复合酶法制备杨梅汁工艺优化及品质分析

杨梅[Myrica rubra（Lour.）S.et Zucc.]是一种具有高经济价值和营养价值的杨梅科杨梅属亚热带常绿植物，在国内外均有种植[1]。杨梅富含酚酸和黄酮等物质，是一种对人体健康有益的水果[2]。杨梅汁液丰富、采收期短，不耐储存，每年至少30%以上的杨梅鲜果会腐烂变质，给果农造成了很大的经济损失。因此开展杨梅的深加工技术研究，降低资源浪费率并提高杨梅附加价值，具有深远的意义[3]。目前市场上常见的杨梅加工产品包括糖水杨梅罐头、果酱、果汁、果酒等[4]，其中杨梅汁因具有较高的营养价值和较好的口感、风味，在市场上备受青睐。

生物酶解法是果蔬汁制备过程中较常应用的技术手段，酶解不仅可以有效破坏植物细胞壁、更好地释放细胞内容物，提高果蔬出汁率，还有利于果蔬汁的澄清稳定和色泽改善。杨电增等[5]、刘义庆等[6]、BIAN等[7]研究发现，在多糖、番茄红素等生物活性物质的提取以及果蔬汁的制备方面，纤维素酶和果胶酶具有协同增效的作用。杨梅汁独特的香气和酸甜味，是其成为消费者优选的重要因素[8-9]。气相色谱质谱仪用于分析挥发性化合物的分子式和分子结构[10-11]，FANG等[12]研究发现，薄荷醇、石竹烯、4-松油醇、芳樟醇氧化物、芳樟醇和乙酸等化合物，构成杨梅果实独特的香气，但酶解后杨梅汁营养物质是否会发生变化，此类研究相对较少。

本研究采用纤维素酶和果胶酶酶解法制备杨梅汁，考察果胶酶与纤维素酶质量比、复合酶添加量、酶解温度和酶解时间对杨梅出汁率的影响，优化其制备工艺[13]，并研究复合酶酶解法对杨梅汁营养成分、色泽、功能成分、抗氧化活性以及挥发性成分的影响，为高品质杨梅汁的制备提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

成熟期荸荠杨梅：南京福晶农业科技有限公司；果胶酶（≥40 U/mg）、纤维素酶（≥50 U/mg）：上海蓝季生物公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、三吡啶基三嗪（tripyridine triazine，TPTZ）、苯酚、浓硫酸、福林酚、硝酸铝：南京化学股份有限公司；以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

MJ-PB40E253C多功能榨汁机：美的集团股份有限公司；D-8紫外可见光分光光度计：上海奥析科学仪器有限公司；WSC-S色差仪：上海仪电物理光学仪器公司；WGZ-800浊度计；上海昕瑞仪器仪表有限公司；TGL-16B台式离心机：上海安亭科学仪器厂；WZS手持折光仪：邢台钜都科技有限公司；PHS-25型pH计：上海科晓科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 杨梅汁的制备

将新鲜杨梅清洗、去核、打浆、称重，再加入一定量的果胶酶和纤维素酶，不同温度下酶解一定时间，在5000 r/min离心15min后取上清液，计算杨梅出汁率。

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 果胶酶与纤维素酶质量比对杨梅出汁率的影响

复合酶添加量0.40%、酶解温度50℃、酶解时间60 min条件下，考察果胶酶与纤维素酶质量比（4∶0、3 ∶1、2∶2、1 ∶3、0 ∶4）对杨梅出汁率的影响。

1.3.2.2 复合酶添加量对杨梅出汁率的影响

果胶酶与纤维素酶质量比3∶1、酶解温度50℃、酶解时间60 min条件下，考察复合酶添加量（0.25%、0.30%、0.35%、0.40%、0.45%、0.50%）对杨梅出汁率的影响。

1.3.2.3 酶解温度对杨梅出汁率的影响

果胶酶与纤维素酶质量比3∶1、复合酶添加量0.40%、酶解时间60 min条件下，考察不同酶解温度（25、35、45、55、65、75 ℃）对杨梅出汁率的影响。

1.3.2.4 酶解时间对杨梅出汁率的影响

以果胶酶和纤维素酶质量比为3∶1，复合酶添加量为 0.40%，酶解温度 45℃，考察酶解时间（0、30、60、90、120、150、180 min）对杨梅出汁率的影响。

1.3.3 响应面优化试验设计

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，因复合酶质量比对杨梅出汁率影响较小，选取复合酶添加量、酶解温度和酶解时间为因素，通过响应面分析，优化杨梅出汁率最优工艺参数。具体因素及水平如表1所示。

