沙棘（Hippophae rhumnoides L），属于蔷薇目胡颓子科沙棘属，是一种具有较多用途的高纬度植物，在医药保健、绿色食品开发及环境保护中应用广泛[1-2]。我国沙棘资源丰富，沙棘叶天然、无毒，而且含有多种对人体有益的活性化合物，其中黄酮类化合物是其最重要的功能活性成分之一[3-4]。沙棘叶中黄酮类化合物大都以糖苷形式存在，经研究[5-6]，黄酮糖苷的抗氧化等生物活性和生物利用率均低于苷元。利用微生物转化对沙棘黄酮进行结构修饰，将黄酮糖苷转化成相应苷元，可提高其生理活性，促进其进一步的开发和利用。
金花菌是黑茶茯砖茶加工工序中的优势菌，该类菌具有耐热、抗逆性好的特点[7]。金花菌酶系丰富，现已经被发现能产多种酶如多聚半乳糖转移酶、淀粉酶、单宁酶、纤维素酶、果胶酶等[8]。这些酶在制茶过程中作为生化动力推动茶叶生化成分的转变，并使发酵茶具备更好的保健功效和饮用价值。将传统发酵茶中的有益菌引入沙棘叶进行制茶，不仅能赋予沙棘叶发酵茶的风味和口感，其次由于微生物的参与可改变沙棘叶化学组成、提升其生理活性。合理利用沙棘叶，将其制成发酵型沙棘叶茶，具有广阔的应用前景。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
试验菌株：金花菌Eurotium amstelodami BSX001，由江南大学生物工程学院发酵健康食品实验室分离并保藏于中国农业微生物菌种保藏中心，编号ACCC32729。
沙棘叶采集地点是宁夏固原市原州区张易镇；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：Tedia公司（美国）；水溶性维生素 E （Trolox）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazide，DPPH）、2，2’-连氮基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]二铵盐：阿拉丁生化科技股份有限公司；槲皮素、异鼠李素、山奈酚标准品、胰脂肪酶（牛胰腺，15 U/mg～35 U/mg）：美国sigma-Aldrich公司。
1.2 仪器与设备
Agilent1260高效液相色谱仪：美国安捷伦科技公司；Synergy H4酶标仪：美国伯腾仪器有限公司；7GI-16M高速冷冻离心机：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；SPX-250B-Z恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂；6CST-50杀青机、6CRL-65揉捻机：浙江武义万达干燥设备制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 金花菌孢子悬液的制备与计数
称取300 g马铃薯，洗净去皮切碎，加入1 000 mL蒸馏水，煮沸约30 min，双层纱布过滤后，取滤液加入20 g黑毛茶，煮沸5 min，再次双层纱布过滤，加入20 g葡萄糖与20 g琼脂，蒸馏水定容至1 000 mL，即为改良PDA培养基。将E.amstelodami BSX001接种在改良PDA平板上，28℃恒温培养，至菌落覆盖平板较大面积时（7 d～10 d），在超净工作台下倒入少量无菌水，用接种环小心将黄色闭囊壳刮下，再将悬浮液转入装有150 mL无菌水的三角瓶内（内含玻璃珠），150 r/min振摇20 min成分散均匀的孢子悬液，平板菌落计数法测得孢子浓度。
1.3.2 沙棘发酵茶的制备
预处理：取一定质量的沙棘鲜叶，清水冲洗去除叶片泥沙，晾晒；杀青：将沙棘叶放在杀青机内，翻动，完成杀青；揉捻：用揉捻机轻度搓揉3 min～5 min，温度维持在30℃；发花：将Eurotium amstelodami BSX001孢子悬浮液按每千克沙棘叶9×109个孢子的比例接种揉捻后的沙棘叶，含水量控制在45%～50%。32℃持续发酵4 d，通风换气6次，25℃继续发酵2 d～6 d；干燥：将完成发酵的沙棘叶在60℃下干燥4 h，即得沙棘发酵茶。
1.3.3 沙棘茶总酚及总黄酮含量的检测
