蓝莓学名越橘，是一种经济价值较高且营养丰富的水果。蓝莓浆果含有碳水化合物、蛋白质、多种维生素及花色苷，素有“浆果之王”的称号[1]。蓝莓花色苷具有改善慢性疾病[2-3]、抗氧化[4]、抗菌[5]、减轻炎症[2]、保护视力[6]、抗癌[7]等生理活性，是蓝莓的主要功效成分。花色苷还可作为一种天然抗氧化剂，有效应对机体的氧化损伤，从而改善机体微循环[1]。花色苷是花青素与糖以糖苷键相连的化合物，也是动植物体中花青素的主要存在形式。花色苷以花青素为苷元，其基本结构单元为2-苯基苯并吡喃型阳离子，它包含两个苯环和一个含氧六元环[8]。普遍存在于动植物中的6种花青素为矢车菊素、飞燕草素、芍药素、矮牵牛素、锦葵素及芍药素[9]。蓝莓中主要包含以矢车菊素、飞燕草素、芍药素、矮牵牛素及锦葵素为基础的苷元及糖苷。葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、芸香糖、鼠李糖等糖配基的主要结合位点是苷元的3，5，7号位，连接形式有单糖、二糖、三糖[10]。
目前蓝莓花色苷常用检测方法有紫外光谱法、液相色谱法、液相质谱联用法、红外光谱法等[11-12]。紫外光谱法是检测蓝莓中花青素和花色苷含量的常用方法，其定量方便，但无法鉴定花青素及花色苷的结构种类，只能检测总花色苷含量。近年来，液相色谱电喷雾离子源与三重四极杆质谱的联用，已成功应用于多种水果化合物成分的分离定量[13-14]。本研究针对我国自主研发的国家级林木良种“蓝美1号”提取的蓝莓粉（blueberry No.1 powder，B1P），测定 B1P 的含量，并探讨其抗氧化活性。本试验先采用紫外光谱法对B1P中的总花色苷含量进行测定。再利用超高效液相色谱串联质谱（ultra performance liquid chromatography-mass spectrum，UPLC-MS/MS）技术，建立一种同时检测多种蓝莓花色苷单体的定量方法，选取多反应监测模式准确定量，从而为鉴定不同品种蓝莓中花色苷的结构差异，快速获取蓝莓提取物中花色苷种类及结构的信息提供理论支持。最后利用在氧化还原反应中能产生特殊吸收峰的物质，如1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2’-氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）铵盐[2，2’-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]、羟基自由基（·OH）、超氧阴离子及铁离子，考察B1P中花色苷的抗氧化活性，研究“蓝美1号”蓝莓粉的生物活性。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
“蓝美1号”蓝莓粉（批号：SLMF1201）：浙江蓝美科技股份有限公司；乙腈、甲醇、甲酸（均为色谱纯）：美国Thermo Fisher公司；抗坏血酸、过硫酸钾（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；2，4，6-三吡啶基三嗪[2，4，6-tri（2-pyridyl）-striazine，TPTZ]（纯度＞99%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化硝基四唑兰（nitroblue tetrazolium salt，NBT）（纯度＞98%）、还原型辅酶-钠（dihydro nicotine amidadenine dinucleotide，NADH-2Na）（纯度＞98%）、邻二氮菲（纯度＞99%）、吩嗪硫酸甲酯（phenazine metho sulfate，PMS）（纯度＞98%）：北京索莱宝科技有限公司；ABTS、DPPH：美国GLPBIO公司；标准品矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、锦葵色素-3-O-葡糖苷、矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷：法国Extrasynthese公司；矮牵牛素-3-阿拉伯糖苷、飞燕草素-3-O-阿拉伯糖苷、锦葵色素-3-O-阿拉伯糖苷标准品：上海甄准生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色谱仪、ACQUITY Xevo TQ-S三重四极杆质谱仪、ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱：美国waters公司；UV-2600紫外分光光度计：日本SHIMADZU公司；PB-10pH计：德国Sartorius公司；Spectra MAX190酶标仪：美国Molecular Devices公司；3K15离心机：德国Sigma公司；ME235S电子分析天平：德国Sartorius公司；GHP-9080隔水式恒温培养箱：昆山一恒仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 pH示差法测定总花色苷含量
