紫甘薯，属于旋花科甘薯属，是一种双子叶农业作物[1]。它在世界的三大温度带（热带、副热带和温带）地区种植广泛，因其产量高和对不同环境、温度和土壤条件的适应能力强，紫甘薯被认为是甘薯市场上最有优势的经济作物之一[2]。我国于20世纪90年代引进紫甘薯，并在河北、河南、山东、江苏等地种植[3]。紫甘薯营养丰富，与普通甘薯相比，其含有更多的氨基酸、淀粉、可溶性糖、花青素等[4]。近几年，紫甘薯以其特有的营养价值受到越来越多人的喜爱，因此其种植面积也呈现出逐年增加的趋势，市场开发潜力很大。
植物多糖是一种具有生物活性的大分子，由相同或不同数量的单糖组成，研究发现多糖具有抗炎、预防癌症、抗氧化、降低血糖、保护肝脏[5-8]等多种生物活性，是保健类食品开发的重要原料之一。目前能够参与体内生理功能的天然多糖已被鉴定出300多种[9]，且大部分植物多糖都比较安全，不会产生明显的副作用[10]。多糖提取方法有很多，酸法和碱法提取多糖时，由于提取液的酸碱度比较高，容易引起糖苷键断裂，破坏多糖结构[11-12]。超声波辅助提取和微波辅助提取虽然可以比较彻底地破坏细胞壁，提高多糖的提取率，但也会对多糖的结构产生破坏作用[13]。而热水提取是在一定的温度和时间内提取多糖[14]，它因具有成本低、操作简单、试剂无污染、提高多糖的溶解度等优点而备受青睐。近年来对于紫甘薯，国内外的学者的研究主要集中于对其花青素[15]、黄酮类化合物[16]、酚酸衍生物[17]等具有活性成分的物质分离，但是对紫甘薯多糖的提取、工艺的优化以及结构鉴定的研究鲜见。
因此，本试验以紫甘薯为原料，采用热水提取法提取多糖，通过单因素和响应面试验优化提取工艺，并对紫甘薯多糖进行分离纯化和结构分析鉴定，为后续的开发利用提供基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
紫甘薯（紫罗兰品种）：市售。
石油醚、无水乙醇、正丁醇、浓硫酸、三氟乙酸、甲醇（均为分析纯）：天津市化学试剂一厂；三氯甲烷（分析纯）：上海蓝季科技公司；重蒸酚、标准葡聚糖（分析纯）、Sepharose 4B、α-淀粉酶（≥40 000 U/g，食品级）、糖化酶（≥100 000 U/g，食品级）、蛋白酶（≥100 000 U/g，食品级）、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸（均为分析纯）：北京Sorlabio生物公司。
1.2 仪器与设备
多功能粉碎机（1500C）：东莞市华泰电器有限公司；Freezone冻干机（6 plus）：美国 Labconco公司；精密天平（Q224-1CN）：美国Sartorius公司；磁力搅拌器（Tex-Ⅱ）、高性能台式离心机（X1R）、酶标仪（MULTISKAN GO）、高效阴离子色谱仪（ICS-5000+）：美国Thermo公司；电热恒温水浴锅（BCI-HW）：上海医疗器械五厂；旋转蒸发器（3000A）、自动部分收集器（BSZ-100）：上海亚荣生化仪器厂；蠕动泵（100M）：保定创锐泵业有限公司；高效液相色谱仪（LC20A）：日本岛津公司；紫外分光光度计（U-T6）：上海屹谱仪器制造有限公司；傅里叶变换红外光谱检测仪（IS50）：美国布鲁克仪器公司。
1.3 试验方法
1.3.1 紫甘薯预处理
紫甘薯洗净、去皮，切成5 cm×0.5 cm×0.5 cm的矩形长条，-80℃冻干机中冷冻干燥24 h至无水分，粉碎过筛后装袋储存在干燥器中。
1.3.2 单因素试验
1.3.2.1 提取温度对紫甘薯多糖提取率的影响
每份称取10 g紫甘薯粉末，共计5份。在设定提取时间 2.5 h、液料比为 20∶1（mL/g）的条件下，于 50、60、70、80、90℃的温度下提取多糖，离心收集上清液并浓缩。水浴锅60℃加热浓缩液，加入适量糖化酶水解30 min后温度调至95℃，加入适量淀粉酶水解15 min，冷却至室温（26℃）。结束后，缓慢加入浓缩液体积4倍的无水乙醇，4℃冷藏12 h，离心后除去上清，加入适量蒸馏水复溶。采用蛋白酶-Sevag联合法除蛋白，首先水浴锅70℃加热后，加入适量蛋白酶水解30 min后冷却；其次加入1/4多糖溶液体积的Sevag试剂，摇床均匀振荡15 min离心除去白色沉淀物，重复此操作6次。AB-8大孔吸附树脂脱除色素，作用时间为12 h，结束后用蒸馏水冲洗3次树脂以充分获得全部多糖。除去色素的多糖溶液浓缩至1/10体积，冻干后得到紫甘薯多糖。测定糖含量，得出提取率。
1.3.2.2 提取时间对紫甘薯多糖提取率的影响
