见图4。
图4 提取次数对多糖得率的影响
Fig.4 Influence of extraction times on the yield of polysaccharide
不同字母表示多糖得率之间差异显著（P<0.05）。
如图4所示，多糖得率在提取2次时达到最大，为（11.65±0.22）%。当提取次数多于2次时多糖得率差异不显著，继续增加提取次数会造成溶剂和能源的浪费，也不利于缩短工艺流程，而且从试验结果看提取次数对多糖得率的影响不大，所以响应优化因素不再考虑提取次数。
2.6 响应面试验结果
在单因素试验的基础上，以牡丹籽多糖得率为响应值，利用Box-Behnken中心组合试验设计，进行三因素三水平的响应面分析，结果如表2所示。
表2 牡丹籽多糖得率Box-Behnken试验设计与结果
Table 2 Box-Behnken experiment design and results of extraction rate of polysaccharide from peony seed
试验号7 5 3 5 1∶6 0 1 0.2 3 2 8 5 3 5 1:6 0 1 0.7 5 3 7 5 4 5 1∶6 0 1 0.7 6 4 8 5 4 5 1∶6 0 1 1.1 3 5 7 5 4 0 1∶5 5 1 0.6 5 6 8 5 4 0 1∶5 5 1 1.1 8 7 7 5 4 0 1∶6 5 1 0.4 0 8 8 5 4 0 1∶6 5 1 1.1 7 9 8 0 3 5 1∶5 5 1 0.9 9 1 0 8 0 4 5 1∶5 5 1 0.2 1 1 1 8 0 3 5 1∶6 5 1 0.4 6 1 2 8 0 4 5 1∶6 5 1 1.4 5 1 3 8 0 4 0 1∶6 0 1 0.9 9 1 4 8 0 4 0 1∶6 0 1 0.9 7 1 5 8 0 4 0 1∶6 0 1 1.1 9 1 6 8 0 4 0 1∶6 0 1 1.1 2 1 7 8 0 4 0 1∶6 0 1 1.1 0 C料液比/（g/m L）1 A水浴温度/℃B超声时间/m i n因素 Y多糖得率/%
根据表2结果，利用Design-Expert软件建立牡丹籽多糖得率（Y）对水浴温度（A）、超声时间（B）、料液比（C）的二次多项回归模型为Y=11.07+0.31A+0.13B+0.072C-0.084AB+0.13AC+0.44BC-0.1A2-0.21B2-0.082C2。
通过对方程进行方差分析确定各因素之间对多糖得率的影响，结果见表3。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression model
注：*代表差异显著（P＜0.05）；**代表差异高度显著（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均差 F值 P值 显著性模型 1.96 9 0.22 7.65 0.006 9 **A 0.17 1 0.17 5.94 0.044 9 *B 0.13 1 0.13 4.48 0.072 0 C 0.04 1 0.04 1.39 0.276 9 AB 0.017 1 0.017 0.59 0.466 6 AC 0.038 1 0.038 1.34 0.284 3 BC 0.78 1 0.78 27.56 0.001 2 **A2 0.01 1 0.01 0.36 0.567 2 B2 0.19 1 0.19 6.82 0.034 9 *C2 0.028 1 0.028 1.00 0.351 5失拟项 0.16 3 0.055 6.44 0.051 9残差 0.20 7 0.028净误差 0.034 4 8.53×10-3总离差 2.16 16
由表3可知，模型P＜0.01，高度显著；失拟项P＞0.05，不显著，说明模型拟合程度较好，可以用于牡丹籽多糖提取试验的理论预测。模型的一次项系数A对多糖得率的影响显著，B和C影响不显著；BC交互对多糖得率产生高度显著影响，AB、AC的影响不显著；二次项系数B2影响显著，A2、C2影响不显著。从各个因素的F值判断，水浴温度、超声时间、料液比对多糖得率影响次序为水浴温度＞超声时间＞料液比。各因素间的交互作用对牡丹籽多糖得率影响的响应面图和等高线图见图5～图7。
