藜麦（Chenopodiun quinoa Willd.），属于藜科，是安第斯山区的主要粮食作物之一，已有数千年的种植历史[1]。藜麦是一种无麸质的假谷物，近年来因其较高的营养价值和健康功效而受到广泛关注[2]。研究表明，藜麦含有丰富的优质蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质、多糖、不饱和脂肪酸及其他微量元素[3]。同时，藜麦含有多种生物活性成分，包括多酚、总黄酮、皂苷等，具有较强的抗氧化活性[4-6]，能够降低氧化应激相关疾病（如糖尿病、癌症和肥胖症）发生的风险，因此，藜麦可作为开发功能性食品的主要原料[7-8]。
啤酒是一种低浓度酒精饮料，主要以麦芽为原料，然后经过糖化、过滤、麦汁煮沸和冷却等工艺发酵而成。近年来，啤酒的类型和酿制工艺也在不断优化改进，研究人员将杂粮应用到啤酒酿造中，研制了荞麦啤酒、薏米啤酒、青稞啤酒等[9-11]，这些谷物啤酒既有谷物的特殊香味，又保留了谷物自身的营养价值[12-13]。但关于藜麦啤酒的酿造及其深入研究鲜见报道。
藜麦是目前发现的唯一的无麸质碱性食物，胚芽占种子的比例较大，为68%[14]。藜麦发芽后能显著提高营养物质及总酚、总黄酮、皂苷等活性物质含量，易于人体吸收，已被广泛用于食品加工等领域[15-18]。研究人员通过正交试验或响应面分析等方法优化了藜麦复合高纤维蛋白饮品、藜麦多谷物代餐粉、藜麦黄酒的配方或工艺条件[19-21]。研究表明，藜麦黄酒中可溶性蛋白、总酚、总黄酮含量均显著提高，且藜麦黄酒中的挥发性成分比燕麦黄酒中的挥发性成分多[22-23]，同时，总酚和总黄酮在清除自由基方面效果显著[21]。将藜麦添加到啤酒酿造过程中，可使藜麦的营养价值有效地发挥出来，制作出营养价值高、风味独特且具有生物功效的大众酒饮品。
本试验以大麦、藜麦为原料，运用单因素试验和响应面分析方法，优化藜麦啤酒的最佳酿造工艺。同时，测定藜麦啤酒中总酚、总黄酮的含量及抗氧化活性，为藜麦深加工产品的开发提供参考。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
藜麦：山东老乡生态农业有限公司，产自青海省；大麦、卡斯卡特啤酒花：郑州龙海啤酒物资有限公司，产自美国；S-04酵母：比利时弗曼迪斯酵母有限公司；无水乙醇、没食子酸、福林酚试剂、无水碳酸钠、亚硝酸钠、硝酸铝、芦丁标准品、氢氧化钠、硫酸亚铁、过氧化氢、邻苯三酚、水杨酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：天津市科密欧化学试剂有限公司。以上化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
9684麦芽研磨器：山东工大机械有限公司；KOGV328A高精度恒温糖化锅：杭州正久机械制造股份有限公司；1.5 m硅胶吸虹器、30 L美式啤酒发酵桶：烟台帝伯仕啤酒技术有限公司；LQJ 304不锈钢冷却盘管：深圳市海新莱实业有限公司；1.0～1.1糖度比重计：北京博科技术有限公司。
1.3 方法
1.3.1 藜麦啤酒酿造工艺流程
1.3.2 单因素试验
1.3.2.1 藜麦添加量的确定
设置藜麦添加量分别为0%、15%、25%、35%、45%、55%、65%，发酵时间为16 d，糖化温度为70℃，进行啤酒发酵，发酵完成后，对啤酒进行感官评定，并测定啤酒中总酚和总黄酮含量，考察不同藜麦添加量对藜麦啤酒感官品质的影响。
1.3.2.2 发酵时间的确定
设置藜麦啤酒的发酵时间分别为13、14、16、18、19 d，藜麦添加量为55%，糖化温度为70℃，进行啤酒发酵，发酵完成后，对啤酒进行感官评定，并测定啤酒中总酚和总黄酮含量，考察不同发酵时间对藜麦啤酒感官品质的影响。
1.3.2.3 糖化温度的确定
设置藜麦啤酒糖化温度分别为 60、65、70、75、80℃，藜麦添加量为55%，发酵时间为16 d，进行啤酒发酵，发酵完成后，对啤酒进行感官评定，并测定啤酒中总酚和总黄酮含量，考察不同糖化温度对藜麦啤酒感官品质的影响。
1.3.3 响应面法优化藜麦啤酒发酵工艺