参照Wang等[15]的方法，稍作修改。首先将B1P用含有0.1%盐酸的甲醇溶液溶解并配制成1 mg/mL的溶液，采用紫外分光光度计对B1P进行全波长扫描（200 nm～1 200 nm），确定最大吸收波长为518 nm。再将B1P溶液用pH 1.0和pH 4.5的缓冲液分别稀释100倍，37℃平衡60min后，用紫外分光光度计在518nm处测定吸光度，利用700 nm处吸光度进行校正。
总花色苷含量计算公式如下。
式中：ε为摩尔消光系数，26 900 L/（mol·cm）；L为光程，1 cm；MW为矢车菊素花色苷相对分子质量，449.2 g/mol；DF 为稀释倍数；V 为总取液体积，L；Mt为样品质量，g。
1.3.2 基于UPLC-MS/MS测定B1P中8种花色苷含量
1.3.2.1 标准曲线的制备
用含有0.1%盐酸的甲醇溶液将8种蓝莓花色苷标准品[芍药素葡萄糖苷（peonidin-3-O-glucoside，Pn-3-G）、飞燕草素葡萄糖苷（delphindin-3-O-glucoside，Dp-3-G）、矮牵牛素葡萄糖苷（petunidin-3-O-glucoside，Pt-3-G）、矢车菊素葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，Cy-3-G）、锦葵素葡萄糖苷（malvidin-3-O-glucoside，Mv-3-G）、锦葵素阿拉伯糖苷（malvidin-3-O-arabinoside，Mv-3-A）、矮牵牛阿拉伯糖苷（petunidin-3-O-arabinoside，Pt-3-A）和飞燕草阿拉伯糖苷（delphindin-3-o-arabinoside，Dp-3-A）]，配制成浓度为1 mg/mL的储备液，再将8种花色苷的储备液用0.1%盐酸的甲醇溶液稀释成浓度为 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的工作溶液。在14 000 r/min，4℃条件下离心15 min，吸取200 μL上清液进样检测。
1.3.2.2 色谱条件
色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（4.6 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为 0.1%甲酸乙腈；进样量1 μL；流速0.3 mL/min；柱温45℃；线性洗脱梯度为0～0.5 min（5%B）、0.5 min～2.5 min（5%～90%B）、2.5 min～4 min（90%～5%B）。
质谱条件：电喷雾离子源；扫描模式为多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）；正离子检测模式；锥孔电压3.00 kV；去溶剂温度350℃；去溶剂气体650 L/h；喷雾气压力6.0 bar（1 bar=100kPa）；毛细管电压3.00 kV；碰撞能量20 eV。
首先利用质谱全波长扫描（m/z100～2 000）B1P，确定几种含量较高的化合物，与花色苷标准品以及文献[12]结果进行比对，得到含量较高的8种花色苷，8个化合物及碎片信息如表1所示。
表1 8种花色苷的典型质谱参数
Table 1 Specific mass spectrometric parameters of 8 anthocyanins
化合物 离子通道 保留时间/m i n芍药素葡萄糖苷 4 6 3.2 9→3 0 1.2 9 1.3 2飞燕草素葡萄糖苷 4 6 5.2 2→3 0 3.0 2 1.2 9矮牵牛素葡萄糖苷 4 7 9.3 0→3 1 7.0 5 1.3 1矢车菊素葡萄糖苷 4 4 9.2 7→2 8 7.0 7 1.3 1锦葵素葡萄糖苷 4 9 3.3 0→3 3 1.0 6 1.3 2锦葵素阿拉伯糖苷 4 6 3.3 5→3 3 1.0 6 1.3 3矮牵牛素阿拉伯糖苷 4 4 9.2 8→3 1 7.1 0 1.3 1飞燕草素阿拉伯糖苷 4 3 5.3 3→3 0 3.0 7 1.3 0
1.3.3 抗氧化活性的测定
1.3.3.1 样品的配制
