免疫力是机体自身防御能力，恶性肿瘤、慢性肾炎、风湿等重大疾病的发生发展都与人体免疫失调密切相关[1-2]。因此维持机体免疫平衡至关重要。食源性生物活性肽是一类含有2个～20个氨基酸残基的多肽混合物，通常由特定食物蛋白经酶解等方法制备得到。近年来，越来越多的研究表明，食源性生物活性肽除具有明确的营养价值之外，还可以通过多种机制调节机体免疫力，促进人体健康[3-4]。如紫苏籽蛋白可以通过增加免疫低下小鼠的脾脏和胸腺指数、促进T/B淋巴细胞的增殖、提高半数溶血值、自然杀伤细胞杀伤力、巨噬细胞吞噬能力及白细胞介素（interleukin，IL）-2含量等从而发挥其免疫调节作用[5]。Li等[6]发现从蚕蛹蛋白水解物中分离出的多肽可以促进脾淋巴细胞增殖，刺激IL-6、IL-12等免疫因子的产生，具有免疫调节活性。因此，利用食源性生物活性肽促进机体免疫平衡是一种有效的方法，同时也为抵抗疾病侵袭提供了一种有益的选择。
黄牛骨肽（cattle bone peptide，CBP）是一种以秦川牛、南阳牛等牛骨骼为来源制备得到的食源性生物活性肽，具有来源广泛，易消化吸收，营养价值高、抗原性弱等优点，在食品领域具有广泛应用[7-10]。已有研究表明，包括CBP在内的来源于动物骨骼的生物活性肽通常具有调节骨代谢、抗骨质疏松等生物活性[11-12]。基于分子水平的研究发现，骨肽抵抗骨质疏松的作用机制与核因子 κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路密切相关[13-15]，而NF-κB信号通路在免疫系统中起着至关重要的作用，这表明动物骨肽或许具有一定免疫调节功能。有研究发现来源于猪骨、羊骨或牦牛骨的生物活性肽具有一定的免疫调节活性[16-18]，但是关于CBP的免疫调节活性鲜有报道。
本研究以CBP为原料，基于巨噬细胞RAW264.7和氢化可的松所致免疫低下小鼠分别在细胞水平和动物水平考察其免疫调节活性，检测指标包括细胞增殖率、小鼠的体质量变化、相对免疫器官指数、外周血白细胞相对数量、碳廓清能力、吞噬荧光微球能力、耳肿胀法迟发型变态（delayed type hypersensitivity，DTH）反应。本研究将为CBP的免疫调节作用提供数据支撑，也为CBP在食品及医药领域的进一步应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
小鼠源巨噬细胞株RAW264.7：郑州大学药学院保存；SPF级雄性BALB/c小鼠，6周～8周龄，体质量（18±2）g，生产许可证号：SCXK（豫）2017～0001。
CBP（新鲜牛骨经生物酶降解制得的生物活性肽，平均分子量为962.0 Da）：安徽国肽生物科技有限公司；氢化可的松（hydrocortisone，HCT）注射液：山西省芮城县红宝兽药有限责任公司；二硝基氟苯（2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB）：上海凛恩科技发展有限公司；绵羊红细胞（sheep red blood cell，SRBC）、DMEM培养基、噻唑蓝[3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]：北京索莱宝科技有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）：武汉赛维尔生物科技有限公司；胎牛血清：浙江天行生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