1.4 杨梅汁理化指标测定

采用苯酚硫酸法[14]测定总糖含量；采用福林酚法[15]测定总多酚含量；采用分光光度计法[16]测定总黄酮含量；采用pH试差法[17]测定花色苷含量；采用考马斯亮蓝法[17]测定蛋白质含量；采用pH计测定pH值；采用电位滴定法[14]测定总酸含量；采用手持折光仪测定可溶性固形物含量；采用浊度仪法测定浊度；采用色差仪测定L值、a值、b值，以及在420、520、620 nm处测定杨梅汁的吸光度，根据参考文献[18]计算色度（CD=A420+A520+A620）、色调（T=A420/A520）。

1.5 抗氧化活性分析

1.5.1 DPPH自由基清除率测定

根据参考文献[13]，取杨梅汁1mL于刻度试管，加入0.1 mmol/L DPPH溶液1 mL，摇匀后避光放置30 min，取上清液，测定517 nm波长处的吸光度。DPPH自由基清除率计算公式如下。

式中：A1为试验组吸光度；A2为对照组吸光度；A0为空白组吸光度。

1.5.2 羟基自由基清除率测定

根据参考文献[13]，取杨梅汁1 mL于刻度试管，再加入2 mg/mL FeSO4溶液、1.5 mg/mL水杨酸溶液、1% H2O2溶液各1 mL，37℃水浴下避光反应15 min，在526nm波长处测定吸光度，·OH清除率计算公式如下。

式中：A1为试验组吸光度；A2为对照组吸光度；A0为空白组吸光度。

1.5.3 总抗氧化能力测定

采用FANG等[15]的方法，配制0.1 mol/mL乙酸盐缓冲液（pH 3.6）、10 mmol/L TPTZ、20 mmol/L 氯化铁（10∶1∶1，体积比）的铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）试剂，取 1 mL 杨梅汁并添加9 mL FRAP试剂，混合均匀后，37℃水浴10 min，在593 nm处测定吸光度，带入标准曲线Y=0.000 7X+0.058 5（R2=0.998 7），计算 FRAP 值。

1.6 数据分析

所有试验均重复3次，试验结果取平均值，数据采用Origin 2019与Design Expert 8.0.6进行数据分析和图表绘制。采用SPSS 17.0进行ANOVA单因素方差分析，并检验数据的差异显著性（P＜0.05，差异显著）。

2 结果与分析

2.1 复合酶制备杨梅汁单因素试验结果

2.1.1 果胶酶和纤维素酶质量比对杨梅出汁率的影响

果胶酶与纤维素酶质量比对杨梅出汁率的影响见图1。

有研究表明，适宜环境条件下，复合酶作用效率高于单一酶[19-21]。如图1所示，果胶酶与纤维素酶质量比为3∶1时，杨梅出汁率最高，为84.88%，显著高于果胶酶与纤维素酶作用下杨梅出汁率（P＜0.05），与ABOUELSEOUD等[22]、BIAN等[7]的研究结果相似。由此可知，果胶酶与纤维素酶质量比为3∶1时，为制备杨梅汁最适复合酶质量比。

2.1.2 复合酶添加量对杨梅出汁率的影响

复合酶添加量变化对杨梅出汁率的影响见图2。

由图2可知，随着复合酶添加量的升高，杨梅出汁率呈先上升后趋于平稳的趋势。复合酶添加量为0.25%～0.40%时，酶解过程加速杨梅细胞破碎，杨梅出汁率显著升高（P＜0.05），复合酶添加量为0.40%时，杨梅出汁率为84.91%，达到最大值，表明酶解作用完全；当复合酶添加量继续增加，底物缺失导致杨梅出汁率无显著变化（P＞0.05）。故复合酶添加量0.40%为制备杨梅汁的最适添加量。

2.1.3 酶解温度对杨梅出汁率的影响

酶解温度对杨梅出汁率的影响见图3。

温度对酶活力影响较大，低温环境下酶活力会降低；高温环境下，酶结构会被破坏，使其失活，无法发挥作用[23]。由图3可知，当酶解温度为25℃～45℃时，杨梅出汁率随着温度变化显著上升（P＜0.05），并达到最大值为84.81%；继续升高酶解温度，杨梅出汁率开始下降。当酶解温度为75℃时，杨梅出汁率为81.62%，显著低于25℃条件下杨梅出汁率82.27%，表明在55℃～75℃温度环境下，复合酶易变性失活，无法提高杨梅出汁率。由此确定45℃为制备杨梅汁的最适酶解温度。

