南酸枣 [Choerospondias axillaris（Roxb.）Burtt et Hill]属于漆树科、南酸枣属，又名五眼果、酸枣、酸醋果等[1]，含有维生素、原花青素和黄酮等生物活性物质[2]。其中黄酮在人体内不能直接合成，大多靠外界摄取，有抗肿瘤、抗氧化[3]、保护心血管[4]的作用。研究表明广枣中的总黄酮含量[5]高于石榴、山楂、红提等常见黄酮含量较高的水果。但是由于南酸枣鲜果味酸，不宜直接食用，常被加工成南酸枣糕[6]、软糖、蜜饯[7]和果汁饮料[8]等。
近年来，随着对乳酸菌发酵过程中功能性物质研究的不断深入，越来越多的果蔬发酵饮品进入大众视野[9-11]，乳酸发酵饮品以其益生特性和独特的风味受到消费者的青睐，不仅如此，乳酸菌在代谢过程中可释放有机酸及细菌素抑制杂菌生长从而延长食品货架期[12-13]。韩喜艳等[14]利用乳酸菌制备出一种椰子植物酸奶，风味良好；周琦等[15]制备了一种黑木耳荞麦复合乳酸菌发酵饮料，并在其中添加了草莓汁，充分利用了水果资源；汪云阳等[16]优化了发酵枸杞饮料的工艺条件。鉴于南酸枣营养丰富、口味独特，相关学者对南酸枣的发酵饮料进行研究，如罗登宏[17]以野生南酸枣泥为原料，利用嗜热链球菌和保加利亚杆菌制备了南酸枣功能性发酵饮料；李俶等[18]测定了南酸枣饮料发酵前后的游离酚、游离黄酮含量，但都未提及发酵条件对南酸枣饮料品质的影响。Adetuyi等[19]及左映平等[20]的研究表明不同发酵条件对果蔬汁的营养物质特别是总黄酮含量有显著差异。因此，本研究以南酸枣为主要原料，并在感官评分的基础上以最大程度保留南酸枣中的黄酮为目标，探索不同发酵条件下南酸枣发酵饮料的黄酮含量、VC含量、总酸含量和pH值、糖度值及感官评分的变化，并得出最佳发酵工艺，以期对南酸枣发酵饮料的工业化生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
南酸枣泥：四川宏野食品有限公司；白砂糖：市售；复合乳酸菌（植物乳杆菌N13、保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌、肠膜明串珠菌、嗜热链球菌）：北京川秀科技有限公司；芦丁标准品（纯度≥98%）、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、草酸、偏磷酸、乙醇（均为分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；酚酞、抗坏血酸（均为分析纯）：西陇科学股份有限公司；没食子酸、无水碳酸钠、福林酚、冰乙酸（均为分析纯）：上海蓝季科技发展有限公司；2，6-二氯靛酚钠盐（分析纯）：合肥博美生物科技有限责任公司。
1.2 仪器与设备
医用低温保存箱（DW-25L262）：青岛海尔生物医疗股份有限公司；糖度计（0～32%）：邦西仪器科技（上海）有限公司；医用离心机（TG16G）：盐城市凯特实验仪器有限公司；数显恒温水浴锅（HH-2）：常州荣华仪器制造有限公司；破壁料理机（SP520）：浙江苏泊尔股份有限公司；生化培养箱（LRH-250C）：韶关市泰宏医疗器械有限公司；紫外可见光分光光度计（UV-19001）：岛津仪器（苏州）有限公司；台式色差仪（UItraScanVIS）：美国HunterLab公司；自动电位滴定仪（ZDJ-4A）：南京科环分析仪器有限公司；集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S）：巩义市予华仪器有限责任公司。
1.3 方法
1.3.1 发酵工艺流程
将南酸枣泥100 g、白砂糖30 g、蒸馏水120 mL混合摇匀，根据单因素试验条件不同，接种0.2%～1.0%的复合乳酸菌，35℃～39℃发酵12 h～60 h，每个梯度做3组平行。
1.3.2 单因素试验
1.3.2.1 接种量
设定初始发酵温度37℃、发酵时间48 h，设置5组不同的接种量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%），以总酸、pH值、糖度值、黄酮及VC含量和感官评分为指标筛选最佳接种量。
1.3.2.2 发酵温度
设定初始接种量0.4%、发酵时间48 h，设置5组不同的发酵温度（35、36、37、38、39 ℃），以总酸、pH 值、糖度值、黄酮及VC含量和感官评分为指标筛选最佳发酵温度。
1.3.2.3 发酵时间
设定初始接种量0.4%、发酵温度37℃，设置5组不同的发酵时间（12、24、36、48、60 h），以总酸、pH 值、糖度值、黄酮及VC含量和感官评分为指标筛选最佳发酵时间。
1.3.3 正交试验
在单因素试验的基础上，以乳酸饮料的黄酮含量及感官评价为指标，选取发酵时间、接种量、发酵温度3个因素，采用L9（33）正交试验设计对发酵工艺进行优化。