每份称量10 g紫甘薯粉末，共计5份。设定提取温度80℃、液料比为20∶1（mL/g）恒定不变，提取时间分别取 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。其余操作步骤同 1.3.2.1。
1.3.2.3 液料比对紫甘薯多糖提取率的影响
每份称量10 g紫甘薯粉末，共计5份。设定提取温度80℃、提取时间为2.5 h恒定不变，液料比分别取5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g）。其余操作步骤同1.3.2.1。
1.3.3 紫甘薯多糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法[18]测定紫甘薯中的多糖含量。
1.3.3.1 标准曲线的绘制
精确称取干燥无水的葡萄糖10.0 mg，使用100 mL容量瓶定容，即得到0.1 mg/mL的标准葡萄糖溶液。分别吸取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL 于各试管中，蒸馏水补足至终体积为1.0 mL。向各管加入5.0 mL浓硫酸与1.0 mL 6%苯酚，均匀振荡后加热煮沸15 min，冷却后于490 nm测定吸光值。
1.3.3.2 紫甘薯多糖含量的测定
称取一定质量的多糖，定容至250 mL，依照标椎曲线的方法加入试剂进行试验，并以此计算出紫甘薯多糖的提取率。紫甘薯多糖提取率的计算如下。
式中：R为紫甘薯多糖的提取率，%；C为紫甘薯多糖浓度，μg/mL；V为样液体积，mL；D为稀释倍数；W为所称样品的质量，g。
1.3.4 响应面试验
响应面试验因素与水平见表1。
表1 响应面试验因素与水平
Table 1 Response surface experiment factors and levels
水平A提取温度/℃B提取时间/hC液料比/（mL/g）-1 70 2.0 10∶1 0 80 2.5 15∶1 1 90 3.0 20∶1
1.3.5 紫甘薯多糖的分离纯化
Sepharose 4B的特点是分子量分离范围较大，根据它的特点选用其作为层析的填料进行紫甘薯多糖的分离和纯化，方法参考文献[19]并进行适当修改。
将紫甘薯粗多糖用超纯水配制成20mg/mL的多糖溶液，过0.22μm水系滤膜后在Sepharose4B（id1.6cm×60 cm）凝胶层析柱中上样2.0 mL，以超纯水洗脱，流速设置为0.5 mL/min，每管的收集时间设定为4 min，用苯酚-硫酸法检测各管吸光值，将收集管数作为横坐标，各管的吸光度值作为纵坐标，绘制紫甘薯多糖的洗脱曲线。根据曲线将洗脱峰对应管数分别合并收集，低温真空冷冻干燥，得纯化后多糖组分。
1.3.6 多糖的分子量测定
采用高效液相色谱法进行紫甘薯多糖的纯度鉴定。精确称量标准葡聚糖各5.0 mg，分子量分别为4×104、1×105、2×105、5×105、1×106、2×106。1 mL 超纯水溶解后，过0.22 μm水系膜除杂，进样针吸取20 μL进样。根据不同分子量葡聚糖的出峰时间制作标准曲线，得到回归方程。
纯多糖按照上述方法进行溶解，过膜后上样，采用高效液相色谱法进行检测，根据保留时间按照回归方程计算分子量。
1.3.7 紫甘薯多糖的纯度鉴定
紫外分光光度计在200 nm～400 nm处扫描浓度为1.0 mg/mL的纯多糖溶液。基于260 nm和280 nm处曲线是否光滑来判定多糖中是否存在核酸和蛋白质[20]。
1.3.8 红外光谱分析
首先称量100 mg干燥的KBr，研磨成粉末后模具加压1 min制成近乎透明的薄片，红外光谱仪在4 000 cm-1～400 cm-1内进行扫描，测定空白背景。1 mg干燥至恒重的纯多糖与100 mg KBr混合后迅速研磨至粉状，制片后采用相同方法扫描并分析多糖的特征吸收峰。
1.3.9 单糖组成分析
1.3.9.1 单糖标准品的配制
称量适量的8种单糖标准品（鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸）于试管中，超纯水溶解配制成1 mg/mL的混合单糖标准液，4℃冰箱储存备用。
1.3.9.2 样品处理
试管中加入5 mg的纯多糖，N2环境下加入5 mL的三氟乙酸（2 mol/L），确保N2充满整个试管后迅速封管。120℃的油浴锅中降解反应3 h，取出冷却至室温。50℃蒸干样品后加入1 mL甲醇继续蒸干，操作重复5次。加入5 mL超纯水振荡溶解样品，用0.22 μm水系滤膜、小柱过滤后，吸取1 mL准备上样。
1.3.9.3 流动相的配制