将B1P和抗坏血酸（vitamin C，VC）分别用无水乙醇配制成 10、20、40、50、60、80、100 μg/mL 的样品溶液。VC作为阳性对照。试验涉及的样品及试剂均现配现用。
1.3.3.2 ABTS+·清除率的测定
7 mmol/L ABTS溶液与4.95 mmol/L过硫酸钾溶液等体积混合，避光反应14 h，得ABTS+溶液备用[4]。用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）稀释 ABTS+溶液20倍，使其在734 nm处吸光度为0.70±0.02。20 μL样品与200 μLABTS+溶液加至96微孔板。酶标仪在734 nm波长处测定吸光度，记为A1。用20 μL无水乙醇代替样品在734 nm处测吸光度，记为A0。用PBS代替ABTS+溶液测定吸光度，记为A2。ABTS+·清除率计算公式如下。
1.3.3.3 DPPH·清除率的测定
参照Zhou等[4]的方法并稍作修改，将100 μL样品与100 μL 0.5 mmol/L DPPH溶液加至96微孔板。在37℃恒温培养箱中，避光孵育30 min。酶标仪在517 nm处测吸光度，记为A1。以无水乙醇作对照，测得吸光度记为A0；用无水乙醇代替DPPH溶液，测得吸光度记为A2。DPPH·清除率计算公式如下。
1.3.3.4 羟基自由基（·OH）清除率的测定
96微孔板中加入40μL样品、40μL1.864mmol/L的邻二氮菲溶液，80 μL PBS（pH 7.4），40 μL 1.864 mmol/L的FeSO4·7H2O 溶液、40 μL 0.03% H2O2，混匀后避光37℃孵育60 min，酶标仪在536 nm处测定吸光度记为As，水作对照吸光度记为An，水代替样品和H2O2的吸光度记为Ab[16]。羟基自由基清除率计算公式如下。
1.3.3.5 铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）测定
FRAP工作液为10 mmol/L TPTZ（40 mmol/L盐酸溶解）溶液：20 mmol/L FeCl3·6H2O∶0.3 mol/L的醋酸盐缓冲溶液以体积比为1∶1∶10混匀[17]。将FeSO4·7H2O稀释成 1.50、1.20、0.90、0.60、0.30、0.15 mmol/L 梯度溶液作为标准品[18]。20 μL FeSO4·7H2O和样品溶液、180 μL FRAP工作液依次加至96微孔板。37℃放置10 min后，用酶标仪在593 nm处测得吸光度为A。以FeSO4·7H2O为标准品绘制标准曲线，样品的总抗氧化能力以FRAP值表示。
1.3.3.6 超氧阴离子自由基清除率的测定
用0.1 mmol/L的磷酸盐缓冲液分别将NBT、NADH-2Na、PMS溶解并配制成 120 μmol/L 的 PMS溶液、300 μmol/L 的 NBT 溶液、936 μmol/L 的 NADH-2Na溶液[4]。将样品与上述溶液按照体积比1∶1∶2∶2加至96微孔板，混匀，25℃培养5 min，用酶标仪在560 nm处测得吸光度为A1。用乙醇代替样品测得吸光度为A0，用250 μL PBS缓冲液代替所加试剂测得吸光度为A2。超氧阴离子自由基清除率计算公式如下。
1.4 数据处理与统计分析
所有试验测定均重复3次，96微孔板平行设置3个孔，结果以平均值±标准差表示。采用Excel进行统计学计算，采用GraphPad Prism 8作图，采用UNIFI Ver.1.6.1软件进行数据处理及统计分析，显著性差异水平定为p＜0.05。
2 结果与分析
2.1 B1P中总花色苷含量的测定
花色苷在pH1.0缓冲溶液中呈紫红色，而在pH4.5的缓冲液中稳定后为无色液体。这与文献[19]报道相符，即不同pH值条件下花色苷的结构不同，从而导致紫外吸收波长改变。pH1.0时，花色苷为稳定的黄盐阳离子，紫外吸收较强。pH4.5时，花色苷转化为甲醇假碱，颜色消失[19]。pH示差法利用紫外光吸收性质对花色苷进行定量检测，得到3批B1P总花色苷含量平均为（443.08±16.40）mg/g。此种B1P的总花色苷含量达到了40%以上，提取纯度高，质量稳定，为其后的结构分析和体外抗氧化活性试验提供了物质基础。
2.2 基于UPLC-MS/MS测定B1P中8种花色苷含量
本课题组前期分析了B1P中主要成分，根据目前国内外已知花色苷的种类及离子对，并将分析结果与花色苷标准品进行比对，确认了B1P中含量较高的8种花色苷。基于UPLC-MS/MS建立了B1P中8种花色苷的检测方法，此方法得到的线性范围为0.5 ng/mL～50.0ng/mL，采用最小二乘法进行回归分析，得到的R2均大于0.990 0，线性良好，各花色苷的回归方程及含量见表2。相对含量按照8种花色苷之和为100%进行计算。