倒置显微镜（IX53型）：日本Olympus公司；全自动血液分析仪（BC-2800）：上海泰益医疗仪器设备有限公司；CO2细胞培养箱（E191型）：美国SIM公司；全波长酶标仪（Spectra Mr型）：美国DYNEX公司；紫外分光光度计（UV-2600）：日本SHIMADZU公司；流式细胞仪（FACS Calibur型）：美国BD公司。
1.3 方法
1.3.1 CBP对RAW264.7细胞增殖的影响
将指数生长期的RAW264.7细胞消化为单细胞悬液，以 1.000×104个/孔接种于 96孔板中，于 37℃，5%CO2细胞培养箱中过夜培养，弃去旧培养基，分别加入含 1.6、8.0、40.0、200.0、1 000.0 μg/mL CBP 的培养基100 μL，空白对照组加入100 μL未含有CBP的培养基，每组5个复孔。将细胞继续正常培养24 h，采用MTT法检测细胞增殖率。
1.3.2 CBP对RAW264.7细胞吞噬作用的影响
将RAW264.7细胞在含不同浓度CBP（浓度范围同1.3.1）的培养基中常规培养24 h后，按照每孔100 μL的剂量加入含0.05%中性红的无菌PBS溶液，置于培养箱中继续培养4 h，PBS溶液洗涤3次，每孔加入200 μL 细胞裂解液（无水乙醇∶乙酸=1∶1，体积比），于4℃静置过夜，细胞完全裂解后于540 nm处测定OD值，按照以下公式计算吞噬率。其中空白对照组为不经CBP处理组。
1.3.3 动物分组与给药
实验动物均饲养于20℃～26℃、明暗周期12 h/12 h的恒温恒湿室内，实验期间，正常饲喂，自由饮水。48只BALB/c小鼠适应性喂养一周后，按体质量随机分为4组，每组12只，分笼饲养。按照人体推荐量的1倍、5倍和10倍设置CBP低（CBP-L）、中（CBP-M）、高（CBP-H）剂量干预组，剂量分别为 1.20、6.00、12.00g/kg，并以给予与给药组相同体积生理盐水为免疫低下对照组（HCT），每日口服灌胃给药一次，共连续干预30 d。在CBP干预的第21天，各组小鼠分别按照40.00 mg/kg隔天肌肉注射氢化可的松，共注射5次，建立免疫低下小鼠模型。末次给药结束后，各组小鼠禁食不禁水12h，进行后续指标的检测。
1.3.4 小鼠相对体质量变化及免疫器官相对脏器指数
实验期间，每3 d对各组小鼠进行称重并记录，相对体质量为各组小鼠的体质量与HCT组小鼠体质量均值的比值。实验结束后，脱颈椎处死小鼠，剥离胸腺、脾脏组织，生理盐水清洗干净后用滤纸将水分吸干并进行称重，按照以下公式计算脏器指数。相对脏器指数为各组小鼠的脏器指数与HCT组小鼠脏器指数均值的比值。
1.3.5 小鼠外周血白细胞计数
由小鼠眼眶静脉丛采血，利用血液分析仪对各组小鼠外周血白细胞进行计数分析，小鼠的相对白细胞数量为各组的白细胞数量与HCT组白细胞数量均值的比值。
1.3.6 小鼠碳廓清能力的测定
参考文献[19]中方法，将墨汁稀释液按照0.1mL/10 g的剂量经尾静脉注射至各小鼠体内，分别于注射后2 min和10 min时，由小鼠眼眶静脉丛采血20.0 μL，加入2.00 mL Na2CO3溶液，涡旋混匀。用紫外分光光度计测定600 nm波长处的吸光度。小鼠脱颈椎处死后，剥离肝脏和脾脏，生理盐水清洗干净后用滤纸将水分吸干并称量。按照下列公式计算吞噬指数a，相对吞噬指数为各组小鼠的a与HCT组小鼠a均值的比值。
式中：k为吞噬速率（未经校正的吞噬指数）；A1、A2分别是2 min和10 min的吸光度；t1=2 min，t2=10 min。
1.3.7 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球实验
小鼠处死前4 d，经腹腔注射0.2 mL 2.0%SRBC。脱颈椎处死后提取腹腔巨噬细胞，以2.000×105个/孔接种于12孔板中，常规培养过夜后，更换为含荧光微球新鲜培养基继续培养2 h，弃去培养基，PBS洗涤3次，使巨噬细胞重悬于1.00 mL PBS内，采用流式细胞仪进行检测，荧光微球相对吞噬率为各组小鼠巨噬细胞荧光微球吞噬率与HCT组小鼠巨噬细胞荧光微球吞噬率均值的比值。
