桑葚是桑科、桑属、植物桑的成熟果实，新鲜的桑葚不仅含有大量的游离酸、氨基酸、葡萄糖、矿物质、微量元素等营养物质[1]，还含有花青素、多糖、维生素C、1-脱氧野尻霉素、白藜芦醇等生物活性物质，有明目、保肝、清除自由基、降血压等重要作用[2-3]。由于桑葚成熟期集中、采收不易、果皮薄、果实较软等原因，使得桑葚保鲜和储藏性较差，在室温下很快变色、变质。因此，桑葚常被加工成桑葚干、桑葚酒、桑葚饮料、果浆等产品，以增加产品附加值和延长货架期。桑葚及其加工产品是我们生活中常见的富含花青素的食品，桑葚中的花青素主要为矢车菊素[4]，花青素具有抗癌、抗炎、降血脂、保护视力、美容等功效，在食品、药品和化妆品等领域应用广泛[3]。但不同加工方式对花青素含量及稳定性有不同的影响，温度、光照、氧化等因素都会影响花青素的稳定性[5]。研究发现，25℃是花青素最稳定的温度，当温度升高到60℃时，花青素就会以查尔酮式结构存在，稳定性变差，颜色变为无色[5]。谢程程等[6]的研究表明长时间光照也会诱导花青素碳骨架C2位断开，形成C4羟基的降解产物，之后被氧化为查耳酮，查耳酮进一步被氧化为苯甲酸及2，4，6-三羟基苯甲醛等水解产物，导致花色苷降解。近年来，我国已有关于蓝莓[7]、蔓越莓[8]、紫薯[9]等植物花青素的研究，而关于桑葚花青素的研究主要集中于提取和纯化方面[10-12]，缺少有关桑葚花青素的稳定性研究，而研究桑葚花青素在不同产品中的稳定性对其加工质量的表征有重要意义。
本文研究光照、温度、氧化剂H2O2和还原剂Na2SO3对桑葚干和桑葚酒中花青素的影响，比较桑葚干和桑葚酒提取物清除DPPH、ABTS+自由基能力，探究表征桑葚花青素稳定性的指标，比较桑葚花青素在不同样品中的稳定性，以期为桑葚的加工利用和桑葚花青素的研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
桑葚干、桑葚酒（桑葚品种为无核大十）：圣源酒业有限公司。桑葚酒制备工艺要点：桑葚→榨汁→发酵→过滤→陈酿→过滤→灭菌→桑葚酒。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazide，DPPH）、2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：美国 Sigma-Aldrich 公司；维生素 C（VC）、没食子酸（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；福林酚：北京索莱宝科技有限公司；乙醇、盐酸、乙醛、H2O2溶液、Na2SO3（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
数显恒温水浴锅（HH-2）：国华电器有限公司；紫外-可见分光光度计（岛津UV-1500型）：杭州库仑科技有限公司；pH计（FE20）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；高速冷冻离心机（H1850R）：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；旋转蒸发器（RE-52A）：上海亚荣生化仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 样品制备
桑葚干在室温（25℃）避光条件下充分研磨、冻干后得桑葚干粉末。取桑葚干粉末和桑葚酒，50℃黑暗条件下按料液比1∶20（质量比）用酸性乙醇[0.1%盐酸∶95%乙醇=40∶60（体积比）]浸提 2 次，每次 90 min，合并2次浸提液，4℃下10 000 r/min离心15 min，浸提液真空抽滤除渣，滤液用旋转蒸发器在40℃下浓缩，浓缩液冷冻干燥后得桑葚干和桑葚酒花青素提取物[13]。分别称取两种提取物用4倍质量的酸性乙醇定容，得桑葚干和桑葚酒花青素提取液，用于各指标测定。
1.3.2 pH示差法测花青素含量
准确量取桑葚干和桑葚酒花青素提取液0.5 mL至10 mL容量瓶中，分别用pH值为1.0和4.5的缓冲液定容至10 mL，置于30℃水浴40 min，冷却至室温。以蒸馏水为空白对照，分别在519 nm和700 nm处测吸光值，以矢车菊素-3-葡萄糖苷计，按照Fuleki公式计算花青素含量[14]。