表2 8种花色苷的标准曲线与含量
Table 2 Standard curves and contents of 8 anthocyanins
化合物线性方程R2含量/（mg/g）相对含量/%锦葵素葡萄糖苷 y=3.36×105x+3.01×104 0.995 3 73.13±0.05 20.91锦葵素阿拉伯糖苷 y=2.46×105x+1.16×104 0.996 8 53.66±0.21 15.34飞燕草素葡萄糖苷 y=1.50×105x+1.40×104 0.996 4 80.90±0.30 23.13飞燕草素阿拉伯糖苷 y=1.81×105x+1.14×104 0.999 0 38.41±0.15 10.98矮牵牛素葡萄糖苷 y=2.47×105x+2.87×104 0.999 4 45.38±0.06 12.97矮牵牛素阿拉伯糖苷 y=2.76×105x+1.41×104 0.998 2 35.77±0.09 10.23矢车菊素葡萄糖苷 y=2.52×105x+1.90×104 0.997 9 16.48±0.07 4.71芍药素葡萄糖苷 y=3.45×105x+3.16×104 0.997 9 6.03±0.02 1.73
由表2可知，Dp-3-G 含量为（80.90±0.30）mg/g，占8种花色苷之和的23.13%。其次是Mv-3-G，含量为（73.13±0.05）mg/g，相对含量为20.91%。以花色苷苷元划分，花色苷标准品含量总和由高到低为Mv（36.25%）＞Dp（34.11%）＞Pt（23.2%）＞Cy（4.71%）＞Pn（1.73%）。该液质联用方法不仅能够在短时间内同步定量8种花色苷，且仅需1 μL进样体积降低定量下限至0.5 ng/mL，很大程度上提高了检测效率。8种花色苷的总含量（349.77±0.94）mg/g与总花色苷检测结果（443.08±16.40）mg/g相比偏低，表明此种B1P中的花色苷种类不止这8种。根据文献报道，在所含花色苷种类方面，黑醋栗、美国蔓越莓等其他浆果主要含以矢车菊素为苷元的糖苷，与之相比，B1P 中含有以 Mv、Dp、Pt、Cy、Pn为苷元的糖苷，种类更加丰富，并与欧洲越橘、高丛蓝莓成分相似。B1P中以矮牵牛素为苷元的糖苷占总含量的23.2%，与欧洲越橘（3.3%）和高丛蓝莓（7.9%）相比，相对含量更高[20]。
2.3 B1P的体外抗氧化活性分析
2.3.1 ABTS+·清除率的测定
B1P与阳性对照VC的ABTS+·清除率如图1所示。
图1 不同浓度样品对ABTS+·清除率的影响
Fig.1 Effects of different concentrations of ABTS free radical scavenging
***表示差异高度显著（p＜0.001）。
根据自由基被清除一半时所需样品浓度计算得到两者半数抑制浓度（IC50），并作比较，VC的IC50为（52.69±2.46）μg/mL，高于B1P的IC50（37.81±4.30）μg/mL，即B1P的ABTS+·清除率优于VC。由图1可知，样品浓度在10μg/mL～60 μg/mL，B1P 的 ABTS+·清除率优于 VC且差异高度显著（p＜0.001）；当样品浓度高于 60 μg/mL时，清除率趋于饱和，此时二者的ABTS+·清除率均较强。
2.3.2 DPPH自由基清除率的测定
DPPH自由基清除率见图2。
图2 不同浓度样品对DPPH自由基清除率的影响
Fig.2 Effects of different concentrations of DPPH free radical scavenging
*表示差异显著（p＜0.05）；**表示差异极显著（p＜0.01）；***表示差异高度显著（p＜0.001）。
由图2可知，VC和B1P二者清除率与样品浓度呈明显的剂量依赖关系。经计算得到B1P对0.5 mmol/L DPPH 自由基的IC50为（45.51±1.13）μg/mL，VC的IC50为（21.21±0.26）μg/mL。经分析得两者浓度在10 μg/mL～80 μg/mL时，VC的DPPH自由基清除率显著优于B1P；当两者浓度为100 μg/mL时，B1P和VC对DPPH自由基清除率差异不显著，清除能力均达到饱和状态。样品浓度在 10 μg/mL～80 μg/mL，B1P 的 DPPH 自由基清除率呈浓度依赖性，但较VC稍弱。B1P对ABTS+·清除率更高可能是因为抗氧化剂在DPPH体系反应中将溶解氧转化为氧气，而在ABTS反应体系中直接与氧气作用，且ABTS法适用于考察亲水性抗氧化剂，而DPPH法更适用于考察疏水抗氧化剂[21]。
2.3.3 羟基自由基清除率的测定
根据董晨阳等[22]的方法，利用芬顿体系产生·OH，当·OH被清除后随着体系中Fe2+的浓度升高，吸光度也随之上升。羟基自由基清除率的测定见图3。