1.3.8 耳肿胀法DTH反应
参考文献[19]中方法，小鼠腹部经脱毛处理后，均匀涂抹50.0 μL DNFB进行致敏。5 d后，在小鼠右耳内外均匀涂抹10.0 μL DNFB进行攻击。24 h后，处死小鼠，取下小鼠左右耳壳，用打孔器取下直径约8 mm的耳片，称量，以两侧耳片质量的差值表示DTH程度，相对耳肿胀度为各组小鼠的耳肿胀度值与HCT组小鼠耳肿胀度值均值的比值。
1.3.9 血清溶血素的测定
参考文献[20]中方法，利用2.0%SRBC对小鼠进行腹腔免疫，4 d后，通过眼眶静脉丛采血，经生理盐水倍比稀释后，分别取100.0 μL加入微量血凝实验板内，随后加入100.0 μL 0.5%SRBC并混匀。37℃恒温孵育3 h后，观察血球凝集程度并计算抗体积数。抗体积数越大，表示小鼠体内抗体水平越高。
血球凝集程度分为5级（0～Ⅳ），0级：红细胞全部下沉，在孔底集中并形成致密圆点状，周围液体清晰。Ⅰ级：红细胞大部分沉集在孔底成圆点状，周围有少量凝集的红细胞。Ⅱ级：凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心有一个明显疏松的红点。Ⅲ级：凝集的红细胞均匀地铺散在孔底形成一薄层，中心隐约可见一个小红点。Ⅳ级：凝集的红细胞均匀地铺散在孔底形成一薄层，凝块有时可成卷折状。依据下列公式计算抗体积数。相对抗体积数为各组小鼠的抗体积数与HCT组小鼠抗体积数均值的比值。
抗体积数=（S1+2S2+3S3+……nSn）
式中：1、2、3……n分别代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别。
1.4 数据统计与分析
采用Origin 2019b软件进行统计学分析和图表绘制，处理所得数据用平均值±标准差表示，采用t检验比较组间差异，P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 CBP的体外免疫活性
巨噬细胞是构成机体免疫系统的重要细胞，主要通过其吞噬功能对机体的非特异性免疫进行调节，也是用于检测食源性生物活性肽是否具有免疫调节活性的主要细胞模型[21-22]。因此首先以巨噬细胞株RAW264.7为模型，通过体外细胞实验对CBP的免疫调节活性进行初步探究。体外免疫实验中，与空白对照组相比，不同剂量的CBP对巨噬细胞的增殖能力和吞噬能力均有不同程度的促进作用，具体结果如图1所示。
图1 CBP对RAW264.7细胞增殖和吞噬能力的影响
Fig.1 Effects of CBP on the proliferation and phagocytosis of RAW264.7 cells
a.细胞增殖率；b.细胞吞噬率；与空白对照组相比，*表示差异显著，P<0.05，**表示差异极显著，P<0.01，***表示差异高度显著，P<0.001。
由图1a可知，与空白对照组相比，CBP在1.6μg/mL～1 000.0 μg/mL浓度内均能够显著增强RAW264.7细胞的增殖活性。当浓度为40.0 μg/mL时，巨噬细胞增殖率最高，可达（123.9±6.5）%。此外，由图 1b可知，CBP可以提高RAW264.7细胞的吞噬能力，且呈剂量依赖性增长，当浓度增加至1 000.0 μg/mL时，其吞噬率为空白对照组的1.920倍。表明CBP能够促进免疫相关巨噬细胞的增殖作用，且可以增强巨噬细胞的吞噬作用，在体外细胞水平具有一定的免疫调节活性，之后在动物水平对CBP的免疫调节作用进行考察。
2.2 小鼠的生长状况