式中：ΔA为桑葚干和桑葚酒花青素提取液的吸光值差；A519 nm为样品在519 nm处的吸光值；A700 nm为样品在700 nm处的吸光值；c为桑葚干和桑葚酒中花青素含量，mg/100 g；DF 为稀释倍数，20；M 为矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量，449.2 g/mol；ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷的消光系数，26 900 L/（mol·cm）；L为光程，1 cm。
1.3.3 桑葚干和桑葚酒中不同类型花青素占比的测定
将桑葚干和桑葚酒花青素提取液pH值调至3.6，分别取2 mL提取液加入20%的乙醛20 μL，摇匀静置45 min，另取2mL提取液加入5%的Na2SO3溶液160 μL，另取100 μL桑葚干和桑葚酒提取液加入1 900 μL酒石酸缓冲液，分别在520 nm处测定吸光值，按以下公式计算聚合型、辅色型和游离型花青素占比[15]。
式中：A1为加入乙醛后桑葚干和桑葚酒花青素提取液在520 nm处的吸光值；A2为加入Na2SO3溶液后桑葚干和桑葚酒花青素提取液在520 nm处的吸光值；A3为加入酒石酸缓冲液后桑葚干和桑葚酒花青素提取液在520 nm处的吸光值。
1.3.4 多酚含量的测定
参照刘馥源等[16]的方法略作改进，以没食子酸为标准品，采用Folin-Ciocalteu法[17]进行多酚含量的测定。精确称取10 mg没食子酸标准品，待完全溶解后定容至50 mL，得到浓度为0.2mg/mL的没食子酸标准溶液。依次吸取标准溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，并用蒸馏水加至1mL后加入1mL福林酚试剂，摇匀后避光静置6 min，再加入5 mL 5%碳酸钠溶液，充分混合后定容至25 mL避光放置1 h，在760 nm处测定各溶液的吸光值，绘制标准曲线。取桑葚干和桑葚酒花青素提取液按上述方法测定760nm处的吸光值，并根据标准曲线（方程y=0.1249x+0.0372，R2=0.9984）计算其多酚含量。
1.3.5 花青素稳定性比较
1.3.5.1 光照及光照时间对花青素的影响
取10 mL桑葚干和桑葚酒花青素提取液于离心管中，密封后室温（25℃）置于光照度为600 lx的白炽灯下，每天相同时间测定花青素含量，连续测定5 d。
1.3.5.2 温度及保温时间对花青素的影响
取10 mL桑葚干和桑葚酒花青素提取液于离心管中，密封避光置于60℃水浴锅中，每1 h测定花青素含量，连续测定5 h。
1.3.5.3 氧化剂H2O2对花青素的影响
向装有10 mL桑葚干和桑葚酒花青素提取液的离心管中分别加入 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 质量分数为5%的H2O2溶液，密封后室温（25℃）避光静置2 h，测定花青素含量。
1.3.5.4 还原剂Na2SO3对花青素的影响
向装有10 mL桑葚干和桑葚酒花青素提取液的离心管中分别加入 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 质量分数为5%的Na2SO3溶液，密封后室温（25℃）避光静置2 h，测定花青素含量。
1.3.5.5 DPPH自由基清除率的测定
分别称取桑葚干和桑葚酒花青素提取液，用无水乙醇配制浓度为 1、2、3、4、5、10 mg/mL 的样品溶液，分别量取2 mL样品溶液加入到装有2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液的离心管中，空白组加入2 mL无水乙醇和2 mL对应浓度的样品溶液，VC为阳性对照，室温（25℃）避光静置30 min，517 nm处测定吸光值。计算自由基清除率和半数抑制率浓度（IC50）[18]。
式中：A1为加入样品后的吸光值；A2为空白组吸光值；A3为阳性对照组吸光值。
1.3.5.6 ABTS+自由基清除率的测定