图3 不同浓度样品对·OH清除率的影响
Fig.3 Effects of different concentrations of OH free radical scavenging
*表示差异显著（p＜0.05）；**表示差异极显著（p＜0.01）。
由图3可知，B1P和VC在浓度小于50 μg/mL时，对·OH清除率均较低且差异不显著；但在浓度为50 μg/mL时，B1P对·OH的清除率极显著高于VC（p＜0.01），样品浓度高于 50 μg/mL时，B1P对·OH 的清除效率显著高于 VC（p＜0.05）。B1P对·OH 的 IC50为（51.33±8.03）μg/mL。结果表明，VC对·OH 清除率较低且不呈剂量依赖性，而B1P的·OH清除率较低高且呈剂量依赖性。
2.3.4 FRAP的测定
FRAP是花色苷总抗氧化能力的一种检测方法，TPTZ和FeCl3在酸性条件下还原，溶液呈微棕色，在还原反应完成后形成蓝色的亚铁配合物[23]，样品的还原能力与待测物的抗氧化能力相关。以不同浓度的硫酸亚铁溶液结果绘制标准曲线（如图4），线性方程为y=1.080x+0.058，x表示硫酸亚铁溶液的浓度，y表示吸光度。相关系数R2=0.9996，表明其浓度在0.15mmol/L～1.50 mmol/L时线性良好。
图4 FeSO4·7H2O标准曲线
Fig.4 The standard curve of FeSO4·7H2O
样品的铁离子还原能力见图5。
图5 不同浓度样品的铁离子还原能力
Fig.5 Ferric ion reducing antioxidant power of different concentrations of sample solution
***表示差异高度显著（p＜0.001）。
由图5可知，B1P的FRAP值呈明显的剂量依赖性。以上结果表明，B1P虽具有还原铁离子的能力，但是比VC弱。
2.3.5 超氧阴离子自由基清除率的测定
超氧阴离子是单线态氧分子和·OH的前体之一，会间接产生脂质过氧化物，因此超氧阴离子自由基的清除效率对鉴定抗氧化能力具有重要意义[10]。超氧阴离子自由基是通过PMS-NADH系统产生，本研究通过减少NBT来测定样品对超氧阴离子自由基的清除能力。超氧阴离子自由基清除率的测定结果见图6。
图6 B1P超氧阴离子自由基清除能力
Fig.6 Clearance of B1P sample solution by superoxide anion assay
**表示差异极显著（p＜0.01）；***表示差异高度显著（p＜0.001）。
由图6可知，B1P和VC对超氧阴离子自由基的清除能力均具有一定的浓度依赖性，将二者IC50值作比较，VC的 IC50值为（29.76±10.31）μg/mL，高于 B1P 的IC50值（19.88±2.88）μg/mL。以上结果说明，B1P 具有较强的超氧阴离子自由基清除效果，且超氧阴离子自由基活性显著优于VC。
B1P具有较好的抗氧化活性，试验样品浓度在10 μg/mL～100 μg/mL 内，B1P 对 ABTS+·、·OH、超氧阴离子自由基清除率的IC50值分别为37.81±4.30、51.33±8.03、（19.88±2.88）μg/mL，抗氧化能力达到了微克级。FRAISSE等[24]认为花色苷的自由基清除活性可能不受花色苷糖基部分的影响，且随着B环上羟基数量增加而增加。也有研究表明苷元结构对DPPH活性强度依次为飞燕草素＞矮牵牛素＞矢车菊素＞芍药素＞锦葵素；对超氧阴离子自由基的活性强度依次为飞燕草素＞矮牵牛素＞锦葵素、矢车菊素＞芍药素[25]。结合UPLC-MS/MS测得B1P花色苷含量结果中，苷元含量高低依次为飞燕草素＞锦葵素＞矮牵牛素＞矢车菊素＞芍药素。综合考量，对B1P抗氧化能力贡献较大的可能是飞燕草素糖苷和矮牵牛素糖苷。
3 结论
“蓝美1号”蓝莓粉（B1P）是从新型蓝莓中提取出来的富含花色苷的提取物，本文主要围绕B1P从定量分析和抗氧化活性方面展开研究。利用pH示差法测得B1P提取总花色苷浓度在40%以上，高于标准化花色苷提取物（含量为36%）。在此基础上建立了一种快速、灵敏的UPLC-MS/MS分析方法，并测定了B1P中主要花色苷（Pn-3-G、Dp-3-G、Pt-3-G、Cy-3-G、Mv-3-G、Mv-3-A、Pt-3-A 和 Dp-3-A）的含量。通过 ABTS、DPPH、·OH、FRAP、超氧阴离子自由基方法，考察了B1P中花色苷的抗氧化活性，结果显示B1P抗氧化能力较好，甚至部分优于VC，抗氧化能力能达到微克级。
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