茶叶中总酚（以没食子酸计）含量的测定[9]：用每克提取物中所含没食子酸毫克数来表示茶叶中所含总酚的量。将样品稀释至不同浓度，依次吸取0.5 mL样品，1.0 mL福林酚（Folin-Ciocalteu）试剂（稀释 10倍），1.0 mL 87.56 g/L的碳酸钠溶液，摇匀后放置60 min，于750 nm下测定吸度。以没食子酸浓度对吸光度进行回归，绘制标准曲线，得回归方程：y=0.026 8x+0.014 1，R2=0.999 0。
茶叶中总黄酮（以芦丁计）含量的测定[10]：吸取2 mL样品溶液两份，分别置于25 mL具塞刻度试管中，加水到10 mL，加入1 mL亚硝酸钠溶液（50 mg/mL），混匀后室温反应6 min，加1 mL硝酸铝溶液（100 mg/mL），另一份不加硝酸铝溶液作为空白液，混匀后室温放置6 min，加 4 mL氢氧化钠溶液（200 mg/mL），加水至刻度，混匀后室温放置15 min，于510 nm处测定吸光度。以芦丁对照品使用液浓度对吸光度进行回归，绘制标准曲线，得回归方程：y=0.026 8x+0.014 1，R2=0.999 5。
1.3.4 高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法同时测定黄酮苷元的含量
色谱条件：液相色谱柱ZORBAX Eclipse XDB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.2%磷酸（50∶50，体积比），流速 0.8 mL/min，检测波长 370 nm，柱温 35℃，进样量 10 μL。
标准样品的制备：分别精密称取槲皮素、山奈酚、异鼠李素标准品于25 mL棕色容量瓶，用无水甲醇溶解并定容，制成0.1 mg/mL对照品储备液（4℃贮藏）。取标准储备液进行稀释，配制系列浓度的混合标准液（4℃贮藏）。
供试样品的制备：将茶样粉碎，过80目筛，称取1.00 g，加10 mL甲醇，超声辅助提取30 min，稀释，过0.45 μm 滤膜，待测。
1.3.5 沙棘茶抗氧化活性的测定
DPPH自由基清除能力的测定[11]：分别取50 μL适当稀释后的样品与150 μL的DPPH甲醇溶液（75 μmol/L）混合。在室温黑暗中培养30 min后，在517 nm处测量紫色自由基DPPH溶液的脱色情况。所有测试均做3个复孔，取其平均值，阴性对照以样品溶剂代替样品溶液。Trolox是一种维生素E的类似物，具有和维生素E相近的抗氧化能力，将其作为沙棘茶总抗氧化能力的参考。样品的抗氧化能力用其对DPPH自由基的清除率表示，抗氧化活性越强则清除率越大。DPPH自由基清除率计算公式如下。
DPPH 自由基清除率/%=（1－A1/A0）×100
式中：A0为阴性对照吸光度；A1为样品组吸光度。
ABTS法测定抗氧化活性[12]：首先，将7 mmol/L ABTS二铵盐和2.4 mmol/L硫酸钾等体积混合，在室温下黑暗放置12 h，产生新鲜的ABTS+自由基。将1 mL ABTS溶液与60 mL甲醇混合，在734 nm吸光度为1.10±0.02。然后，将 50 μL 适当稀释的样品与 150 μL的ABTS溶液反应，2 h后在734 nm处测量吸光度。所有测试均做3个复孔，取平均值，阴性对照以样品溶剂代替样品溶液。ABTS+自由基清除率计算公式如下。
ABTS+自由基清除率/%=（1－A1/A0）×100
式中：A0为阴性对照吸光度；A1为样品组吸光度。
1.3.6 沙棘茶降脂活性的测定
参考陈永丽等[13]的方法测定沙棘叶茶样品的胰脂肪酶活性抑制能力。胰脂肪酶可将脂肪水解成游离脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。通过抑制胰脂肪酶的活性可以减少脂质的吸收。将胰脂肪酶溶于50 mmol/L磷酸缓冲液（pH8.0），-20℃保存。称取0.016 1 g月桂酸4-硝基苯酯溶于100 mL 5 mmol/L乙酸钠溶液（含质量分数1%的Trition X-100）中，在沸水中加热以加速溶解，配制得0.5 mmol/L月桂酸4-硝基苯酯底物溶液，冷却至室温备用。分别配制不同质量浓度（1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 mg/mL）的沙棘叶茶甲醇超声提取液。空白对照为发酵培养基灭菌后不接菌，其他处理与发酵组保持一致。