将7 mmol/L ABTS溶液与140 mmol/L过硫酸钾按体积比250∶11混合，室温（25℃）避光静置24h，得ABTS储备液。储备液用0.1 mol/L磷酸缓冲液稀释，使其在734nm处的吸光值为0.70±0.02，得ABTS工作液[8]。称取桑葚干和桑葚酒花青素提取液，用无水乙醇配制质量浓度为 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL 的样品溶液，分别量取2mL样品溶液加入到装有8mLABTS工作液的离心管中，空白组加入8mL无水乙醇和2mL对应浓度的样品溶液，VC为阳性对照，室温（25℃）避光静置8 min，734 nm处测定吸光值。计算自由基清除率和IC50[18]。
式中：A1为加入样品后的吸光值；A2为空白组吸光值；A3为阳性对照组吸光值。
1.4 数据处理
试验数据用平均值±标准差表示，使用Origin 2021软件作图，IBM SPSS Statistics 26进行单因素方差分析，Duncan's法进行显著性分析，双变量简单相关进行Pearson相关系数计算以及差异显著性检验，p<0.05为显著性差异判别标准。
2 结果与讨论
2.1 桑葚干和桑葚酒中不同类型花青素含量比较
桑葚干和桑葚酒中不同类型花青素占比如图1所示。
图1 桑葚干和桑葚酒中不同类型花青素占比
Fig.1 Proportion of different types of anthocyanin in dried mulberry and mulberry wine
不同大写字母表示相同产品不同花青素类型差异显著（p<0.05）；不同小写字母表示相同花青素类型不同产品差异显著（p<0.05）。
由图1可知，两种产品中聚合型花青素含量最高，辅色型花青素次之，游离型花青素含量最低。桑葚干中聚合型花青素占比47.91%，辅色型花青素占比26.94%，游离型花青素占比25.15%。桑葚酒中三者分别占比62.93%，25.68%，11.39%。桑葚酒中聚合型花青素占比显著高于桑葚干（p<0.05），而游离型花青素占比显著低于桑葚干（p<0.05），辅色型花青素占比无显著差异（p>0.05）。说明桑葚经发酵后聚合型花青素占比增加，游离型花青素占比减少。研究表明，在葡萄酒贮藏过程中游离型花青素与辅色型花青素之间存在化学平衡，游离型花青素也可以反应生成聚合型花青素[15]。所以推测在桑葚酒中可能也存在类似现象，此结果可能会造成两种产品中花青素稳定性的差异。
2.2 多酚含量比较
桑葚干和桑葚酒花青素提取物中多酚含量如图2所示。
图2 桑葚干和桑葚酒中多酚含量
Fig.2 Polyphenol content in dried mulberry and mulberry wine
小写字母相同表示差异不显著（p>0.05）。
由图2可知，桑葚酒花青素提取物中多酚含量略高于桑葚干，但两者无显著差异（p>0.05）。此结果表明，桑葚干和桑葚酒中的花青素表现出对光照、温度、氧化剂和还原剂的稳定性、对自由基清除能力的差异与多酚含量关系不大。
2.3 花青素稳定性比较
2.3.1 光照及光照时间对花青素的影响
光照及光照时间对花青素的影响如图3所示。
由图3可知，光照条件下，桑葚干和桑葚酒提取物中花青素含量逐渐减少。第1天开始桑葚干和桑葚酒中花青素含量存在显著差异（p<0.05），5 d后，桑葚酒提取物中花青素含量显著高于桑葚干。因为光照会导致花青素碳骨架的C2位断开，花青素被氧化为苯甲酸及苯甲醛等产物[19]。本试验发现光照条件下，桑葚干提取物中花青素含量低于桑葚酒提取物，这是因为桑葚酒中的花青素与发酵过程中的糖代谢产物或有机酸的脱羧产物通过加成反应生成更稳定的吡喃型花青素，吡喃型花青素在C4位与C5位之间形成吡喃环而处于稳定结构，保护花青素不易受外界条件影响[20]。
图3 光照及光照时间对花青素的影响
Fig.3 Effect of light and lighting time on anthocyanin
不同大写字母表示相同产品不同时间差异显著（p<0.05）；不同小写字母表示相同时间不同产品差异显著（p<0.05）。
2.3.2 温度及保温时间对花青素的影响
除光照外，温度也是影响花青素稳定性的重要因素。图4为60℃下桑葚干和桑葚酒提取物中花青素含量的变化。
图4 温度及保温时间对花青素的影响