1.3.4 南酸枣发酵饮料黄酮含量的测定
采用分光光度法进行测定，参照GB/T 20574—2006《蜂胶中总黄酮含量的测定方法分光光度比色法》[21]，并稍作修改，取30g南酸枣发酵饮料，加入30mL无水乙醇，用集热式恒温加热磁力搅拌器搅拌30 min，在4℃、6 000 r/min条件下离心10 min，取上清液用中速定性滤纸进行过滤，取4 mL滤液加入1 mL 30%的乙醇溶液定容至5 mL，再加入0.3 mL 5%的亚硝酸钠溶液，静置5 min，加入0.3 mL10%的硝酸铝溶液，静置6 min，再加入2 mL1 mol/L的氢氧化钠溶液，随后用30%的乙醇溶液定容至10 mL，静置15 min后用分光光度计测定在510 nm处的吸光度。
以吸光值（y）为纵坐标，芦丁标准品溶液的质量浓度（x）为横坐标，绘制出芦丁标准曲线，经线性拟合得回归方程：y=1.113 6x-0.330 9，相关系数R2=0.991 1。根据标准回归方程计算样品中的黄酮含量，结果以mg/mL计。
1.3.5 南酸枣发酵饮料VC含量的测定
采用滴定法进行测定，参照GB 5009.86—2016《食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定》[22]，并稍作修改，取5 g南酸枣发酵饮料，加入5 g 20 g/L的偏磷酸溶液或草酸溶液，捣成匀浆，继续加入20 g/L的偏磷酸溶液或草酸溶液定容至100 mL，用中速定性滤纸过滤，取10 mL滤液于锥形瓶中，用标定过的2，6-二氯靛酚溶液滴定，直至溶液呈粉红色且15 s不褪色为止，同时做空白对照试验。VC含量计算公式如下。
式中：V为滴定样品所消耗的2，6-二氯靛酚溶液的体积，mL；V0为滴定空白所消耗2，6-二氯靛酚溶液的体积，mL；T为2，6-二氯靛酚溶液的滴定度，即每毫升2，6-二氯靛酚溶液相当于抗坏血酸的毫克数，mg/mL；A为稀释倍数；m为样品质量，g。
1.3.6 南酸枣发酵饮料总酸的测定
采用酸碱滴指示剂定法进行测定，参照GB12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》[23]，并稍作修改，将南酸枣发酵饮料用中速定性滤纸过滤，取20mL滤液于锥形瓶中，加入配制好的酚酞指示剂2滴～3滴，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液滴定至微红色且30 s不褪色，记录用量，同时做空白对照试验。总酸含量计算公式如下。
式中：C为标准氢氧化钠溶液的浓度，mol/L；V1为滴定样品所消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；V2为滴定空白所消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；V3为样品稀释液总体积，mL；V4为滴定时吸取的样液的体积，mL；K为换算为适当酸的系数，即1 mol氢氧化钠相当于主要酸的克数，这里主要酸为乳酸，K=0.090。
1.3.7 南酸枣发酵饮料pH值的测定
使用自动电位滴定仪测定进行测定，参照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》[24]，将南酸枣发酵饮料在4℃、6 000 r/min条件下离心10 min，取上清液用中速定性滤纸过滤，取10 mL滤液在室温下测定样品pH值。
1.3.8 南酸枣发酵饮料糖度的测定
使用糖度计进行测定，参照魏利民等[25]的方法，取南酸枣发酵饮料1～2滴于糖度计，直接读数。
1.3.9 南酸枣发酵饮料感官评价
参照NY 82.2—1988《果汁测定方法感官检验》[26]的方法。根据发酵制品的甜度、酸度、香味、口感、色泽分别进行品评打分，1分为最不喜欢，20分为最喜欢，如表1所示。
表1 感官评分标准
Table 1 Sensory scoring criteria
类别 感官特征 感官评分甜度（20） 甜度适中 16～20稍偏甜 13～15较甜 9～12过甜 5～8极甜 1～4酸度（20） 酸度适中 16～20稍偏酸 13～15较酸 9～12过酸 5～8极酸 1～4香味（20） 香味浓郁，协调 16～20香味稍淡，无异味 13～15香味淡，带杂味 9～12无香味，带刺激性气味 5～8无香味，气味刺鼻 1～4口感（20） 酸甜可口，无苦涩味 16～20口感较好，无苦涩味 13～15口感一般，带苦涩味 9～12口感差，苦涩味重 5～8苦涩感极其明显，难以下咽 1～4色泽（20） 色泽纯正均一 16～20色泽均匀 13～15色泽均匀，局部带少许杂色 9～12色泽不均匀，杂色明显 5～8色泽极不均匀，杂色很深 1～4
1.4 数据分析
采用SPSS26.0软件完成统计处理，每个数据重复3次取平均值。