在96孔板中依次加入50 mmol/L磷酸缓冲液（pH8.0）50 μL、不同浓度样品溶液 50 μL 和胰脂肪酶溶液（100 mg/mL）50 μL；样品对照组以等体积磷酸缓冲液代替胰脂肪酶溶液；空白组加入磷酸缓冲液50μL、甲醇50 μL和胰脂肪酶溶液50 μL；空白对照组以等体积磷酸缓冲液代替胰脂肪酶溶液；混匀后于37℃下预热10 min，然后加入0.5 mmol/L月桂酸4-硝基苯酯溶液50 μL，混匀后37℃孵育20 min，在405 nm波长下测定反应液的吸光度。以奥利司他作为阳性对照，每一样品平行测定3次。按照以下公式计算样品对胰脂肪酶的抑制率。
胰脂肪酶抑制率/%=[1-（Aa-Ab）/（Ac-Ad）]×100
式中：Aa为样品组在405 nm处的OD值；Ab为样品对照组在405 nm处的OD值；Ac为空白组在405 nm处的OD值；Ad为空白对照组在405 nm处的OD值。
1.4 数据处理
采用SPSS Statistics 25进行数据分析，采用Duncan法进行差异显著性分析（P＜0.05，差异显著）。所有结果均表示为至少3次重复的平均值±标准差。采用Origin 2018软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 采摘期对沙棘叶中水分及营养成分含量的影响
原料是影响茶叶品质的基础物质条件。茶树品种、栽培方法和管理技术影响着鲜叶的品质，但在相同的条件下，鲜叶的品质很大程度取决于采摘时机[14]。选用采摘期分别为6月、7月、8月、9月、10月的宁夏沙棘鲜叶为试验原料，测定不同采摘期鲜叶的含水量及总酚、总黄酮的含量，结果见图1和图2。
图1 不同采摘期沙棘叶的含水量
Fig.1 Water content of seabuckthorn leaves in different picking periods
图2 采摘期对沙棘叶总黄酮和总酚含量的影响
Fig.2 The effect of seabuckthorn leaf picking on contents of flavonoids and phenols
由图1可知，6月至10月沙棘叶的含水量为在54.28%～68.35%，其中6月的沙棘叶鲜嫩，含水量最高，随着气温慢慢提升，叶片的蒸腾作用加强，叶片开始失水，到10月沙棘叶已成熟，部分叶子开始枯萎、脱落，此时含水量最低，仅为54.28%，因此选用7月～9月的沙棘鲜叶制茶较为合适。
酚类化合物除了受品种遗传因子影响外，环境对其影响也很大，其中光的影响尤其重要。凡在光照强度和日照量大的环境下，沙棘叶中儿茶素含量明显增加，光质方面黄色光有利茶树生育[15]。
由图2可知，在6月～9月随着叶片成熟度的增加，沙棘叶中总酚含量基本呈上升趋势，含量变化在42.61 mg GAE/g～50.34 mg GAE/g，9 月总酚含量达到最高值50.34 mg GAE/g；沙棘叶总黄酮含量变化在15.35 mg RT/g～23.12 mg RT/g，在 9 月达到最高值。10月总酚和总黄酮含量又有所下降。所以综合各因素，制备沙棘叶茶应以9月采摘沙棘叶较好。
以9月份采摘沙棘鲜叶为原料，将金花菌E.amstelodami BSX001孢子悬浮液按每kg沙棘叶1×109个孢子的比例接种于揉捻后的沙棘叶，按茯茶“发花”工艺制得沙棘发酵茶。沙棘叶发酵茶的感官品析结果见图3。
图3 沙棘叶发酵茶的感官品析
Fig.3 Sensory analysis of fermented tea with seabuckthorn leaves
1.“发花”沙棘叶；2.沙棘叶发酵前后粉碎样；3.沙棘叶发酵前后汤色对比。
由图3可知，沙棘叶经“发花”工艺后，叶底呈暗褐色，叶片附着大量金花菌的金黄色闭囊壳。当茶水比为 1∶50（g/mL），水温 100℃，浸泡 15 min 时茶汤红黄明亮，香气纯正，滋味醇和尚浓。
2.2 沙棘叶“发花”阶段微生物及主要生化成分含量的变化
2.2.1 沙棘叶“发花”阶段金花菌数量的变化