Fig.4 Effect of temperature and soaking time on anthocyanin
不同大写字母表示相同产品不同时间差异显著（p<0.05）；不同小写字母表示相同时间不同产品差异显著（p<0.05）。
由图4可知，随保温时间延长，两种提取物中花青素含量均逐渐减少，2 h开始桑葚干和桑葚酒中花青素含量存在显著差异（p<0.05），2 h后发现，桑葚酒提取物中花青素含量减少程度变缓，5 h时桑葚酒提取物中花青素含量显著高于桑葚干提取物（p<0.05）。原因可能是聚合型花青素分解释放出游离型花青素，使得游离型花青素含量增加。
2.3.3 氧化剂H2O2对花青素的影响
向桑葚干和桑葚酒花青素提取液中加入H2O2后，花青素含量变化如图5所示。
图5 H2O2添加量对花青素的影响
Fig.5 Effect of H2O2addition on anthocyanin
不同大写字母表示相同产品不同H2O2添加量差异显著（p<0.05）；不同小写字母表示相同H2O2添加量不同产品差异显著（p<0.05）。
由图5可知，H2O2添加量越多，花青素含量越少。原因是花青素的高度不饱和结构使其对氧化剂颇为敏感，H2O2对桑葚干和桑葚酒提取物中的花青素产生强烈的破坏作用，H2O2能与花青素C2位发生亲核反应，使吡喃环裂开而产生无色的酯和香豆素衍生物，再进一步降解或聚合，最终产生褐色沉淀物[20]。0～2.0 mL H2O2添加量下，桑葚酒提取物中花青素含量均显著高于桑葚干提取物（p<0.05）。原因是桑葚酒中可能存在其他抗氧化物质，如黄酮醇等，这些抗氧化物质与花青素共同起作用，从而保护花青素并减少其消耗[21-22]，说明桑葚酒花青素提取液对H2O2的耐受性强于桑葚干。
2.3.4 还原剂Na2SO3对花青素的影响
向桑葚干和桑葚酒花青素提取液中加入Na2SO3溶液后，花青素含量变化如图6所示。
图6 Na2SO3添加量对花青素的影响
Fig.6 Effect of Na2SO3addition on anthocyanin
不同大写字母表示相同产品不同Na2SO3溶液添加量差异显著（p<0.05）；不同小写字母表示相同Na2SO3溶液添加量不同产品差异显著（p<0.05）。
由图6可知，Na2SO3溶液添加量为0.2 mL时，桑葚干和桑葚酒提取物中花青素含量显著降低（p<0.05），当Na2SO3溶液添加量为1.0 mL时，桑葚干提取物中花青素含量仅为25 mg/100 g，而对应的桑葚酒提取物中花青素含量为40 mg/100 g，显著高于桑葚干提取物（p<0.05），并且在0～1.0mL Na2SO3溶液添加量下，桑葚酒提取物中花青素含量均显著高于桑葚干（p<0.05）。说明桑葚酒花青素提取物对SO2耐受性要强于桑葚干，原因是花青素在桑葚酒中转变为吡喃型花青素，普通的花青素碳骨架的C4位与SO2发生加成反应而褪色，而吡喃型花青素碳骨架的C4位形成新的环，阻止SO2的亲核反应[23]，从而避免了花青素与SO2发生加成反应。
2.3.5 DPPH自由基清除能力比较
桑葚干和桑葚酒花青素提取物对DPPH自由基的清除能力如图7所示。
图7 DPPH自由基清除能力
Fig.7 DPPH free radical scavenging capacity
由图7可知，随花青素提取物浓度的增加，DPPH自由基清除率增加。当桑葚酒花青素提取物浓度为10 mg/mL时，DPPH自由基清除率达到94%，而此时桑葚干仅为72%。
表1为DPPH自由基清除率的回归方程及IC50。
表1 DPPH自由基清除率的回归方程及IC50
Table 1 Regression equation of DPPH free radical scavenging rate and IC50
花青素提取物回归方程相关系数R2IC50/（mg/mL）桑葚干 y=11.96x+2.96 0.98 3.93桑葚酒 y=13.70x+8.16 0.98 3.05
由表1可知，桑葚干和桑葚酒提取物的IC50分别为3.93 mg/mL和3.05 mg/mL，表明桑葚酒提取物清除DPPH自由基的能力强于桑葚干。
2.3.6 ABTS+自由基能力比较