2 结果与分析
2.1 接种量对南酸枣饮料品质的影响
接种量对南酸枣饮料品质的影响见图1～图2。
图1 接种量对总酸、pH值、糖度和感官评分的影响
Fig.1 Effects of inoculation amount on total acid，pH value，sugar content and sensory score
图2 接种量对黄酮和VC含量的影响
Fig.2 Effect of inoculation amount on the content of flavonoids and vitamin C
如图1～图2所示，随接种量的增加，VC、总酸及黄酮含量和感官评分整体上呈现先上升后下降的趋势。在接种量为0.4%时VC及黄酮含量明显增加，此时VC含量、黄酮含量及总酸含量分别为9.2 mg/100 g、3.13 mg/mL、7.29 g/L，均达最大值，pH 值最低，为 3.47。这是由于南酸枣泥原液相比于其他水果发酵原液较为黏稠，溶氧量小[27-28]，在较低种剂量时乳酸菌便快速生长代谢达到顶峰，而当接种量超过0.4%时，VC、总酸及黄酮含量却逐渐下降，在接种量为0.6%～1.0%时黄酮含量下降2.2%～5.1%。王玥等[29]的研究表明柿子乳酸菌发酵饮料的接种量在1%～3%时，乳酸含量和活菌数增幅度明显，而在3%之后增幅放缓。这说明接种量较大其营养物质消耗也较快，限制了乳酸菌的生长[30]，同时微生物代谢需要利用VC[31]，过多的菌株使VC的分解加剧。糖度值从接种量为0.2%的5.5%逐步下降，到接种量为1.0%时只有4.5%。综合分析南酸枣发酵饮料的最佳接种量为0.4%。
2.2 发酵温度对南酸枣饮料品质的影响
发酵温度对南酸枣饮料品质的影响见图3～图4。
图3 发酵温度对总酸、pH值、糖度和感官评分的影响
Fig.3 Effects of fermentation temperature on total acid，pH value，sugar content and sensory score
图4 发酵温度对黄酮和VC含量的影响
Fig.4 Effect of fermentation temperature on the content of flavonoids and vitamin C
如图3～图4所示，随着发酵温度升高，VC含量呈下降趋势，说明发酵温度对VC的分解影响较大；总酸及黄酮含量和感官评分呈先上升后下降的趋势。当温度为37℃时黄酮含量明显提高，达最大值，为3.38 mg/mL，此时是提取黄酮的最佳发酵温度，高于吴振等[32]检测的蓝莓果汁的总黄酮含量，且由于此时乳酸含量逐渐增多所形成的酸性环境使VC含量的降幅也较小，较上一个温度梯度仅下降4.1%。而当温度继续升高为38℃和39℃时黄酮含量分别下降了3.3%和5.3%。王香君[33]等的研究表明温度会使黄酮类化合物的提取有显著影响，当温度升高黄酮含量也随之大幅增加，但是高温会使细菌衰老加剧，发酵也停止较早，使最终的发酵产物变少。同时由于VC的热不稳定性[34]，高温会加快其损耗。38℃时的VC含量降幅明显增加，较上37℃下降了25.8%。高洁[35]利用酸浆果为试验原料，采用嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌发酵，得到最适发酵温度为37℃。38℃是总酸及感官评分的最优发酵温度，但与37℃相差不明显，因此综合分析南酸枣发酵饮料的最佳发酵温度为37℃。
2.3 发酵时间对南酸枣饮料品质的影响
发酵时间对南酸枣饮料品质的影响见图5～图6。
图5 发酵时间对总酸、pH值、糖度和感官评分的影响
Fig.5 Effects of fermentation time on total acid，pH value，sugar content and sensory score
图6 发酵时间对黄酮和VC含量的影响
Fig.6 Effect of fermentation time on the content of flavonoids and vitamin C
如图5～图6所示，随着发酵时间的增长，总酸及黄酮含量呈上升趋势，特别是36 h后黄酮含量明显提高，而VC含量先减小，在36 h后趋于稳定。当发酵时间为60 h时南酸枣发酵饮料的黄酮含量达最大值，为3.25 mg/mL，较12 h上升了27%，高于田欢等[36]制备的红提果汁及果酒的总黄酮含量。此时糖度值与pH值也最低，分别为4.6%与3.19。何梦秀等[37]及李俊等[38]的研究表明在一定范围内，乳酸菌发酵饮料的总酸及黄酮含量随时间增长逐步升高。发酵时间过短，菌落还在繁殖前期，活菌数少，发酵不完全、产物较少[39]，因此在发酵前期总酸及黄酮含量都较低。虽然在60 h时发酵液质地稍稀，感官评分低于发酵时间为48 h的发酵液，但是差异不明显，但总酸和黄酮含量与发酵时间呈明显的正相关。VC含量会因发酵时间延长损失增大，这是由于VC稳定性较差且乳酸菌代谢会分解利用部分VC，但在36 h后VC的损耗逐渐趋于稳定，这是由于36 h后发酵逐渐完全，产物增多，乳酸形成的酸性条件使VC的损耗变小[31]，因此综合分析南酸枣发酵饮料的最佳发酵时间为60 h。
