南荻（Miscanthus lutarioriparia）是我国特有的纤维型草本植物，具有生物量大，适应性强和易繁殖栽培等优点[1]。作为洞庭湖标志性植物群落，其具有增强蓄洪能力、净化水体、抑制藻类、防止水土流失等多重生态功能，对保护洞庭湖湿地生态系统具有重要的意义[2-3]。南荻幼时被称为南荻笋，营养物质丰富，被誉为“洞庭虫草”[4-5]。成熟期的南荻秸秆中纤维素含量可达40%～45%，可作为酶解制备葡萄糖的非粮原料。在食品领域，葡萄糖可用于提高产品风味、口感和色泽[6]，也可作为碳源用于发酵食品的制作[7]；在工业生产中，葡萄糖可以进行发酵制备生物乙醇[8]。
南荻中的纤维素不是单独存在，其与半纤维素、木质素紧密缠绕，形成致密结构，很难直接酶解制备葡萄糖。因此，需要进行合适的预处理来破坏南荻木质纤维素的紧密结构，提高纤维素酶解转化效率。有机溶剂预处理是一种处理条件温和，溶剂易回收、可循环使用的绿色处理方法，甲酸因其良好的木质素溶解性，广泛用于木质纤维素的分离[9-10]。与其他有机溶剂相比，甲酸法可以有效分离玉米秸秆[11]、小麦秸秆[12]、竹子[13]中的木质纤维素，并且分离得到的纤维素纯度高，还可同时获得木质素和木糖等产品，有利于生物质全组分的利用。
前期研究[14]确定了南荻甲酸分离的最优工艺：甲酸浓度88%、温度100℃、处理时间3 h，在该分离条件下纤维素、半纤维素和木质素的回收率分别可以达到91.7%、80.2%和85.3%，使得木质纤维素组分得到很好的分离。然而，经甲酸分离的纤维素出现甲酰化修饰，疏水性增加，影响其后续酶解转化效率[15]。钟秀红等[16]采用6%NaOH、在100℃、60 min的条件下处理甲酸分离的阔叶漂白木浆，有效去除了纤维素的甲酰基。Lim等[17]以薇甘菊为原料，经10%NaOH、处理3 h后纤维素含量增加，半纤维素和木质素含量降低，并显著提高纤维素的吸湿率。这些研究结果表明，碱性条件处理可以破坏纤维素甲酰化结构，增加原料吸湿率和可及性，从而提高酶解转化效率。因此，本试验以南荻秸秆为原料，采用甲酸联合碱性H2O2处理得到南荻纤维素，并对处理前后的样品进行理化结构以及酶解特性研究，探讨碱性H2O2处理提高南荻纤维素酶解效率的机制，为利用南荻秸秆制备葡萄糖提供技术参考。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
南荻秸秆采自湖南洞庭湖流域，自然风干，粉碎过40目筛备用；纤维素酶（Cellic Ctec 3，滤纸酶活120 FPU/mL）：诺维信（中国）生物技术有限公司；甲酸（质量分数88%）：衡阳市凯信化工试剂股份有限公司；硫酸、氢氧化钠、过氧化氢、冰乙酸、无水乙酸钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；D-葡萄糖、D-木糖、D-纤维二糖（标准品）：美国Sigma-aldrich公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒：北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器与设备
电子天平（Sartarins）：萨特里厄斯科学仪器有限公司；高效液相色谱仪（UltiMate 3000）、全波长酶标仪（1510-02624）、傅里叶红外光谱（Nicolet Is 5）、离心机（MICRO 21 R）：美国赛默飞世尔科技有限公司；压片机（HY-12）：天津天光光学仪器有限公司；全自动液氮冷冻研磨机（JXFSTPRP-Ⅱ-01）：上海净信实业发展有限公司；X射线衍射仪（D 8 Advance）：德国布鲁克公司；立式压力蒸汽灭菌锅（YSQ-LS-50 S 11）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；恒温水浴锅（HH-420）：常州亿能仪器厂；恒温培养振荡器（ZHWY-2102 C）：上海智城分析仪器制造有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（DGH-9246 A）：上海精密实验设备有限公司；调速玻璃反应釜（GRL-20）：郑州长城工贸有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品处理
1）甲酸处理：称取南荻秸秆粉1 200 g于20 L玻璃反应釜中，加入12 L质量分数88%的甲酸溶液，在温度100℃、150 r/min条件下反应3 h，反应结束后冷却抽滤，滤渣用去离子水洗至中性，60℃烘干保存，不同批次制备的样品混匀备用，即为南荻甲酸（formic acid，FA）纤维素[14]。