根据单因素试验结果，依据Box-Behnken中心试验设计原理设计响应面试验，以感官评分为响应值，以藜麦添加量、发酵时间、糖化温度作为自变量，试验因素和水平见表1。
表1 响应面试验因素和水平
Table 1 Factors and levels of response surface test
水平 A藜麦添加量/% B发酵时间/d C糖化温度/℃-1 45 14 65 0 55 16 70 1 65 18 75
1.3.4 感官评定
参照国家标准GB/T 4927—2008《啤酒》，运用综合评分法从外观、泡沫性能、香气、口感4个方面对藜麦啤酒品质进行感官评定。选取10位身体健康且无不良嗜好的食品专业学生和老师组成感官评定小组，年龄在18岁～29岁之间，均接受过啤酒评定方面的专业训练，对制得的藜麦啤酒进行评分，总分100。藜麦啤酒感官评分标准见表2。
表2 藜麦啤酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of quinoa beer
项目满分 评分标准与分值外观 10 清亮透明，呈淡黄色，无悬浮物或无沉淀（8分～10分）光泽略差，色泽较差，无悬浮物或沉淀物（6分～7分）严重失光，色泽很差，有严重悬浮物或沉淀（1分～5分）泡沫 15 气足，倒入杯中有明显泡沫升起，泡沫洁白，挂杯（12分～15分）性能 起泡较差，泡沫不够洁白，略不挂杯（9分～11分）不起泡沫，泡沫不洁白，不挂杯（1分～8分）香气 20 有明显酒花香气，纯正无异味（15分～20分）酒花香不明显，稍有异香味（10分～14分）没有酒花香气，有明显异香味（1分～9分）口感 55 酒体柔和，爽口，有二氧化碳刺激感，无异味（45分～55分）酒体柔和，协调较差，无异味（35分～44分）口味粗糙，不爽口，有其它异杂味（1分～34分）
1.3.5 藜麦啤酒基本理化指标的测定
1.3.5.1 总糖含量的测定
葡萄糖标准曲线的制作：准确称取100 mg无水葡萄糖，用蒸馏水定容至100 mL，得到1 mg/mL标准溶液。分别吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 葡萄糖标准溶液于试管中，加蒸馏水补充至2 mL，加入6 mL蒽酮试剂，混匀，放沸水中加热15 min，冷却，于625 nm处测吸光值，吸光值作为纵坐标，溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程y=2.728 6x+0.069 7（R2=0.999 6）。每组试验重复3次。
藜麦啤酒中总糖含量的测定采用蒽酮-硫酸比色法。分别吸取藜麦啤酒样品溶液2 mL于试管中，分别加入6 mL蒽酮试剂，混匀，沸水浴15 min，冷却，于625 nm处测吸光值，根据标准曲线的回归方程计算样品中总糖含量。
1.3.5.2 总酸含量的测定
啤酒中总酸含量的测定参考国家标准GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》中的第一法。
1.3.5.3 酒精度的测定
啤酒中酒精度的测定采用GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》中的密度瓶法。
1.3.6 藜麦啤酒活性成分测定
1.3.6.1 藜麦啤酒酚类物质提取液的制备
分别吸取5 mL藜麦啤酒样品，加入45 mL乙醇（60%～70%），混合均匀，60℃超声辅助提取80 min后，在温度4℃、转速4 000 r/min条件下离心15 min，收集滤液，浓缩冷却后，用乙醇定容到20 mL。
1.3.6.2 藜麦啤酒总酚含量的测定
藜麦啤酒中总酚含量的测定采用福林肖卡法[24-25]，提取物中总酚含量表示为没食子酸当量，单位记为μg/mL。
没食子酸标准曲线的制作：准确称取没食子酸标准品25 mg，用蒸馏水定容至250 mL，得到0.1 mg/mL对照溶液。分别吸取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于 10 mL 的容量瓶中，加入2 mL福林酚，混合均匀后再加入4 mL 7.5%Na2CO3溶液，定容，摇匀后避光反应1 h，测定765 nm处的吸光值。吸光值作为纵坐标，溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程y=0.088 3x+0.042 8（R2=0.999 5）。每组试验重复3次。