不同剂量的CBP对免疫低下小鼠生长状况的影响情况如图2所示。
图2 CBP对小鼠生长状况的影响
Fig.2 Effects of CBP on growth of mice
a.小鼠相对体质量变化曲线；b.小鼠体质量增长率；与HCT组相比，*表示差异显著，P<0.05。
体质量变化是反映机体健康状态的一个重要指标，通常免疫力低下都会伴随着体质量下降。如图2a所示，免疫抑制之前，各组小鼠相对体质量随时间延长不断增加。第21天，经肌肉注射免疫抑制剂氢化可的松后，各组小鼠相对体质量均明显下降。由图2b可知，第30天时，与免疫低下对照组相比，CBP中剂量组和高剂量组的小鼠相对体质量显著增加（P<0.05），增长率分别为（110.74±9.20）%和（113.65±14.43）%。因此，CBP可以改善氢化可的松对体质量的抑制作用，延缓小鼠体质量下降，有助于改善小鼠的免疫功能。
2.3 CBP对小鼠免疫器官脏器指数的影响
不同剂量的CBP对免疫低下小鼠免疫器官的影响情况如图3所示。
图3 免疫组织相对脏器指数
Fig.3 Relative organ index of immune tissues
a.相对脾脏指数；b.相对胸腺指数；与HCT组相比，*表示差异显著，P<0.05，** 表示差异极显著，P<0.01。
脏器指数，尤其是免疫器官脏器指数的变化能直接反映机体免疫功能的改变[23-24]。脾脏和胸腺是机体内重要的免疫器官，其脏器指数的变化能够有效反映机体免疫状态。如坛紫菜中分离的R-藻红蛋白肽可以通过提高小鼠的脾脏和胸腺指数改善免疫低下小鼠的免疫活性[25]。由图3可知，与免疫低下对照组相比，CBP中剂量组（P<0.01）和高剂量组小鼠（P<0.05）的相对脾脏指数显著增加，相对胸腺指数也表现出相似的显著性差异（P<0.05）。结果表明，CBP可以改善免疫低下小鼠的脾脏指数和胸腺指数，这有助于改善免疫低下小鼠的免疫调节能力。
2.4 CBP对小鼠非特异性免疫的影响
不同剂量的CBP对免疫低下小鼠白细胞相对数量的影响情况如图4所示。
由图4可知，CBP处理组小鼠白细胞相对数量呈剂量依赖性增长，与免疫低下组小鼠相比，中剂量组（P<0.05）和高剂量组（P<0.01）小鼠白细胞相对数量显著增加。实验结果表明CBP可以增加免疫低下小鼠的白细胞数量，改善小鼠的非特异性免疫调节能力。
图4 小鼠白细胞相对数量
Fig.4 Relative count of white blood cells in mice
与HCT组相比，*表示差异显著，P<0.05，**表示差异极显著，P<0.01。
巨噬细胞是除淋巴细胞外免疫系统中另一主要的细胞群，其吞噬能力越强，说明细胞的免疫活性越强。有研究发现骨酶解产物可以提高吞噬细胞清除碳颗粒能力，这是衡量生物活性肽非特异性免疫调节活性的重要指标[17]。因此，本研究重点考察基于腹腔巨噬细胞的免疫调节活性，采用小鼠碳廓清实验和腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球实验考察小鼠单核/巨噬细胞的吞噬能力，进而探究CBP对小鼠非特异性免疫的影响。不同剂量的CBP对免疫低下小鼠单核/巨噬细胞吞噬能力的影响见图5。
图5 CBP对小鼠非特异性免疫的影响
Fig.5 Effects of CBP on non-specific immunity of mice
a.小鼠巨噬细胞相对吞噬指数；b.小鼠荧光微球相对吞噬率；与HCT组相比，*表示差异显著，P<0.05，**表示差异极显著，P<0.01，***表示差异高度显著，P<0.001。