2）碱性H2O2处理：取上述制备的南荻FA纤维素1 200 g于20L玻璃反应釜中，加入12L质量分数为2%的NaOH和0.5%的H2O2混合溶液，于70℃、150 r/min条件下反应1.5 h后进行抽滤，滤渣用去离子水洗至中性，60℃烘干保存，不同批次制备的样品混匀备用，即为南荻碱性过氧化氢（alkaline hydrogen peroxide，AHP）纤维素。
1.3.2 组成成分分析
样品纤维素、半纤维素和木质素含量的测定参照美国国家可再生能源实验室（National Renewable Energy Laboratory，NREL）所述方法[18]。取 0.300 0 g 样品置于100 mL三角瓶中，加入3 mL 72%的H2SO4，30℃水浴处理1 h后加入84 mL蒸馏水，于高压蒸汽灭菌锅中反应1 h，反应结束后过滤，收集滤渣和滤液。滤渣105℃烘至恒重，即为酸不溶性木质素；测定滤液在320 nm处吸光度，根据公式计算酸溶性木质素含量；通过高效液相色谱测定滤液中葡萄糖和木糖含量，计算纤维素和半纤维素含量，计算公式如下。
式中：ε为特定波长下摩尔吸光系数，波长320 nm时为30 L/（g·cm）。
1.3.3 结构特征分析
1.3.3.1 傅里叶红外光谱测定
傅里叶红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）用于分析处理前后南荻纤维素官能团变化。将干燥后的样品与KBr于玛瑙研钵中充分研磨后进行压片，压力范围为20 MPa～25 MPa，时间为30 s，扫描 32 次，扫描范围 400 cm-1～4 000 cm-1。
1.3.3.2 X射线衍射分析
60℃干燥后的样品采用X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）进行检测，测量条件：靶材为Cu靶，管压为40 kV，电流40 mA，扫描范围为5°～50°，扫描速度6°/min。纤维素结晶度指数（crystallinity index，CrI）计算公式如下。
式中：I002指衍射角为22.6°附近衍射峰强度；Iam指衍射角为18.0°附近衍射峰强度。
1.3.3.3 扫描电镜分析
采用扫描电镜（scanning electron microscopy，SEM）观察样品表观形态的变化。将60℃干燥的样品放置在载物台上，用导电胶将样品固定、喷金，放置于扫描电镜中，在15 kV～20 kV能量下观察样品的表观形态结构，并记录图像。
1.3.4 酶解特性及酶吸附试验
1.3.4.1 酶解特性测定
酶解体系为10 mL，根据固液比准确称取样品，酶添加量为20 FPU/g，在50℃、150 r/min的条件下酶解反应120 h。分别在酶解不同时期取样，采用高效液相色谱测定酶解液中葡萄糖含量，根据公式（6）计算酶解纤维素转化率。
式中：C1为葡萄糖含量，g/L；0.9为转化系数；M为样品质量，g；C2为纤维素含量，%；W为水分含量，%。
1.3.4.2 酶吸附量测定
经BCA蛋白质检测试剂盒测定纤维素酶中蛋白质含量为0.429 g/L。设置酶吸附体系为10 mL，酶添加量为20 FPU/g纤维素样品（纤维素酶蛋白含量为740.05 mg），分别称取1 g南荻FA纤维素、南荻AHP纤维素分散于吸附体系中，在20℃、150 r/min的条件下吸附0、2、4、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50 min后终止反应，收集滤液和滤渣，测定滤液中蛋白质含量[19]。体系中加入的初始纤维素酶蛋白含量与不同时间吸附后滤液中蛋白含量之差即为样品酶吸附量。每组试验设置3个平行。计算公式如下。
式中：C为样品酶吸附量，g/L；C0为初始酶液质量浓度，g/L；Ct为反应t min后上清液中的酶液质量浓度，g/L。
1.4 数据分析
每组试验进行3个平行，采用SPSS对数据进行统计分析、Origin 2021作图。
2 结果与分析
2.1 组分分析
不同处理的南荻样品组成成分分析如表1所示。
由表1分析可知，南荻秸秆经甲酸分离后，获得的南荻FA纤维素中纤维素含量从41.35%明显提高至76.52%，半纤维素和木质素含量则呈下降趋势；再经碱性H2O2处理后的南荻AHP纤维素中木质素含量下降至3.49%，纤维素含量提高至89.85%。南荻木质纤维素在甲酸分离处理过程中，木质素溶解于甲酸溶液、半纤维素酸解成可溶性木糖和低聚木糖，使得不溶性残渣南荻FA纤维素的含量提高；后续再经碱性H2O2处理，制备的南荻AHP纤维素含量进一步提高，是因为在碱处理过程中大量的木质素被脱除，更加有利于后续酶解反应的进行。
