红曲是由红曲菌在大米等基质上经过固态或液态发酵形成的，因富含色泽深红的红曲色素成分而得名[1]。将固态或液态发酵的红曲进行色素的提取和喷雾干燥之后得到的红曲色素称之为红曲红，将在大米基质上经过固态发酵得到的红曲产品称之为红曲米。红曲色素在中国有上千年的食用历史，被广泛应用于以火腿为代表的肉制品着色和以红腐乳为代表的发酵豆制品着色[2-3]。食品着色用红曲中的色素成分复杂，文献报道已完成结构解析的红曲色素超过60种，其中较为常见的红曲色素主要为橙色的红斑红曲素（rubropunctatin，O1） 和红曲玉红素（monascorubrin，O2）；黄色的红曲素（monascin，Y1）和安卡红曲黄素（ankaflavin，Y2）；红色的红斑红曲胺（rubropunctamine，R1）和红曲玉红胺（monascorubramine，R2）[4]。
红曲色素种类多样，根据颜色可大致分为红、橙、黄三大类[5]。红曲橙色素O1和O2是红曲色素中最常见且含量很高的两种橙色素，红曲橙色素可通过还原反应生成红曲黄色素，也可与氨基酸或其他含氮化合物发生胺化反应生成红色素[6-7]。研究表明Y1和Y2两种红曲黄色素具有明确的抗炎活性[8-9]，动物实验结果显示：Y1和Y2具有减肥、降血脂、降血糖和改善动脉粥样硬化病变的功效[10-11]。虽然红曲色素包含多种色素成分，但目前红色调在食品着色方面应用最广。GB 1886.19—2015《食品安全国家标准食品添加剂红曲米》和GB 1886.181—2016《食品安全国家标准食品添加剂红曲红》关于红曲米和红曲红的标准均倾向于将红曲红色素作为主要测定指标：采用70%乙醇作为提取溶剂最适合红曲红色素的提取，红曲米和红曲红的检测波长分别为505 nm和（495±10）nm，接近于多种红曲红色素的最大吸收波长。GB 1886.66—2015《食品安全国家标准食品添加剂红曲黄色素》中有关红曲黄色素的描述是以红曲米为原料，经碱液洗脱，分离制得红曲红（或直接以红曲红为原料），经硫化物磺化、干燥制成的红曲黄色素。这种红曲黄色素为化学改性色素，易溶于水，最大吸收波长（476±10）nm。
红曲米中的色素成分复杂，目前对于红曲米中红曲色素的提取方面应用比较广泛的是有机溶剂浸提法，常用的有机溶剂为乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲醇等。提取溶剂的选择和提取方法的优化是准确定量分析的重要前提[12]。超声波、微波等辅助提取方式，既可节约溶剂，又可同时避免温度升高影响目标提取物的稳定性[13]。目前对于红曲色素的定量分析普遍采用分光光度法，通过测定400 nm～410 nm、460 nm～470 nm和500 nm～510 nm波长范围的色价，分别代表黄、橙、红三大类色素的含量[14]。其他分析方法还包括薄层色谱法、高效液相色谱法以及液相质谱联用技术等[15-16]。
本研究以红曲红色素色价定量分析普遍采用的70%乙醇提取溶剂为参比，通过分光光度法、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法和硅胶柱层析法，综合比较不同提取溶剂对红曲米中红曲橙色素和红曲黄色素的提取率，在此基础上，建立了红曲橙色素和红曲黄色素快速准确的高效液相色谱定量分析方法，可为富含天然红曲橙色素和红曲黄色素新产品的开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
古田红曲米：市售；6种色素标准品（R1、R2、Y1、Y2、O1、O2）：天津科技大学食品科学与工程发酵食品与微生物资源开发实验室分离制备；甲醇、乙醇、石油醚（petroleum ether，PE）、乙酸乙酯（ethyl acetate，EA）、二氯甲烷（dichloromethane，DCM）（均为分析纯）：天津市江天化工技术股份有限公司；乙腈、甲酸（色谱级）：天津市康科德科技有限公司。
1.2 仪器与设备
高效液相色谱仪（Agilent 1260）、紫外可见分光光度计（Agilent 8453）：安捷伦科技有限公司；离心机（TDZ5-WS）：湘仪离心机有限公司；电热鼓风干燥箱（DGG-107-2BS）：天津天宇实验仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 红曲色素的提取