200 mmol/L NaOH溶液:4.2 mL NaOH溶液定容至400 mL，摇匀，通N2保护备用。
1mol/L醋酸钠溶液:称取8.2g醋酸钠固体，用50mL超纯水溶解，减压抽滤后定容至100 mL，摇匀后通N2保护备用。
800 mL超纯水，通N2保护备用。
1.3.9.4 检测条件
Thermo Dionex ICS2500色谱系统，色谱柱为Carbo Pac PA10（150 mm×3 mm），柱温设为 30℃，进样量1 mL，检测时间为40 min。
根据8种单糖的色谱图出峰时间与纯糖进行分析比较，对纯多糖的单糖组成进行定性，结合峰面积、相对分子质量等其他数据计算出纯糖中各单糖的摩尔比。
1.4 数据分析与处理
利用Design-Expert.V8.0和Origin 8.6等软件对数据进行分析及制图。
2 结果与分析
2.1 紫甘薯多糖提取的单因素试验
2.1.1 提取温度对紫甘薯多糖提取率的影响
提取温度对紫甘薯多糖提取率的影响结果如图1所示。
图1 不同提取温度对多糖提取率的影响
Fig.1 Influence of different extraction temperature on extraction yield of polysaccharides
由图1可知，紫甘薯多糖提取的温度较低时，随着提取温度的升高，多糖提取率随之增加，说明了温度升高可促进细胞内多糖分子的运动，以促进多糖溶出[21]，当温度升高到80℃时，多糖提取率最大。但当温度升高到90℃时，糖苷键可能会断裂，发生多糖降解。通过分析以上结果，选取提取温度80℃作为紫甘薯多糖的最佳提取温度。
2.1.2 提取时间对紫甘薯多糖提取率的影响
提取时间对紫甘薯多糖提取率的影响结果如图2所示。
图2 不同提取时间对多糖提取率的影响
Fig.2 Influence of different extraction time on extraction yield of polysaccharides
由图2可知，当提取时间设定在1.0 h～2.5 h内时，随着时间的逐渐延长，紫甘薯多糖的提取率也逐渐增加，并在2.5 h时达到最大，说明了提取时间适当的延长也可提高多糖的提取效率[22]。但过长的时间，多糖的溶解逐渐达到平衡后，可能会引起多糖结构的改变从而降低提取率。因此选定2.5 h为紫甘薯多糖的最优提取时间。
2.1.3 液料比对紫甘薯多糖提取率的影响
液料比对多糖提取率的影响结果如图3所示。
图3 不同液料比对多糖提取率的影响
Fig.3 Influence of different liquid-solid ratio on extraction yield of polysaccharides
由图 3 可知，在液料比为 15∶1（mL/g）时，多糖得率最大。当紫甘薯细胞内多糖浸出率达到最大值之前，多糖的提取率随着溶剂用量的增大而变大，但当多糖在溶液中几乎完全浸出后，过多的溶剂使后续步骤更加繁琐，引起大量多糖被损耗，从而提取效率下降[23]。因此选取15∶1（mL/g）为紫甘薯多糖提取的最佳液料比。
2.2 紫甘薯多糖提取的响应面试验
2.2.1 响应面试验设计
通过对单因素的试验结果进行分析后，确定了提取温度：70、80、90 ℃，提取时间：2.0、2.5、3.0 h，提取液料比 10∶1、15∶1、20∶1（mL/g）作为下一步试验因子。响应值为多糖的提取率，响应面试验使用Design-Expert 8.0.6软件进行设计，试验方案共17组，试验后通过计算得出多糖提取率，结果见表2。
2.2.2 拟合模型与显著性检验
应用Design-Expert 8.0.6软件对表2中的数据进行了建模和分析，得到了提取率（R）的提取温度（A）、提取时间（B）、液料比（C）的多元回归方程：R/%=9.00+0.23A+0.33B+0.34C-0.65AB-0.041AC-0.23BC-1.58A2-1.16B2-1.60C2。
表2 响应面法设计多糖提取试验方案与结果
Table 2 The Box-Behnken experimental design experimental scheme and results of polysaccharide