表1 原料及不同处理阶段南荻样品组分变化
Table 1 Components changes in raw materials and samples of Miscanthus lutarioriparius in different processing stages
注：同列字母不同代表具有显著性差异（p＜0.05）。
样品 纤维素含量/% 半纤维素含量/% 木质素含量/%南荻秸秆 41.35±0.08c 19.42±0.04a 19.30±0.15a南荻 FA 纤维素 76.52±0.80b 4.55±0.11b 11.85±0.14b南荻AHP纤维素 89.85±0.04a 3.72±0.17b 3.49±0.12c
2.2 理化结构分析
2.2.1 FTIR分析
南荻秸秆、南荻FA纤维素和南荻AHP纤维素的红外光谱图如图1所示。
图1 不同处理阶段南荻纤维素FTIR光谱
Fig.1 FTIR spectra of Miscanthus lutarioripariu cellulose in different processing stages
由图1分析可知，南荻FA纤维素在1 714 cm-1处出现非共扼羰基特征峰，说明甲酸处理的南荻纤维素发生甲酰化修饰，而南荻AHP中该特征峰消失，说明经碱性H2O2处理后去除了南荻FA纤维素中的甲酰基[17]。与南荻FA纤维素相比，南荻AHP纤维素在1 515 cm-1和1 251 cm-1的红外吸收峰消失，说明碱性H2O2可以进一步脱除南荻样品的木质素。3 353 cm-1和2 899 cm-1分别为—OH和C—H伸缩振动特征峰，1 317、1 165、1 062 cm-1的吸收峰为纤维素的特征峰，899 cm-1是纤维素β-糖苷键的特征峰，经不同处理后样品这些特征峰变化较小，表明南荻样品经甲酸联合碱性过氧化氢处理后，其纤维素的基本结构保留完整[20-21]。
2.2.2 XRD分析
结晶度指数一般用于表征纤维素的有序性，对于秸秆材料来说，结晶度指数越高，强度、硬度越大，溶胀性小，就越不利于酶解[22-23]。南荻秸秆及不同处理阶段获得的南荻纤维素样品X-衍射光谱图如图2所示。
图2 不同处理阶段南荻纤维素的XRD光谱
Fig.2 XRD spectra of Miscanthus lutarioripariu cellulose in different processing stages
由图2分析可知，南荻原料结晶度指数为51.21%，经甲酸分离获得的南荻FA纤维素结晶度指数升高至67.39%，是由于甲酸处理去除了南荻原料中大量的木聚糖和木质素，使得材料中纤维素含量增加，因此，结晶区纤维素的含量相应增加。与FA纤维素相比，南荻AHP纤维素结晶度指数又降至61.20%，是因为经碱性H2O2的氧化处理，使纤维素形态结构改变、溶胀效应增加，氢键发生破坏，从而导致结晶度指数下降。然而，南荻秸秆经过预处理后，保留了其中90%的纤维素，使得纤维素中无定型区氢键增加，结晶区有序性也增大，因此南荻AHP纤维素的结晶度指数高于南荻秸秆原料。
2.2.3 SEM分析
南荻秸秆、南荻FA纤维素和南荻AHP纤维素扫描电镜图如图3所示。
由图3a可知，未经处理的南荻秸秆结构完整，表面较光滑。图3b显示甲酸法分离获得的南荻FA纤维素表面变得粗糙并伴有不规则颗粒，在样品表面观察到规则的纤维纹路，经碱性H2O2处理后的南荻AHP纤维素表面纤维结构更加明显，且纹路更清晰（图3c），说明甲酸分离和碱性H2O2处理脱除了南荻大部分的木质素和木聚糖，使更多纤维素暴露出来，大大增加其与纤维素酶的接触几率[24]。
图3 不同处理阶段南荻纤维素的SEM图
Fig.3 SEM images of Miscanthus lutarioripariu cellulose in different processing stages
2.3 酶解特性研究
2.3.1 酶解转化率研究
不同底物浓度的南荻秸秆酶解转化率和酶解液中葡萄糖浓度如图4所示。
图4 不同底物浓度下南荻秸秆酶解后的葡萄糖浓度和纤维素酶解转化率
Fig.4 Glucose concentration and cellulose conversion rate after enzymatic hydrolysis of Miscanthus lutarioripariu straw with different substrate concentration
由图4a、4b分析可知，南荻秸秆酶解120 h，酶解液中葡萄糖含量随着纤维素底物浓度的升高相应增加；但不同底物浓度的纤维素酶解转化率无明显变化，且均低于12%，说明未经处理的南荻秸秆木质纤维素结构致密，纤维素很难被酶和微生物作用，从而导致纤维素酶解转化率相对较低；而酶解液中葡萄糖浓度的增加主要来源于底物浓度的升高。