1.3.6.3 藜麦啤酒总黄酮含量的测定
总黄酮含量的测定采用Złotek等[18]的方法，并稍加修改，提取物中总黄酮含量表示为芦丁当量，单位记为μg/mL。
芦丁标准曲线的制作：准确称取芦丁标准品20mg，用60%乙醇定容至10 mL，吸取5.0 mL，置于50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，得到200 μg/mL标准溶液。分别吸取 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 对照溶液于 15 mL试管中，用蒸馏水补充至5 mL，加入0.5 mL 5%的NaNO2溶液，混合均匀，反应6 min。加入0.5 mL 10%Al（NO3）3溶液，混合均匀，反应6 min。加入4 mL 4%NaOH溶液，摇匀后反应20 min，测定510 nm处吸光值。以吸光值为纵坐标，溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程 y=0.004 9x+0.016 5（R2=0.999 7）。每组试验重复3次。
1.3.7 DPPH·清除能力的测定
DPPH·清除能力测定参考Hirose等[26]的方法，并稍加修改。将多酚提取液配制成浓度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL 的溶液，分别吸取 2.0 mL不同浓度的提取溶液置于10 mL比色管中，再加入0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液2.0 mL，混合均匀，避光静置15 min，于517 nm处测定吸光值记为A1；以2.0 mL蒸馏水溶液代替0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液，测定吸光值记为A2；以2.0 mL蒸馏水代替样液，测定吸光值记为A0。DPPH·清除率计算公式如下。
DPPH·清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100
1.4 数据处理
使用Microsoft Office Excel 2007和SPSS 17.0软件分别进行数据处理和显著性分析（p<0.05），使用Origin 2016软件绘图，采用Minitab和Design-Expert软件进行响应面分析。数据采用平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 藜麦添加量对藜麦啤酒感官品质的影响藜麦添加量对啤酒感官品质的影响见表3。
表3 藜麦添加量对啤酒感官品质的影响
Table 3 The effect of quinoa addition amount on sensory quality of beer
藜麦添加量/% 外观 泡沫性能 香气 口感 感官评分0 8.0 12.4 17.4 42.1 79.9 15 8.6 13.6 17.9 38.1 78.2 25 8.9 13.7 18.2 42.3 83.1 35 9.1 12.3 18.7 40.6 80.7 45 9.3 12.2 18.9 39.6 80.0 55 9.6 13.1 19.5 43.9 86.1 65 9.2 13.0 18.8 41.2 82.2
由表3可知，随着藜麦添加量的增加，藜麦啤酒的外观和香气评分呈现先增高后降低的趋势，色泽呈现淡黄色，与卞猛[27]的研究结果一致。藜麦添加量为55%时，感官评分达到最大值，此时，啤酒酒体饱满，柔和爽口，且二氧化碳的杀口感较强，感官品质最高。因此，选择藜麦添加量为45%、55%、65%进行后续试验。
2.1.2 发酵时间对藜麦啤酒感官品质的影响
发酵时间对啤酒感官品质的影响见表4。