试验号A提取温度/℃B提取时间/h C液料比/（mL/g）提取率/%1 80 2.0 20∶1 6.483 2 80 2.5 15∶1 9.030 3 90 2.5 10∶1 5.728 4 80 2.5 15∶1 8.976 5 80 2.5 15∶1 8.923 6 80 2.5 15∶1 9.064 7 90 3.0 15∶1 6.195 8 80 3.0 20∶1 6.683 9 70 2.5 20∶1 5.994 10 80 2.5 15∶1 8.986 11 70 3.0 15∶1 6.987 12 90 2.0 15∶1 6.845 13 80 2.0 10∶1 5.326 14 70 2.0 15∶1 5.029 15 90 2.5 20∶1 6.335 16 70 2.5 10∶1 5.221 17 80 3.0 10∶1 6.464
响应面试验数据的分析结果见表3。
由表3可知，P<0.000 1，R2=0.995 6，说明此模型显著性很高；且失拟项P值0.728 3>0.05，说明明显的失拟因素不存在，因此该回归方程可信。F检验可评估判断自变量对因变量产生的影响[24]，可知3个因素影响提取率的程度为C（液料比）>B（提取时间）>A（提取温度）。
表3 Box-Behnken数据分析结果
Table 3 Results of Box-Behnken data analysis
注：**表示极显著（P<0.01）。
方差来源 自由度 均方 平方和 P值 F值 显著性模型 9 3.79 34.14 <0.000 1 1 696.6 **A 1 0.44 0.44 <0.000 1 196.2 **B 1 0.87 0.87 <0.000 1 391.35 **C 1 0.95 0.95 <0.000 1 425.09 **AB 1 1.70 1.70 <0.000 1 760.32 **AC 1 1.01 1.01 0.124 3 3.05 BC 1 0.22 0.22 <0.000 1 98.19 **A2 1 10.46 10.46 <0.000 1 4 676.62 **B2 1 5.63 5.63 <0.000 1 2 517.48 **C2 1 10.79 10.79 <0.000 1 4 826.34 **残差 7 1.01 0.016失拟项 3 1.00 1.01 0.728 3 0.45纯误差 4 1.01 0.012总变异 16 34.15
2.2.3 响应面试验结果分析
3个因素的两两交互作用对提取率的影响见图4～图6。等高线若为圆形则表明两因素间的相互作用对提取率的影响很小，若是椭圆形则说明影响很大[25]。
图4 提取温度和提取时间两因素对提取率的交互作用
Fig.4 Interaction of extraction temperature and extraction time on extraction yield
图5 提取温度和液料比两因素对提取率的交互作用
Fig.5 Interaction of extraction temperature and liquid-solid ratio on extraction yield
图6 提取时间和液料比两因素对提取率的交互作用
Fig.6 Interaction of extraction time and liquid-solid ratio on extraction yield
由图4～图6可知，对提取率影响最大的交互作用是提取温度和提取时间，而提取温度和液料比的影响最小。
通过软件计算后，得到最优的条件为温度80.70℃、时间 2.58h、液料比 15.64∶1（mL/g），预测提取率为9.06%。在实验室实际操作后，确定了最优的条件为提取时间2.5 h、温度 80 ℃和液料比 15∶1（mL/g），测得实际的提取率取平均值为9.03%，相对偏差为0.74%，这表明响应面法优化的提取条件是稳定可行的。
2.3 紫甘薯多糖的分离纯化
洗脱曲线如图7所示，两个峰命名为PSPP-A和PSPP-B。合并收集糖含量最高的PSPP-A，进行后续的纯度鉴定。
图7 紫甘薯多糖的Sepharose 4B洗脱曲线
Fig.7 Sepharose 4B elution curve of purple sweet potato polysaccharide
2.4 PSPP-A的纯度及分子量鉴定
多糖分子量标准曲线如图8所示。分子量不同的葡聚糖标准曲线回归方程为Y=-4.310 7X+36.120 0。PSPP-A的液相色谱图如图9所示。
图8 多糖分子量标准曲线
Fig.8 Standard curve of molecular weight of polysaccharide
由图9可知，PSPP-A的液相色谱图为单一峰，证明多糖经Sepharose 4B凝胶层析柱纯化后均一性较好。PSPP-A的出峰时间为8.438 min，经过计算，最终得出PSPP-A的分子量为2.63×103kDa。