试验发现，E.amstelodami BSX001在不另外添加营养成分的条件下，可在沙棘叶上快速“发花”，分别对“发花”过程中采集的不同时间的沙棘叶中金花菌进行计数，结果见图4。
图4 沙棘叶“发花”阶段微生物数量变化
Fig.4 Changes in the number of microorganisms during flowering
沙棘叶“发花”是在相对开放的环境中完成，因此在发酵前期会发现有少数的霉菌和酵母菌，然而沙棘叶的低水分活度、营养条件、以及人工对温湿度的调节使得金花菌快速繁殖并成为优势菌，发花的第3天，可见沙棘叶表面附着大量白色菌丝，部分区域呈淡黄色，随后几天金花菌数量呈几何级数增加，由图4可知，在发酵第9天金花菌数量达到最多（3.3×107CFU/g），随后金花菌以闭囊壳形式存在，数量保持稳定。
2.2.2 沙棘叶“发花”阶段的总酚含量的变化
茶多酚是茶叶中主要的呈味物质，具有一定的苦涩味并带有强烈的收敛性[16]，沙棘叶中酚类化合物的组成与含量与其他茶类不同，但是同样对制茶最终品质有着重要影响。沙棘叶“发花”过程中总酚含量的变化见图5。
图5 沙棘叶“发花”过程中总酚含量的变化
Fig.5 Variation of total phenols content of seabuckthorn leaves during flowering
多酚类化合物含量在沙棘叶“发花”阶段呈先增加后减少的趋势，金花菌的果胶酶、单宁酶、糖苷酶等酶可作用于沙棘叶释放叶壁中键合态的酚类物质，后期酚类物质再经酶的作用发生氧化、降解、聚合等一系列反应[17-18]。由图5可知，在“发花”阶段，沙棘叶中总酚含量呈先增加后减少的变化趋势，发酵第6天时沙棘叶总酚含量最高，可达（58.54±1.32）mg GAE/g，“发花”后期总酚含量下降明显。
2.2.3 沙棘叶“发花”阶段的黄酮类化合物的变化
黄酮类化合物是沙棘叶中主要的一类功能性成分，大都呈黄绿色，通常以黄酮苷的形式存在[19-20]。沙棘叶“发花”过程中总黄酮含量的变化见图6。
图6 沙棘叶“发花”过程中总黄酮含量的变化
Fig.6 Variation of total flavonoids content of seabuckthorn leaves during flowering
由图6可知，在“发花”阶段，沙棘叶中总黄酮含量呈先增加后减少的变化趋势，发酵第6天时沙棘叶总黄酮含量最高，可达（36.62±1.01）mg RT/g，“发花”后期总黄酮含量下降明显，但仍明显高于未加工的沙棘叶[（19.37±0.67）mg RT/g]。
金花菌分泌的多种胞外酶有利于键合态黄酮类化合物的释放，随后黄酮类化合物在金花菌分泌的胞外酶与热作用下发生降解和转化，部分与儿茶素、花青素结合产生辅色素。沙棘叶“发花”阶段总黄酮及黄酮苷元含量的变化如表1所示。
表1 沙棘叶“发花”阶段总黄酮及黄酮苷元含量的变化
Table 1 Changes of total flavonoids and flavonoid glycosides in seabuckthorn leaves during flowering
注：-表示未检出。
总黄酮含量/（mg RT/g）发酵 6 d 64.14±0.91 45.24±1.62 58.37±0.87 36.62±1.01发酵 10 d 24.76±0.42 11.02±0.05 15.67±0.23 25.11±0.39未发酵 5.68±0.01 - - 19.37±0.67沙棘叶 槲皮素含量/（mg/100 g）山奈酚含量/（mg/100 g）异鼠李素含量/（mg/100 g）
沙棘叶中黄酮主要的存在形式是由槲皮素、山奈酚、异鼠李素等苷元构成的糖苷型化合物，而苷元型黄酮更利于吸收且功能性更强[5]。E.amstelodami BSX001与其他金花菌相比有较突出的β-葡萄糖苷酶活性，黄酮苷通过β-葡萄糖苷酶的去糖基作用可获得相应的黄酮苷元等。由表1可知，在E.amstelodami BSX001接入6 d时，沙棘叶中可检测的黄酮苷元含量达到最高，6 d后各苷元含量有所降低。其中异鼠李素（58.37±0.87）mg/100 g，槲皮素（64.14±0.91）mg/100 g，山奈酚（45.24±1.62）mg/100 g。在未加工沙棘叶中仅检测到微量[（5.68±0.01）mg/100 g]的槲皮素。