2.1.4 酶解时间对杨梅出汁率的影响

酶解时间对杨梅出汁率的影响见图4。

酶解时间长短与实际工业化生产、经济效益和生产环境密切相关。由图4可知，在0～60 min，杨梅出汁率随着酶解时间的延长而升高，酶解时间为60 min时，杨梅果浆已酶解完全，杨梅出汁率达到最大值，为84.90%；在60 min～150 min时，杨梅出汁率无显著变化（P＞0.05）。由此确定60 min为制备杨梅汁最适酶解时间。

2.2 响应面法优化复合酶酶解工艺

2.2.1 响应面试验方案及结果

在单因素试验的基础上，选取复合酶添加量X1、酶解温度X2、酶解时间X3为因素，出汁率Y为响应值，进行三因素三水平的响应面优化试验，测定结果见表2。

2.2.2 响应面数学模型建立与显著性检验

使用Design-Expert8.0.6统计分析软件对表2中的试验结果进行线性二次多项式回归拟合，建立二次多元回归方程：Y=85.28+0.18X1+0.16X2+0.18X3+0.12X1X2+0.088X1X3+0.040X2X3-0.82X12-0.65X22-0.17X32。模型和回归系数显著性检验见表3。

由表3可知，该模型极显著（P＜0.000 1），失拟项P=0.106 3＞0.05，不显著；R2=0.989 0，R2Adj=0.974 8，说明该数学模型与试验结果拟合较好，试验值与预测值有着高度的相关性，各因素与响应值间线性关系显著，可用于杨梅出汁率理论预测。由F值检验可知，各因素对杨梅出汁率的影响大小顺序为复合酶添加量（X1）＞酶解时间（X3）＞酶解温度（X2）。

2.2.3 响应面分析

复合酶添加量、酶解温度和酶解时间的交互作用见图5。

3D图可直观地反映各因素对杨梅出汁率影响程度，由表3和图5可知，X1、X2、X3、X12、X22、X32对杨梅汁得率的影响极显著（P＜0.01），X1X2对杨梅汁得率的影响显著（P＜0.05），表明复合酶添加量与酶解温度交互作用显著。

通过响应面分析法获得杨梅酶解最优工艺条件为复合酶添加量0.408%、酶解温度46.59℃、酶解时间77.69 min，此条件下杨梅出汁率理论值为85.36%。为操作方便，将上诉条件修正为复合酶添加量0.40%、酶解温度45℃、酶解时间60 min，此条件下进行3次平行试验，测得杨梅出汁率为（85.27±0.12）%，与理论值非常接近，说明该模型可用于生产中杨梅出汁率的分析预测。

2.3 酶解对杨梅汁理化指标及营养与功能成分的影响

果胶酶能够降解细胞间的果胶质，将杨梅细胞从植物组织中分离出来。纤维素酶可破坏植物细胞壁，从而提高杨梅汁得率，两种酶共同作用有利于提高杨梅汁出汁率、提升杨梅汁的营养品质[8，19]。

2.3.1 酶解对杨梅汁pH值、总酸、可溶性固形物、浊度的影响

酶解前后杨梅汁理化指标的变化见表4。

由表4可知，复合酶酶解后的杨梅汁总酸、可溶性固形物、浊度指标均显著增加（P＜0.05），可能是酶解后细胞破碎使有机酸、可溶性物质增加[22]，从而使总酸、可溶性固形物分别增加16.67%、9.20%。此外，总酸的增加导致pH值降低3.88%。浊度上升149.22%，分析可能是多数酶为蛋白质，添加后会增加浊度指数。

2.3.2 酶解对杨梅汁营养指标的影响

酶解对杨梅汁营养指标的影响如表5所示。

植物细胞溶出会导致有机酸、蛋白质和多糖等营养物质含量上升，由表5可知，总糖、总多酚、总黄酮、花色苷、蛋白质均显著增加（P＜0.05），分别增加38.64%、58.21%、67.80%、221.29%、209.83%，分析可能是植物细胞破碎，蛋白酶的添加和部分多酚酸合成酶活性升高所致。由此可知，酶解制备所得杨梅汁可提高杨梅汁营养品质。

2.3.3 酶解对杨梅汁DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率及FRAP的影响

酶解对杨梅汁抗氧化能力的影响见表6。

酚类、黄酮类化合物是体外抗氧化能力的主要作用成分，其含量变化对抗氧化活性影响很大[23]。由表6可知，酶解汁的DPPH·清除率、FRAP值显著增加（P＜0.05），分别增加6.30%、69.03%，与多酚等物质含量上升有关。·OH清除率无显著变化（P＞0.05）。因此，酶解汁抗氧化能力的升高可能与多酚、黄酮等功能活性物质含量的变化有关。