表4 发酵时间对啤酒感官品质的影响
Table 4 The effect of fermentation time on sensory quality of beer
发酵时间/d 外观 泡沫性能 香气 口感 感官评分13 7.3 11.2 15.8 36.4 70.7 14 7.6 12.5 17.9 38.2 76.2 16 9.4 13.8 19.3 43.4 85.9 18 8.2 13.6 18.4 40.1 79.9 19 8.0 13.1 17.8 39.6 78.5
由表4可知，当发酵13 d时，藜麦啤酒各项指标虽达到啤酒的感官标准，但相比于发酵16 d的藜麦啤酒，啤酒的香气较弱，外观澄清度、泡沫性能较差，感官评分较低。发酵16 d的藜麦啤酒，其外观、香气、口感均较好，且感官评分达到最大值。随着发酵时间的继续延长，啤酒的澄清度下降，泡沫性能和香气减弱。因此，选择发酵时间为14、16、18 d进行后续的试验。
2.1.3 糖化温度对藜麦啤酒感官品质的影响
糖化温度对啤酒感官品质的影响见表5。
表5 糖化温度对啤酒感官品质的影响
Table 5 The effect of saccharification temperature on sensory quality of beer
糖化温度/℃ 外观 泡沫性能 香气 口感 感官评分60 8.0 11.6 17.4 40.4 77.4 65 8.9 12.1 18.2 41.3 80.5 70 9.3 13.7 19.4 43.6 86.0 75 8.5 11.9 18.4 38.5 77.3 80 8.1 11.2 18.0 38.4 75.7
由表5可知，糖化温度对藜麦啤酒的口感影响较大。糖化温度在70℃时，口感最佳。随着糖化温度的增加，藜麦啤酒的泡沫性能有所减弱，80℃时，口感和泡沫性能均较差，且感官评分较低。因此，选择糖化温度为65、70、75℃进行后续的试验。
2.2 响应面分析优化藜麦啤酒发酵工艺
2.2.1 响应面优化试验结果
通过Design-Expert软件对藜麦啤酒发酵工艺进行优化试验设计及分析，响应面试验结果见表6，方差分析结果见表7。
表6 响应面分析试验设计与结果
Table 6 Design and results of response surface test
试验号 因素 感官评分A藜麦添加量 B发酵时间 C糖化温度1 0-1 1 72.7 2 -1 -1 0 81.3 3 0 1 1 69.5 4 0 0 0 84.5 5 0 0 0 85.4 6 85.2 7 1 1 0 81.7 0 0 0 8 -1 0 1 70.8 9 1-1 0 79.8 10 0 0 0 83.2 11 1 0 1 70.1 12 0 1 -1 79.7 13 0 0 0 83.1 14 -1 0 -1 73.6 15 -1 1 0 70.4 16 0 -1 -1 78.6 17 1 0 -1 84.3
通过多元回归分析，得到二次多项拟合方程为Y=84.28+2.48A-1.39B-4.14C+3.20AB-2.85AC-1.08BC-3.20A2-2.78B2-6.38C2。
由表7可知，多元二次模型p＜0.000 1，表明该回归模型极显著；失拟项p=0.030 1＜0.05，差异显著；相关系数R2=0.980 8，说明该方程拟合度较好，可用该模型预测藜麦啤酒感官评分的变化。显著性检验结果表明，A、C、AB、AC、A2、B2、C2影响极显著（p＜0.01），而 BC项对藜麦啤酒的感官品质影响不显著（p＞0.05）。各因素对藜麦啤酒感官品质的影响次序依次为藜麦添加量（A）＞糖化温度（C）＞发酵时间（B），即藜麦添加量对藜麦啤酒感官评分的影响程度最大。
表7 方差分析结果
Table 7 The results of analysis of variance
注：*表示差异显著（p＜0.05）；**表示差异极显著（p＜0.01）。