将红曲米打磨成粉末状，准确称取5 g红曲米粉，按照料液比1∶20（g/mL）分别加入100 mL的70%乙醇、无水乙醇、70%甲醇、无水甲醇、石油醚∶乙酸乙酯（体积比 2∶1）、石油醚∶二氯甲烷（体积比 2∶1）、二氯甲烷 7种溶剂，超声辅助提取1 h，3 500 r/min离心10 min，随后吸取上清液200 μL用于检测色价及红曲色素含量，并将剩余上清液于60℃烘干至恒重得到红曲色素粗提物。
1.3.2 色价的检测
用移液器准确吸取上清提取液，加入对应的70%乙醇、无水乙醇、70%甲醇、无水甲醇、石油醚∶乙酸乙酯（体积比 2∶1）、石油醚∶二氯甲烷（体积比 2∶1）、二氯甲烷7种提取溶剂进行适当稀释，用紫外可见分光光度计测定吸光度使其OD值控制在0.2～0.8之间，并以对应的提取溶剂做空白对照，设定385 nm（代表黄色素）、470 nm（代表橙色素）、505 nm（代表红色素）作为色价检测波长。色价计算公式如下。
式中：S为色价，U/g；A为稀释后的吸光度；V为样品提取液的体积，mL；m为样品质量，g；n为提取液的稀释倍数。
1.3.3 高效液相色谱法定量分析红曲色素成分
用移液枪准确吸取100 μL待检提取液，挥干溶剂，加入乙腈复溶后进行适当稀释。用0.22 μm有机滤膜将复溶后的提取液过滤，收集于进样瓶中待检。
色谱柱：COSMOSIL Cholester（4.6mm×250 mm，5 μm）；流动相：A（0.1%甲酸水）和B（乙腈）。二极管阵列检测器；检测波长：410 nm；柱温：（25.0±0.8）℃；流速：1 mL/min；进样量：20 μL。采用梯度洗脱，洗脱程序如表1所示。
表1 红曲色素高效液相色谱梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution of HPLC for separation of Monascus pigments
洗脱时间/min A相/% B相/%0 40 60 12 40 60 25 10 90 27 10 90 30 40 60
色素混合标准曲线的绘制：准确称取6种色素标准品（HPLC检测纯度>95%）各5 mg于样品瓶中，加入1 mL乙腈充分溶解，从6个样品瓶中各吸取100 μL加入一个新样品瓶中，再加入400μL乙腈即得500μg/mL混合标准品溶液1 mL，依次稀释得到6种色素混合标准品溶液浓度分别为 100 、50 、25 、10 μg/mL。经0.22 μm有机滤膜过滤，进样20 μL检测。以标准溶液进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到6种色素的回归方程、相关系数及其线性范围。R1：y=42.96x-302，R2=0.999；R2：y=14.99x-138，R2=0.999；Y1：y=35.59x+68.10，R2=0.998；Y2：y=27.92x+64.74，R2=0.999；O1：y=43.15x+47.86，R2=0.997；O2：y=44.77x+17.32，R2=0.999。6 种红曲色素在 10 μg/mL～500 μg/mL内呈良好线性关系。
1.3.4 硅胶柱层析分离富集不同色素组分
样品预处理：将5 g原料红曲米提取得到的全部或部分红曲色素粗提物加入二氯甲烷进行溶解，随后加入相同质量的硅胶，55℃烘干至粉末状备用。
装柱：预处理样品与柱层析硅胶按照1∶50（g/g）的比例，采用干法装柱，加入少许石油醚使硅胶完全被浸没，平衡30 min后用气囊加压压平硅胶表面。打开层析柱下方端口将内部溶液排出，随后装入预处理样品。依次使用二氯甲烷、甲醇洗脱色素样品，样品各组分在洗脱液的作用下被依次洗脱，分别收集目标色层的色素洗脱液，旋蒸烘干后得到目标色素提取物，并测定其质量。
2 结果与分析
2.1 红曲色素色价检测结果
利用紫外可见分光光度法评价不同提取溶剂对红曲色素色价的影响，结果如图1所示。
图1 不同提取溶剂对红曲色素色价的影响
Fig.1 Effect of extraction solvent on color value of Monascus pigments
由图1可知，70%乙醇提取液总色价为11 393 U/g（其中黄色素5 124 U/g，橙色素2 526 U/g，红色素3 743 U/g），是无水乙醇提取液总色价的55%；70%甲醇提取液总色价为9 026 U/g（其中黄色素3 440 U/g，橙色素2 881 U/g，红色素2 705 U/g），是无水甲醇提取液总色价的51%。以70%乙醇提取溶剂为参比，极性降低的无水乙醇大幅提高红曲色素的总色价，但更低极性的石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷混合溶剂或单一溶剂提取物的红曲色素的红曲色素总色价均明显低于无水乙醇溶剂提取物的红曲色素的总色价。由于红曲色素粗提物组分复杂，红、橙、黄三类色素在较宽的波长范围内均存在很强的吸收。采用分光光度法，用特定波长下的吸光度分别代表不同色素含量的分析方法，必然会干扰三类色素的准确定量。因此，准确评价不同提取溶剂对红曲橙色素与红曲黄色素的提取量的影响，需要进一步的HPLC定量分析。