图5 水浴温度和超声时间对多糖得率影响的响应面图和等高线图
Fig.5 Response surface plot and contour plot of the effects of water bath temperature and ultrasonic time on the extraction yield of polysaccharide
图6 料液比和水浴温度对多糖得率影响的响应面图和等高线图
Fig.6 Response surface plot and contour plot of the effects of solid-liquid ratio and water bath temperature on the extraction yield of polysaccharide
图7 料液比和超声时间对多糖得率影响的响应面图和等高线图
Fig.7 Response surface plot and contour plot of the effects of solid-liquid ratio and ultrasonic time on the extraction yield of polysaccharide
响应曲面的倾斜程度代表两因素的交互作用对多糖得率的影响效果，倾斜度越高则说明该因素的交互作用对多糖得率的影响越显著；等高线越趋近于圆形说明二者交互作用对多糖得率影响不显著[21]。通过对比图5～图7各因素间对牡丹籽多糖得率影响的响应面图和等高线图发现，图7的等高线趋于椭圆形且曲面倾斜陡峭，说明超声时间和料液比的交互作用对多糖得率的影响显著，可以看出超声时间40 min，料液比1∶60（g/mL）左右多糖得率达到最大；图5和图6的等高线趋于圆形且曲面平缓，说明水浴温度和超声时间、料液比和水浴温度的交互作用对多糖得率的影响不显著，结果与表3的回归模型方差分析一致。通过响应面优化确定牡丹籽粕中多糖的最佳提取条件为料液比 1∶64.06（g/mL）、水浴温度 87.78 ℃、超声时间41.85min。因为温度升高、超声时间延长、溶剂量增大都会对多糖的结构产生影响，使多糖得率降低，所以选取超声时间 40 min、水浴温度 85 ℃、料液比 1∶60（g/mL）为最佳提取工艺，在此条件下测定的多糖含量为（44.48±1.26）%。
2.7 牡丹籽多糖的体外抗氧化活性分析
牡丹籽多糖对DPPH自由基和ABTS+自由基的清除效果见图8。
图8 牡丹籽多糖对DPPH自由基和ABTS+自由基的清除效果
Fig.8 DPPH and ABTS+free radical scavenging effects of peony seed polysaccharide
由图8可知，在0.5mg/mL～4mg/mL的浓度范围内，牡丹籽多糖对ABTS+自由基和DPPH自由基清除率随着多糖溶液浓度的增大而逐渐提高，当溶液浓度达到4mg/mL时，牡丹籽多糖对DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除率分别为（38.38±1.17）%和（40.39±1.22）%。有研究表明，大蒜多糖在5mg/mL时对DPPH自由基清除率仅达到20%左右[22]。通过对比说明牡丹籽多糖在一定范围内有较好的抗氧化活性。但与VC相比，抗氧化效果要弱一些，可能是牡丹籽粗多糖中的某种物质对DPPH自由基和ABTS+自由基的清除效果造成了影响。
3 结论
本试验以牡丹籽粕为原料，以水浴温度、超声时间、料液比和提取次数为单因素，采用超声辅助热水浸提法提取牡丹籽多糖，并通过响应面对牡丹籽多糖的提取工艺进行优化。结果表明，响应面法可以用于牡丹籽多糖提取工艺试验，拟合形成的二次多项回归模型显示各个因素对多糖得率影响次序为水浴温度＞超声时间＞料液比。在DPPH自由基和ABTS+自由基清除试验中，初步证明牡丹籽多糖具有一定的抗氧化性：在多糖浓度为4 mg/mL时，牡丹籽多糖对ABTS+自由基和DPPH自由基清除率分别为（40.39±1.22）%和（38.38±1.17）%。牡丹籽多糖提取工艺条件的优化及抗氧化活性的研究为多糖的进一步应用开发研究提供了技术支持和理论依据。
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