图9 PSPP-A的高效液相色谱图
Fig.9 High performance liquid chromatography of PSPP-A
2.5 PSPP-A的紫外光谱分析
PSPP-A的紫外扫描光谱图见图10。
图10 PSPP-A的紫外扫描光谱图
Fig.10 UV scanning spectra of PSPP-A
紫外分光光度计扫描PSPP-A溶液后，260 nm和280 nm处均无明显的吸收峰，说明多糖基本不含核酸、蛋白质类物质[26]。
2.6 PSPP-A的傅里叶红外光谱分析
利用KBr压片法对多糖进行傅里叶红外光谱分析，可以得到PSPP-A的特征官能团和糖环构型等结构信息[27]。PSPP-A的傅里叶变换红外光谱图见图11。
图11 PSPP-A的傅里叶变换红外光谱图
Fig.11 Fourier transform infrared spectrumdiagram of PSPP-A
由图11可知，3 416.39 cm-1处的宽吸收峰是—OH伸缩振动，2 924.24 cm-1和2 853.98 cm-1处的吸收峰是C—H的伸缩弯曲振动，这都是多糖的特征峰，因此可以验证PSPP-A是多糖类物质[28]。1 739.94 cm-1处有吸收峰是因为存在酯羧基，说明PSPP-A含有糖醛酸；1 617.85 cm-1处的吸收峰是羧酸盐离子[29]。1 438.34、1 420.30 cm-1处的吸收峰是由于C—H的变角振动[30]。在1 077.59、1 050.61 cm-1处存在C—O—C的弯曲振动，表明存在吡喃糖环[31]。在830.54 cm-1处的吸收峰表明糖结构为α-糖苷键，在920.32 cm-1处的吸收峰归因于 β-糖苷键[32]。
2.7 PSPP-A的单糖组成分析
离子色谱法能使单糖通过金电极表面时发生氧化反应，进而引起电流变化来高效地进行单糖分析[33]，不需要进行衍生操作，且每种单糖都会有显著的色谱峰，适合不易提取多糖中的糖类成分分析[34]。PSPP-A经三氟乙酸水解后进行离子色谱分析，结果如图12所示。PSPP-A的单糖组成分析见表4。
表4 PSPP-A的单糖组成分析
Table 4 Monosaccharide composition of PSPP-A
相对摩尔比鼠李糖 8.09 5.191 9 10.551 1 5.0 164.14 1.89阿拉伯糖 9.79 6.098 9 50.777 4 5.0 150.13 8.45半乳糖 12.70 5.508 0 12.679 7 5.0 180.16 1.95葡萄糖 13.51 8.553 4 11.400 8 5.0 180.2 1.13葡萄糖醛酸 26.87 2.744 3 3.500 2 5.0 194.14 1.00名称 保留时间/min标品峰面积样品峰面积标品质量/mg分子质量
图12 PSPP-A的单糖组成离子色谱图
Fig.12 Ion chromatograms for determination of PSPP-A monosaccharide composition
1.鼠李糖；2.阿拉伯糖；3.半乳糖；4.葡萄糖；5.木糖；6.甘露糖；7.半乳糖醛酸；8.葡萄糖醛酸。
根据图12单糖标准品的出峰顺序和时间判断PSPP-A中的单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸。
由表4可知，PSPP-A单糖（鼠李糖:阿拉伯糖:半乳糖:葡萄糖:葡萄糖醛酸）组成的相对摩尔比为1.89∶8.45∶1.95∶1.13∶1.00。
3 结论
本论文以紫甘薯多糖为研究对象，对其提取率的工艺优化和分离纯化进行了研究，通过进行单因素和响应面试验，得到当提取温度80℃、提取时间2.5 h和液料比15∶1（mL/g）时，紫甘薯多糖提取率最佳，为9.03%。选用Sepharose 4B凝胶分离纯化后得到纯多糖PSPP-A。PSPP-A的相对分子量为2.63×103kDa。通过紫外吸收光谱可知，PSPP-A中不含核酸和蛋白质类物质。PSPP-A的FT-IR图谱存在吡喃糖环、α-糖苷键和β-糖苷键。PSPP-A经单糖组成分析判定后得出，其是由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸5 种单糖组成，相对摩尔比为 1.89∶8.45∶1.95∶1.13∶1。本研究可为紫甘薯的综合开发和食品功能因子的应用提供参考。
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