2.2 高效液相色谱法定量检测结果
6种常见天然红曲色素分子信息和对应的HPLC保留时间如表2所示。采用HPLC法定量分析比较不同提取溶剂得到的红、橙、黄三类红曲色素的峰面积，结果如图2所示。
图2 不同提取溶剂红曲色素峰面积的比较
Fig.2 Comparison of peak area of Monascus pigments extracted with different solvents
表2 6种红曲色素的分子信息和高效液相色谱保留时间
Table 2 Molecular information and retention time of six Monascus pigments by HPLC
色素 保留时间/min 分子式 相对分子质量R1 6.596 C21H23NO4 353 R2 12.121 C23H27NO4 381 Y1 18.182 C21H26O5 358 O1 20.258 C21H22O5 354 Y2 24.012 C23H30O5 386 O2 25.158 C23H26O5 382
比较分光光度法（图1）和HPLC法（图2）评价不同溶剂对红曲米中的红曲色素提取量影响的结果差异明显：分光光度法测得无水乙醇提取液的红曲橙色素的色价最高；而HPLC法测得使用PE∶EA（体积比2∶1）、PE∶DCM（体积比 2∶1）和 DCM 进行提取，得到的红曲橙色素O1和O2的峰面积约为无水乙醇提取液的 2 倍，同时 PE∶EA（体积比 2∶1）和 PE∶DCM（体积比2∶1）这两组提取溶剂提取得到的红曲红色素R1和R2的峰面积大幅度下降，且各种提取溶剂对红曲黄色素提取量的影响不明显。
红曲橙色素 O1、O2及红曲红色素 R1、R2在470 nm和505 nm均有较大色谱吸收，如果仅以470 nm代表红曲橙色素，以505 nm代表红曲红色素进行色价测定，当红曲色素粗提液中包含丰富的红曲橙色素和红曲红色素时，由于两类红曲色素具有重叠的吸收光谱区域，色价定量的方法误差较大。经HPLC定量分析可知，以乙醇为提取溶剂红曲橙色素提取量远低于石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷混合或单一溶剂提取。这可能与乙醇能够萃取得到更多种类红曲红色素有关。多数已知结构的红曲红色素与R1、R2具有相似的特征吸收光谱，大量未被HPLC检测到的多种红曲红色素在470 nm也有较强的色谱吸收，导致无水乙醇提取的红曲橙色素色价虽然最高，但与HPLC定量分析测得的红曲橙色素O1和O2峰面积不高的结果矛盾。相关研究[17-18]发现，O1和O2在甲醇溶液中不稳定，可与甲醇反应生成具有黄色荧光的两种新的红曲橙色素monasphilol-methoxy A和monasphilol-methoxy B，该研究使用HPLC分析了二氯甲烷、乙腈等6种有机溶剂对红曲橙色素O1和O2提取率的影响，结果表明二氯甲烷对O1和O2的提取率较高，与本研究结果一致。
不同提取溶剂提取红曲色素的HPLC色谱图与光谱图如图3所示。
图3 不同提取溶剂提取红曲色素的HPLC色谱图与光谱图
Fig.3 HPLC profiles and spectrograms of Monascus pigments extracted with different solvents
采用方法1.3.3的HPLC检测方法使红、橙、黄三类6种色素均获得了很好的分离度。图3所示的红曲色素的光谱图显示：红曲红色素R1、R2的较大吸收波长分别为 302、415、525 nm；红曲黄色素 Y1、Y2的较大吸收波长为230 nm和390 nm；红曲橙色素O1、O2在472 nm处有最大吸收，与文献报道的红曲色素的吸收波长一致[19-20]。SN/T 3843—2014《出口食品中红曲色素的测定》采用高效液相色谱及液质联用方法检测R2、Y1、Y2以及O2共4种色素，检测波长为230 nm，柱温为30℃；GB 5009.150—2016《食品安全国家标准食品中红曲色素的测定》推荐无水乙醇或80%乙醇为提取溶剂，规定了食品中R2、Y1和O2 3种色素的高效液相色谱测定方法，R2的检测波长为264 nm，Y1和O2的检测波长为390 nm，柱温40℃。本研究以石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷混合或单一溶剂优化的提取溶剂可大幅度提高红曲橙色素的得率。本研究采用优化后的梯度洗脱方案，选取红、橙、黄三类色素均有较强吸收的410 nm为检测波长，柱温25℃，实现了30 min内同时完成6种红曲色素的快速定量检测。