由图5a可知，CBP低、中、高剂量组的相对吞噬指数均高于免疫低下对照组，呈剂量依赖性，且低剂量组（P<0.05）与高剂量组（P<0.001）具有显著差异，说明CBP可提高小鼠腹腔巨噬细胞的碳廓清能力。由图5b可知，CBP中剂量组和高剂量组的腹腔巨噬细胞的荧光微球相对吞噬率显著高于免疫低下对照组（P<0.01），且呈现剂量依赖关系。结果表明，CBP可使免疫低下小鼠单核/巨噬细胞的吞噬、清除异物的能力增强，改善免疫低下小鼠的非特异性免疫功能。
2.5 CBP对小鼠特异性免疫的影响
当机体与特异性抗原接触后，响应性地产生针对该抗原的特异性免疫，该类免疫应答也称为适应性免疫，主要由T淋巴细胞和B淋巴细胞介导完成，是机体抵抗病原体感染的主要方式[26-27]。迟发型变态反应是T细胞介导的一种细胞免疫应答，其反应强度反映了机体细胞免疫应答水平。不同剂量的CBP对免疫低下小鼠特异性免疫功能的影响见图6。
图6 CBP对小鼠特异性免疫的影响
Fig.6 Effects of CBP on specific immunity of mice
a.小鼠相对耳肿胀度；b.小鼠相对抗体积数；与HCT组相比，*表示差异显著，P<0.05，***表示差异高度显著，P<0.001。
由图6a可知，CBP组小鼠的相对耳肿胀程度均高于免疫低下对照组，虽无显著性差异，但呈剂量依赖性增长。血清溶血素抗体水平反映小鼠体液免疫功能，以抗体积数表示血清溶血素的水平，抗体积数越高表明小鼠的特异性体液免疫能力越强。由图6b可知，与免疫低下对照组相比，CBP高剂量组（P<0.001）和中剂量组（P<0.05）小鼠相对抗体积数显著增加。结果表明，CBP能提高机体的特异性体液免疫功能，改善小鼠的特异性免疫功能。
3 讨论与结论
研究结果表明，黄牛骨肽（cow bone peptide，CBP）可促进RAW264.7细胞的增殖及吞噬作用，证明了其在体外细胞水平具有一定的免疫调节活性，而后系统考察CBP对免疫低下小鼠的免疫调节活性。机体免疫应答是一个非常复杂的过程，一般可以分为固有免疫和适应性免疫。固有免疫是机体抵抗病原体的首道防线，主要是皮肤及黏膜的物理阻挡作用，以及非特异性免疫效应细胞和免疫分子对抗原的清除作用[28]。改善固有免疫是食源性生物活性肽发挥免疫调节的最主要方式。如猪骨活性肽可以显著促进小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性[16]；山药蛋白肽可以提高免疫低下小鼠的体质量及免疫器官指数[29]。研究结果表明CBP可以缓解由于免疫抑制造成的小鼠体质量下降，增加小鼠相对脾脏指数和胸腺指数，提高外周血中白细胞相对数量，与猪骨活性肽和山药蛋白肽的免疫调节活性相似。此外，与免疫低下组小鼠相比，高剂量CBP组小鼠的碳廓清能力及荧光微球吞噬能力可提高至1.43倍和1.44倍，显著增加腹腔巨噬细胞活性。充分表明CBP具有较好的固有免疫调节活性。部分食源性生物活性肽在强化机体固有免疫的同时，可以激活机体适应性免疫[30-31]。如牦牛骨生物活性肽可以有效缓解环磷酰胺引起的小鼠免疫力下降，除小鼠脏器指数、白细胞计数等非特异性免疫指标明显改善之外，B细胞介导的免疫球蛋白A、免疫球蛋白G含量，以及IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α等细胞因子含量也明显升高，表明牦牛骨肽可以通过激活小鼠适应性免疫应答表现其免疫调节活性。本研究结果中，与免疫低下小鼠相比，中剂量和高剂量组CBP小鼠的血清溶血素抗体水平显著增加，表现出明显的体液免疫活性。以相对耳肿胀度为指标的细胞免疫活性并没有显著变化。表明CBP可能通过体液免疫调节小鼠适应性免疫应答活性。综上所述，CBP在体内外均有较好的免疫调节活性，为CBP的进一步开发利用提供了理论依据。
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