不同底物浓度的南荻FA纤维素酶解葡萄糖含量以及纤维素酶解转化率的变化如图5所示。
图5 不同底物浓度下南荻FA纤维素酶解后的葡萄糖浓度和纤维素酶解转化率
Fig.5 Glucose concentration and cellulose conversion rate after enzymatic hydrolysis of Miscanthus lutarioripariu FA cellulose with different substrate concentration
由图5a可知，酶解120 h、底物浓度为5%时，南荻FA纤维素的纤维素酶解转化率最高，达到61.87%，随着底物浓度的增加，纤维素酶解转化率逐渐降低，当底物浓度为20%时，降低至45.32%；且底物浓度为15%和20%南荻FA纤维素的纤维素酶解转化率不存在明显差异；南荻FA纤维素酶解液中葡萄糖浓度随着底物浓度的升高呈逐渐增加趋势，20%底物浓度酶解120 h，葡萄糖浓度达到最高值75.51 g/L（图5b）。
南荻AHP纤维素酶解葡萄糖含量以及纤维素酶解转化率随底物浓度的变化如图6所示。
图6 不同底物浓度下南荻AHP纤维素酶解后的葡萄糖浓度和纤维素酶解转化率
Fig.6 Glucose concentration and cellulose conversion rate after enzymatic hydrolysis of Miscanthus lutarioripariu AHP cellulose with different substrate concentration
由图6可知，南荻AHP纤维素的纤维素酶解转化率和葡萄糖浓度均在24 h内迅速增加，然后随着酶解时间的继续延长呈平缓上升趋势；当底物浓度为5%时，南荻AHP纤维素的纤维素酶解转化率可达95.54%（图6a），说明在低底物浓度时，纤维素基本被全部酶解；当底物浓度为20%时，南荻AHP纤维素酶解120 h葡萄糖浓度可达133.17 g/L，此时纤维素酶解转化率为68.87%，明显高于南荻FA纤维素。说明碱性H2O2对南荻FA纤维素的纤维素酶解转化率的提高具有很好的效果，是因为碱性H2O2处理脱除了南荻FA纤维素的甲酰基，增加了其溶解性，从而促进纤维素和纤维素酶的有效吸附，使得酶解效果更好。
2.3.2 纤维素酶吸附特性研究
南荻FA纤维素和南荻AHP纤维素对纤维素酶的吸附曲线如图7所示。
图7 不同处理阶段的南荻纤维素对纤维素酶的吸附
Fig.7 Adsorption of cellulase on Miscanthus lutarioripariu cellulose in different processing stages
由图7a可知，随着时间的延长，南荻FA纤维素和南荻AHP纤维素对纤维素酶的吸附量逐渐增加，当吸附时间为45 min时，它们对纤维素酶的吸附量分别为19.75 mg/g和14.00 mg/g，随着吸附反应的进行，纤维素样品对纤维素酶的吸附量无明显增加，说明此时样品对纤维素酶的吸附达到饱和。由前期南荻FA纤维素和南荻AHP纤维素的酶解试验可知，南荻AHP纤维素的转化率要明显高于南荻FA纤维素，这是因为南荻FA纤维素中木质素含量较高，木质素与纤维素之间竞争结合占据纤维素酶的结合位点，而木质素对纤维素酶的吸附为无效吸附，是导致南荻FA纤维素酶解转化率低的原因，这与黄丽菁等[25]提出的木质素占据纤维素酶的结合位点，影响纤维素酶水解的结论一致。由图7b分析可知，南荻FA纤维素和南荻AHP纤维素酶吸附后，在1 641 cm-1处出现新的肽键C—N伸缩振动峰，此特征峰与蛋白质的二级结构相关[26-27]，说明南荻纤维素样品与纤维素酶之间发生了吸附现象。
3 结论
南荻秸秆经过甲酸联合碱性H2O2处理制备的南荻AHP纤维素，脱除了南荻秸秆中大量的木质素和半纤维素，其纤维素含量（89.85%）显著高于南荻FA纤维素（76.52%）。经碱性H2O2处理消除了甲酸分离过程中形成的甲酰化结构，更加有利于南荻纤维素与纤维素酶的有效吸附，促进酶解转化率的提高和酶解体系中葡萄糖浓度增加。在高底物浓度（20%）条件下酶解120 h，南荻AHP纤维素的酶解转化率可达到68.82%，酶解液中葡萄糖浓度为133.08 g/L，明显优于南荻FA纤维素和南荻秸秆的酶解效果。然而，本试验所制备的糖液还有待进行脱毒、脱色以及安全性评价，并进一步探索其在食品发酵以及食品添加剂等领域的研究应用。
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