图3显示，70%乙醇提取液色调偏红，DCM提取液颜色为橙黄色，PE∶EA（体积比 2∶1）、PE∶DCM（体积比2∶1）提取液偏黄色，说明70%乙醇提取液红色素组分高于其他3种提取溶剂。优化提取溶剂一方面要考虑尽可能提高目标红曲色素的提取率，同时降低非目标色素的提取率，降低样品前处理难度，减轻复杂的生物杂质对色谱柱的污染。DCM、PE∶EA（体积比 2∶1）、PE∶DCM（体积比2∶1）3组提取溶剂获得的红曲橙色素O1和O2峰面积相近，但DCM提取得到的红曲红色素R1和R2峰面积明显高于另外2组提取溶剂。
2.3 硅胶柱层析法分离富集不同红曲色素组分
红曲色素粗提物装入硅胶柱后，二氯甲烷洗脱液首先洗脱出红曲橙色素与红曲黄色素组分，然后使用甲醇洗脱液将红曲红色素组分洗脱出来。分别收集二氯甲烷与甲醇洗脱液，旋干洗脱液后分别称重，结果如表3所示。
表3 柱层析分离红曲色素粗提物组分
Table 3 Separation of crude extract of Monascus pigments by column chromatography
红曲橙色素与红曲黄色素组分占比/%70%乙醇 731 134 507 18 DCM 731 366 334 50 PE∶EA（体积比 2∶1）提取溶剂 红曲色素粗提物质量/mg DCM组分干重/mg甲醇组分干重/mg 515 291 193 57 PE∶DCM（体积比 2∶1）688 389 198 57
5 g红曲米样品使用70%乙醇提取获得的红曲色素粗提物质量为1 156 mg，取其中731 mg的红曲色素粗提物进行硅胶柱层析分离，由表3可知，70%乙醇所提红曲粗提物中红曲橙色素与红曲黄色素组分质量是最低的，红曲红色素组分最高。说明70%乙醇对红曲米进行提取时，对种类复杂的醇溶性红曲红色素的提取率最高，对红曲橙色素与红曲黄色素的提取率最低，该方法不适合对红曲橙色素与红曲黄色素进行准确的定量分析。DCM、PE∶DCM（体积比 2∶1）、PE∶EA（体积比2∶1）提取的红曲色素粗提物经硅胶柱层析分离得到的红曲橙色素与红曲黄色素组分占比是用70%乙醇提取时的3倍左右，而红曲红色素组分明显下降。DCM、PE∶EA（体积比 2∶1）与 PE∶DCM（体积比 2∶1）提取溶剂均可明显提高红曲橙色素与红曲黄色素提取率，且后两种提取溶剂得到的红曲红色素组分质量更低，与图 3 中 DCM、PE∶DCM=2∶1（体积比 2∶1）与 PE∶EA=2∶1（体积比2∶1）提取溶剂所提样品色调分别呈现偏红和偏黄的现象吻合，且 PE∶DCM（体积比 2∶1）与 PE∶EA（体积比2∶1）所提红曲色素粗提物质量较低，而红曲色素粗提物中红曲橙色素与红曲黄色素组分占比较高说明非目标色素杂质的提取量较低。因此，选择PE∶DCM（体积比 2∶1）与 PE∶EA（体积比 2∶1）进行红曲橙色素和红曲黄色素的定量分析，不仅可以明显提高红曲橙色素、红曲黄色素的提取率，还可大幅度减少以红曲红色素为代表的非目标检测物质的提取率，更有益于准确和快速地定量分析红曲橙色素与红曲黄色素的含量。
3 结论
本研究以70%乙醇提取溶剂为参比，探究不同提取溶剂对红曲橙色素和红曲黄色素提取效果的影响，通过分光光度法、高效液相色谱和柱层析分析，优化了提高红曲橙色素和红曲黄色素得率的提取溶剂。结果表明 PE∶EA=2∶1（体积比 2∶1）、PE∶DCM（体积比 2∶1）和DCM这3种提取溶剂显著提高了红曲橙色素的提取得率。PE∶EA（体积比 2∶1）与 PE∶DCM（体积比 2∶1）两组溶剂的提取可大幅度减少红曲红色素组分等非目标检测物的提取率。建立了30 min内快速定量分析红曲橙色素和红曲黄色素的HPLC检测方法，且6种红曲色素在10 μg/mL～500 μg/mL范围内呈良好的线性关系。这可为开发富含天然红曲橙色素和红曲黄色素的新产品提供可靠的技术平台，为红曲橙色素与红曲黄色素的工业化生产及应用提供一定的参考依据。
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