2.3.4 酶解对杨梅汁色泽的影响

酶解对杨梅汁色泽的影响见表7。

复合酶处理后，酶解杨梅汁颜色明显加深。由表7可知，L值、a值、b值显著下降（P＜0.05），分别下降54.76%、57.91%、52.72%；CD 值、T值显著增加（P＜0.05），分别增加191.52%、19.45%，花色苷是紫红色的自然色素，其含量的显著增加使酶解汁色泽指标发生显著变化，酶解杨梅汁亮度变低红色加深，外观与蓝莓汁、黑莓汁类似[18]，更易被消费者接受；杨梅汁溶液的颜色是其对光的选择性吸收，CD值、T值显著上升也是颜色加深的重要表现。

3 结论

本研究以新鲜荸荠杨梅为原料，使用复合酶处理法提高杨梅出汁率，在单因素试验的基础上，通过响应面法优化酶解工艺，并分析杨梅汁在复合酶处理前后理化指标与挥发性成分的差异性，并对酶解汁总酚、总黄酮、花色苷与抗氧化能力进行相关性分析。结果表明：各变量对杨梅出汁率的影响大小顺序为复合酶添加量（X1）＞酶解时间（X3）＞酶解温度（X2）；复合酶酶解最佳工艺为复合酶添加量0.40%、酶解温度45℃、酶解时间60 min，在此工艺条件下杨梅出汁率为85.27%；酶解杨梅汁的营养指标总糖、总酚、总黄酮、花色苷、蛋白质在复合酶处理后显著上升（P＜0.05），分别增加了38.64%、58.21%、67.80%、221.29%、209.83%，DPPH·清除率、FRAP值分别显著增加6.30%、69.03%（P＜0.05），·OH清除率无显著变化，色泽指标L值、a值、b值分别显著下降 54.76%、57.91%、52.72%（P＜0.05），CD 值、T 值上升 191.52%、19.45%（P＜0.05）。

复合酶处理制备杨梅汁，可综合提高杨梅汁的营养指标、抗氧化能力、色泽等，是杨梅深加工的重要手段，后续试验将对其沉淀、褐变以及感官评价方面加深研究。

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Optimization of Enzymatic Preparation Technology for Bayberry Juice Production

MA Jian1，2，LU Gao-yong3，CHEN Zhi-ling2，GAO Zhi-hong4，LI Zhi-qiang2，WANG Yu1，MA Yan-hong1，2*
（1.College of Food Science and Engineering，Shanxi Agricultural University，Jinzhong 030801，Shanxi，China；2.Institute of Agro-Products Processing，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，Jiangsu，China；3.Comprehensive Inspection and Testing Center，Fengxian Market Supervision Administration，Xuzhou 221700，Jiangsu，China；4.College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，Jiangsu，China）

Abstract：The preparation process for bayberry juice from chestnut was optimized using two process optimization methodologies.Process parameters such as the compound enzyme，the enzymolysis time，and optimum temperature were optimized by performing single-factor tests.On the other hand，the physical and chemical indices for bayberry juice digestion，the active ingredients，the juice color，and the antioxidant activity were optimized using the response surface methodology.It was determined that the best complex enzyme to be used was pectinase，and that its optimal mass ratio with the vitamin enzyme was 3 ∶1.Furthermore，the optimal conditions for the enzymatic preparation of bayberry juice included the addition of 0.40% complex enzyme，and the enzymolysis duration and temperature at 60 min and 45℃，respectively.Using these parameters，a bayberry juice yield of 85.27% was achieved.With the optimized protocol，the color of the bayberry juice significantly improved，and the total phenol，totalflavonoid，anthocyanin and protein contents increased by 58.21%，67.80%，221.29% and 209.83%.Respectively.Moreover，a significantly improved DPPH free-radical scavenging ability and ferric ion reducing antioxidant power（FRAP）total antioxidant capacity was observed from the juice produced using the optimized process.

Key words：compound enzyme；bayberry juice；response surface methodology；antioxidant activity；quality analysis

DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2022.07.012

基金项目：江苏省科技项目（BK20191242）

作者简介：马剑（1996—），男（汉），硕士，研究方向：食品发酵技术与农副产品资源综合利用。

*通信作者：马艳弘（1972—），女（汉），研究员，博士，研究方向：食品发酵技术与农副产品资源综合利用。

引文格式：

马剑，路高勇，陈智玲，等.复合酶法制备杨梅汁工艺优化及品质分析[J].食品研究与开发，2022，43（7）：82-88.

MAJian，LUGaoyong，CHENZhiling，et al.Optimization of Enzymatic Preparation Technology for Bayberry Juice Production[J].Food Research and Development，2022，43（7）：82-88.

加工编辑：刘艳美

收稿日期：2021-11-09