2.4 正交结果分析
南酸枣功能性益生菌饮料发酵条件的正交优化结果及数据处理如表2和表3所示。
表2 正交试验结果
Table 2 Orthogonal experimental results
试验号 因素 黄酮含量/（mg/mL）黄 k1酮 k2含 k3量 R感 k1官 k2评 k3分 R A发酵时间/h B接种量/%C发酵温度/℃1 36 0.2 37 2.76 75 2 36 0.4 38 2.85 86 3 36 0.6 39 2.79 80 4 48 0.2 38 2.82 82 5 48 0.4 39 3.04 86 6 48 0.6 37 2.89 78 7 60 0.2 39 2.96 84 8 60 0.4 37 3.43 86 9 60 0.6 38 3.32 88 2.800 2.847 3.027 2.917 3.107 2.997 3.237 3.000 2.930 0.437 0.260 0.097 80.333 80.333 79.667 82.000 86.000 85.333 86.000 82.000 83.333 5.667 5.667 5.666感官评分
表3 正交试验方差分析结果
Table 3 Results of variance analysis of orthogonal test
指标 来源 Ⅲ型平方和 df 均方 F值 P值黄酮含量 发酵时间 0.307 2 0.153 9.25 0.098接种量 0.102 2 0.051 3.091 0.244发酵温度 0.015 2 0.007 0.443 0.693误差 0.033 2 0.017总计 80.619 9校正后总计 0.457 8感官评分 发酵时间 50.889 2 25.444 229 0.004接种量 50.889 2 25.444 229 0.004发酵温度 49.556 2 24.778 223 0.004误差 0.222 2 0.111总计 61 821 9校正后总计 151.556 8
由表2～表3可知，以黄酮含量为响应值时，发酵时间、接种量及发酵温度3个因素的极差关系：A>B>C，由此可见发酵时间对黄酮含量的影响最大，接种量及发酵温度次之，最佳发酵条件：A3B2C1，即发酵时间60 h、接种量0.4%、发酵温度37℃时南酸枣乳酸菌饮料的黄酮含量最高。对发酵液感官评分的极差分析显示，发酵时间、接种量及发酵温度3个因素的极差关系：A=B>C，由此可见发酵时间及接种量对黄酮含量的影响较大，发酵温度次之，最佳发酵条件：A3B2C2，即发酵时间60 h、接种量0.4%、发酵温度38℃时，南酸枣乳酸菌饮料的感官评分最高，为88分。
综合考虑黄酮含量、感官指标及耗能问题确定最优发酵条件：发酵时间60 h、接种量0.4%、发酵温度37℃。在此条件下检测到黄酮含量为3.43 mg/mL，感官评分为86分。远高于李俶等[18]经乳酸菌发酵后的南酸枣饮料的黄酮含量。
2.5 南酸枣乳酸菌饮料发酵前后营养物质的变化
南酸枣乳酸菌饮料发酵前后成分变化见表4。
表4 南酸枣饮料发酵前后成分变化
Table 4 Changes of components of Choerospondias axillaris beverage before and after fermentation
样品黄酮含量/（mg/mL）VC含量/（mg/100 g）发酵前 2.45±0.21 13.73±1.41发酵后（按最优发酵条件） 3.43±0.08 9.43±0.62
如表4所示，南酸枣饮料经过乳酸菌发酵黄酮含量较发酵前提高40%，有研究表明微生物生物转化可生成黄酮类物质或者改善其合成途径[40]。而VC由于其对光、热的敏感性及作为乳酸菌的代谢底物在发酵过程中被部分利用[41]，使得南酸枣饮料在经过发酵后VC含量减少31.5%。
3 结论
在单因素试验基础上，通过正交试验优化得出发酵条件影响黄酮含量的顺序：发酵时间>接种量>发酵温度；影响感官评分的顺序：发酵时间=接种量>发酵温度。结果表明：当发酵时间为60 h、接种量为0.4%、发酵温度为37℃时是南酸枣饮料的最优发酵条件。该条件下黄酮含量为3.43 mg/mL，较发酵前提高40%，其口感润滑、质地细腻、酸甜适中并具有浓郁的果实香气。本试验制备的南酸枣乳酸菌发酵饮料在风味口感良好的基础上最大程度提高了黄酮含量，且总酸含量高、VC含量损耗较小。
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