2.3 沙棘叶发酵前后生物活性的变化
2.3.1 沙棘叶发酵前后的抗氧化活性
沙棘叶发酵前后自由基清除能力及IC50见表2。
表2 发酵前后沙棘叶60%乙醇提取物清除自由基能力
Table 2 Free radical scavenging capacity of 60%ethanol extract from seabuckthorn leaves before and after fermentation
样品 DPPH法ABTS法线性回归方程R2线性回归方程R2IC50/（mg/mL）IC50/（mg/mL）未发酵 Y=0.079 5X+0.127 3 0.996 3 Y=0.196 4X+0.102 2 0.999 2 2.650发酵6 d Y=0.026 7X+0.162 5 0.999 1 Y=0.154 4X+0.091 2 0.996 8 2.030 Trolox Y=17.593X+0.012 1 0.993 8 Y=25.577X+0.132 4 0.997 9 0.032 12.640 4.690 0.028
从表2可以看出，发酵前后沙棘叶60%乙醇提取物对DPPH、ABTS+自由基均有一定的清除作用，并在试验浓度范围内呈现明显的量效关系。发酵前后沙棘叶60%乙醇提取物清除DPPH自由基的IC50分别为12.640 mg/mL和4.690 mg/mL，阳性对照Trolox的IC50为0.028 mg/mL；发酵前后沙棘叶60%乙醇提取物清除ABTS+自由基的IC50分别2.650 mgmL和2.030 mg/mL，阳性对照Trolox的IC50为0.032 mg/mL。表明沙棘叶经E.amstelodami BSX001发酵后抗氧化能力有所提高。
2.3.2 沙棘叶发酵前后的体外降脂活性
分别考察了沙棘叶发酵前后的脂肪酶抑制活性，结果见图7。
由图7可知，对试验数据进行拟合得到发酵后沙棘叶对胰脂肪酶的半数抑制浓度（IC50）为4.21 mg/mL，低于对照组奥利司他的IC50（0.13 mg/mL）。质量浓度为1.00 mg/mL～10.00 mg/mL时，发酵后沙棘叶对胰脂肪酶的抑制率从30.15%增加到78.33%，未发酵沙棘叶样品抑制率为3.01%～64.92%，且在各个质量浓度下，发酵样品的抑制率均高于未发酵的样品，表明沙棘叶对胰脂肪酶具有较好的抑制作用，且经金花菌发酵之后抑制效果有明显提高。
图7 发酵前后沙棘叶和奥利司他对胰脂肪酶的抑制率
Fig.7 Inhibitory rate of pancreatic lipase by seabuckthorn leaves before and after fermentation and orlistat
A.发酵前后沙棘叶；B.奥利司他。
3 结论
鲜叶的老嫩程度是影响沙棘叶的色泽及营养成分的重要因素。因此选择适当的采摘期是制作沙棘叶茶的关键环节。均衡水分和各营养成分含量，确定9月为鲜叶最佳采摘期。在茯茶的“发花”工艺基础上，采用人工植入的方式将E.amstelodami BSX001孢子悬浮液接种于沙棘叶，试制新型的沙棘叶发酵茶。分离自茯砖茶的金花菌能在沙棘叶上正常生长，其代谢产生的各种酶类在“发花”过程中发生作用，除去了沙棘叶原有的青涩味，使茶叶品质得到提升，茶汤色泽红黄明亮，滋味醇和，菌花香显著。沙棘叶经发酵后总黄酮含量由原来的（19.37±0.67）mg RT/g提高到（36.62±1.01）mg RT/g，总酚含量由（44.61±0.82）mg GAE/g提高到（58.54±1.32）mg GAE/g。原本含量几乎检测不到的黄酮苷元含量明显提升，槲皮素含量为（64.14±0.91）mg/100 g，山奈酚含量为（45.24±1.62）mg/100 g，异鼠李素含量为（58.37±0.87）mg/100 g，沙棘叶经E.amstelodami“发花”后，抗氧化活性、降脂活性都有明显提高。
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