变量 平方和 自由度 均方 F值 p模型 549.93 9 61.1 39.73 <0.000 1**A 136.95 1 136.95 89.05 <0.000 1**B 15.4 1 15.4 10.01 0.015 8*C 49.01 1 49.01 31.86 0.000 8**AB 40.96 1 40.96 26.63 0.001 3**AC 32.49 1 32.49 21.13 0.002 5**BC 4.62 1 4.62 3.01 0.126 6 A2 43.18 1 43.18 28.08 0.001 1**B2 32.48 1 32.48 21.12 0.002 5**C2 171.25 1 171.25 111.35 <0.000 1**残差 10.77 7 1.54失拟项 6.06 3 2.02 1.72 0.030 1*误差项 4.71 4 1.18总和 560.7 16
各因素交互作用的响应面图见图1。
响应曲面图可直观反映各因素交互作用对藜麦啤酒感官品质的影响程度，曲面越陡峭说明影响越大，相反，越平缓说明影响越弱。由图1可以看出，藜麦添加量与发酵时间、藜麦添加量与糖化温度之间交互作用的响应面较陡峭，说明藜麦添加量与发酵时间、藜麦添加量与糖化温度交互作用显著，这与方差分析结果一致。
图1 两因素交互作用对藜麦啤酒感官评分影响的响应面图
Fig.1 Response surface plots showing the interaction effects of factors on the sensory score of quinoa beer
2.2.2 藜麦啤酒最佳发酵工艺条件的确定
根据模型拟合，得到最佳的工艺参数为藜麦添加量54.55%，发酵时间15.58 d，糖化温度70.40℃，得到的藜麦啤酒感官评分为86.096。为了方便实际操作，调整最佳工艺参数为藜麦添加量55%，发酵时间16 d，糖化温度70℃，并在此条件下进行3次平行验证试验，结果表明，得到的藜麦啤酒感官评分为86.0±0.1。试验结果与模型预测值相近，说明试验设计预测的试验参数比较精准，证明结果合理可靠。
2.3 藜麦啤酒理化指标的测定结果
对未添加藜麦和最优工艺下制得藜麦啤酒的理化指标进行对比分析，结果见表8。
由表8可知，藜麦啤酒的酒精度、总糖含量显著高于未添加藜麦的啤酒，总酸含量显著低于未添加藜麦的啤酒。此外，藜麦啤酒中总酚、总黄酮含量显著高于未添加藜麦的啤酒，这与Carciochi等[28]的研究结果一致。同时，藜麦啤酒中DPPH·的清除能力也显著高于未添加藜麦的啤酒，且其清除DPPH·能力的IC50值为39.65 mg/mL，说明藜麦的添加显著提高了藜麦啤酒中酚类物质的含量，进而直接影响藜麦啤酒的抗氧化活性。
表8 产品理化指标测定结果
Table 8 Measurement results of physical and chemical indexes of products
注：同列不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。
组别酒精度/%vol总酸含量/（g/L）总糖含量/（mg/mL）总酚含量/（μg/mL）总黄酮含量/（μg/mL）DPPH·清除率/%未添加藜麦的啤酒 1.29±0.01b 14.08±0.23a 0.35±0.01b 1.89±0.15b 42.10±1.42b 4.60±0.05b藜麦啤酒 1.64±0.01a 11.52±0.13b 0.65±0.01a 5.44±0.12a 79.00±1.41a 76.60±2.06a
3 结论
通过单因素试验和响应面试验优化发酵工艺，确定最佳发酵工艺条件为藜麦添加量55%，发酵时间16 d，糖化温度70℃，该条件下藜麦啤酒的感官评分为86.0±0.1，与预测值误差在1%内，得到的回归方程合理可靠，具有可行性。同时，此工艺条件下，藜麦啤酒中总糖含量为0.65 mg/mL、总酸含量为11.52 g/L、酒精度为1.64%vol，总酚、总黄酮含量分别为5.44、79.00 μg/mL，且 DPPH·清除率为 76.60%，DPPH·清除能力的IC50值为39.65 mg/mL。本试验结果为藜麦产品深加工提供了一定的参考。
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