在氧化剂的作用下，ABTS会被氧化成绿色的ABTS，自由基存在时ABTS+的产生会被抑制，从而达到清除自由基的目的。桑葚干和桑葚酒花青素提取物对ABTS自由基清除能力如图8所示。
由图8可知，随提取物浓度增大，ABTS+自由基清除率增加。当桑葚酒提取物浓度为2.5 mg/mL时，ABTS+自由基清除率达到95%，而此时桑葚干提取物仅为75%。
图8 ABTS+自由基清除能力
Fig.8 ABTS+free radical scavenging capacity
表2为ABTS+自由基清除率的回归方程及IC50。
表2 ABTS+自由基清除率的回归方程及IC50
Table 2 Regression equation of ABTS+free radical scavenging rate and IC50
花青素提取物回归方程相关系数R2IC50/（mg/mL）桑葚干 y=12.11x-6.98 0.98 3.55桑葚酒 y=16.01x+1.15 0.98 3.05
由表2可知，桑葚干和桑葚酒花青素提取物的IC50分别为3.55 mg/mL和3.05 mg/mL，表明桑葚酒提取物清除ABTS+自由基能力强于桑葚干。有学者也发现花青素具有很强的自由基清除能力，其抗氧化性能比VE高50倍，比VC高20倍[24]。花青素的抗氧化活性来源于多酚分子中的酚羟基，分子中所含的酚羟基越多，其抗氧化性越强，更利于脱氢形成供氢体，打断自由基的链式反应。桑葚酒花青素提取物的自由基清除率高于桑葚干提取物，原因可能是桑葚酒中花青素含量较高或桑葚酒中还存在其他的自由基清除剂[24-25]，与花青素共同起作用。
2.4 相关性分析
稳定性指标与不同类型花青素所占比重的相关性分析如表3所示。
表3 稳定性指标与不同类型花青素所占比重的相关性分析
Table 3 Correlation analysis between stability index and proportion of polymerized anthocyanins
注：*表示在0.05水平上显著相关。
辅色型花青素占比对光照的稳定性 0.88* -0.60 0.85对温度的稳定性 0.69* -0.67 0.21对H2O2的稳定性 0.80* 0.97* -0.85*对Na2SO3的稳定性 0.63 -0.60 0.32 DPPH自由基清除能力 0.70* -0.96 -0.82 ABTS+自由基清除能力 0.83* 0.78 0.48指标 聚合型花青素占比游离型花青素占比
由表3可知，光照、温度和H2O2对花青素的稳定性、花青素清除DPPH、ABTS+自由基能力与聚合型花青素占比呈显著的正相关关系（p<0.05），说明表征花青素稳定性的指标可能是聚合型花青素所占比重，桑葚酒中花青素的稳定性高可能是因为聚合型花青素所占比重更大，此外，花青素中的聚合型花青素可能是其具有抗氧化作用的原因。吡喃型花色苷和其他分子形成的新的花色苷，可以归为聚合型花青素，吡喃型花青素也可称为聚合型花青素，二者并没有非常严格的界定[26-27]。桑葚酒中聚合型花青素含量较高的原因是花青素与发酵过程中的糖代谢产物或有机酸的脱羧产物发生加成反应生成更稳定的吡喃型花青素[28-29]，这可能是桑葚酒中花青素稳定性较桑葚干高的原因。
3 结论
本文研究光照、温度、氧化剂H2O2和还原剂Na2SO3对桑葚干和桑葚酒中花青素的影响，比较两种产品花青素提取物清除DPPH、ABTS+自由基能力。结果发现桑葚干和桑葚酒花青素提取物中多酚含量无显著差异。桑葚酒提取物中聚合型花青素所占比显著增加，游离型花青素所占比重显著降低，辅色型花青素含量没有明显变化；光照、温度、氧化剂和还原剂对桑葚干提取物中花青素的影响大于桑葚酒；桑葚酒花青素提取物清除DPPH、ABTS+自由基能力强于桑葚干提取物；相关性分析结果表明，光照、温度和H2O2对花青素的稳定性、花青素清除DPPH、ABTS+自由基能力与聚合型花青素占比呈显著的正相关关系（p<0.05），说明表征花青素的稳定性指标可能是聚合型花青素所占比重。综上所述，桑葚酒中花青素的稳定性强于桑葚干，更能耐受光照、温度、氧化剂H2O2和还原剂Na2SO3所造成的影响，且其抗氧化能力强于桑葚干，更能满足消费者对桑葚花青素的需求。
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