双孢蘑菇（Agaricus bisporus）是目前世界上人工栽培种植范围广、产量高的食用菌之一，不仅富含蛋白质、维生素、矿物质等高营养物质，而且具有低热量、低脂肪、味道鲜美等优点[1]，深受消费者的青睐。双孢蘑菇主要以市场鲜销为主，但其水分含量高、呼吸强度大、组织脆嫩，导致采后贮藏期仅有1 d～3 d，严重降低了产品的营养价值和商业价值[2-3]。采后持续发育是导致双孢蘑菇采后品质损失的一个重要原因，在此过程中不仅出现菌膜破裂，成熟菌褶暴露，菌盖开伞等变化，同时菌体释放孢子不断消耗子实体中的养分，造成营养物质在一定程度上出现迁移或缺乏，从而导致双孢蘑菇的感官品质与营养价值大大降低[4-5]。因此，阐明双孢蘑菇采后持续发育的机制，特别是对其分子调控机制的研究，对于开发更为有效的双孢蘑菇保鲜方法具有重要的作用。
转录因子（transcription factors，TF）是一类可以通过与目标基因上游特定DNA序列中的顺式反应元件相互作用而激活或抑制其下游基因表达的一种蛋白质分子，在调节植物次生代谢途径中多种基因协同表达发挥着重要作用[6]。bHLH型转录因子在真核生物中存在十分广泛，在转录因子家族中占有重要的地位，是植物体内第二大类转录因子家族。目前，已从各种光合真核生物中鉴定出2 400多个bHLH基因[7]。研究表明，bHLH转录因子在植物的许多重要生理过程，如生长发育、次生途径代谢产物的合成与调控、抗逆反应等过程中发挥了越来越多的作用，成为近年来研究的热点，其作用机理主要在于通过与靶基因启动子上的特定基因位点发生特异性结合，来转录调控基因的表达[8-9]。例如，Zhu等[10]研究发现典型bHLH转录因子SlPRE2的过表达不仅促进了番茄幼苗的形态发育，而且减少了果实中色素的积累。与此类似，拟南芥中bHLH转录因子LoUDT1的过表达会导致花药发育异常和花粉缺陷[11]。此外，Lu等[12]研究GhbHLH/HLH基因通过油菜素类固醇信号通路在棉花纤维发育中的特定作用。然而，bHLH转录因子在食用菌的采后继续发育和衰老及胁迫反应中是否发挥着同样重要的作用，其调控机制如何等均不清晰。
目前，关于bHLH转录因子在调控动植物生长发育和对抗各种胁迫过程中的功能及转录调控机理已经得到了大量研究，但是bHLH转录因子在食用菌领域的研究却鲜有报道。因此，本文首次克隆鉴定双孢蘑菇中的AbbHLH基因，并制备AbbHLH转录因子的多克隆抗体，为进一步探究其在双孢蘑菇采后继续发育中的调控机制提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株及质粒
大肠杆菌 E.coli XL1-blue、E.coli BL21（DE3）感受态细胞、pET-28a（+）空载质粒：天津科技大学食品营养与安全重点实验室保存。
1.1.2 培养基及试剂
LBK培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠10 g/L、卡那霉素100 mg/L、pH7.0；LBK固体培养基另添加15 g/L琼脂粉。
oligod（T）18引物：日本 Takara 公司；尿素、三羟甲基氨基甲烷[Tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid，Hepes]、二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、苯甲磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluo ride，PMSF）、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）：北京索莱宝科技有限公司；pfu高保真聚合酶和限制性内切酶及相关缓冲液：北京全式金生物技术有限公司；T4DNA连接酶及相关缓冲液：美国Thermo Fisher Scientific公司；弗式不完全佐剂、弗式完全佐剂：美国Sigma公司；Protein A SepHaroseTM CL-4B填料、CNBr-activated SepHaroseTM4 Fast Flow抗体纯化介质、Ni SepHaroseTM6 Fast Flow亲和纯化介质：美国GE Healthcare公司；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔抗体：美国Jackson Immune Research公司；化学发光法EMSA试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 主要溶液配制
磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）：0.016 2 mol/L Na2HPO4、0.003 8 mol/L NaH2PO4、0.5 mol/L NaCl，pH7.4；漂洗液：1 mol/L 尿素、0.02 mol/L 咪唑，PBS定容；结合液：8 mol/L尿素、0.02 mol/L咪唑，PBS定容；洗脱液：8 mol/L尿素、0.5 mol/L咪唑，PBS定容；透析液母液：0.06 moL/L KCl、0.05 moL/L Tris、0.001 moL/L EDTA、0.012 moL/L Hepes、0.001 moL/L DTT、0.001 moL/L PMSF，pH7.4；包被液：0.01 mol/L Na2CO3、0.03 mol/L Na2CO3、pH9.6；Protein A 结 合 液 ：0.05 mol/L Tris、0.075 mol/L NaCl，pH7.0；Protein A 洗脱液：0.1 mol/L 甘氨酸、0.15 mol/L NaCl，pH2.5；CNBr结合液：0.1 mol/L NaHCO3、0.5 mol/L NaCl，pH8.3。
1.2 仪器与设备
9902 PCR仪：美国应用生物系统有限公司；Syner－gyH1/H1MF多功能酶标仪：美国伯腾仪器生产有限公司；BG-verMINI蛋白电泳仪：北京百晶生物技术有限公司；ZXDP-B2120电热恒温箱：上海智诚分析仪器制造公司；906超低温冰箱：美国Thermo公司；ChampGel 50000凝胶成像仪、ChampGeI 5000 WB扫膜仪：北京赛智科技有限公司；5424R冷冻离心机：德国Eppendorf公司；HYC-940 4℃医用冷藏柜：青岛海尔特种电器有限公司；JY92-IIDN超声波细胞破碎仪：天津亿湾生物技术科技商贸公司。
1.3 实验动物
新西兰大白兔[生产许可证号SCXK（京）2015-0015]：北京斯贝福生物技术有限公司。
1.4 AbbHLH编码区全长基因的克隆
根据双孢蘑菇全基因组的测序结果及原核表达载体pET-28a（+）图谱，使用Premier5.0软件对AbbHLH基因（Genebank号：XP_007326351.1）进行引物设计，并分别加入酶切位点EcoR I和Hind III，如表1所示。
表1 扩增AbbHLH所用引物序列
Table 1 Primer sequences used for PCR amplification of AbbHLH gene
引物 引物序列 酶切位点上游引物 GGAATTCATGGCCTTGACACTCCCAC EcoR I下游引物 CCAAGCTTTCACATCATCATTGCAAAACCTCCC Hind III
以反转录后的双孢蘑菇互补DNA（complementary DNA，cDNA）为模板，利用表1中设计的特异性引物，进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增AbbHLH基因，再用限制酶EcoR I和Hind III进行双酶切，将目的基因回收。PCR扩增的反应条件为95℃ 2 min、95℃ 30 s、58℃ 1 min、72℃ 1 min，35个循环；终延伸在72℃10 min为宜。反应结束后，取2 μL所得PCR产物进行0.1%琼脂糖凝胶电泳分析，用DNA纯化回收试剂盒将结果中条带大小正确的PCR产物进行进一步纯化。
1.5 pET-28a（+）-AbbHLH原核表达载体构建
将pET-28a（+）空载质粒和经PCR回收的目的片段分别用限制性酶EcoR I和Hind III在37℃恒温条件下双酶切3 h，再将分别获得了黏性末端的载体和目的片段按照物质的量1∶3的配比混合，在T4DNA连接酶的作用下保持4℃连接8 h～12 h。然后通过化学转化法，把重组质粒化转入E.coli XL1-blue感受态细胞中，再从中挑取单克隆分别接种到LBK固体培养基中，保持37℃恒温培养8 h～12 h[13]。提取质粒，用限制性酶EcoR I和Hind III做双酶切验证，其中验证正确的部分质粒由金唯智生物科技有限公司进行质粒测序，将验证测序正确的质粒命名为pET-28a（+）-AbbHLH。
1.6 重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
采用化学转化法，将pET-28a（+）-AbbHLH导入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）感受态细胞中，于37℃在LBK平板上培养12 h。挑取单克隆，并于LBK液体培养基中培养8 h～12 h，然后将其按1∶20（体积比）转到新鲜LBK液体培养基中继续扩大培养，直至培养液OD600为0.6～0.8内。之后加入IPTG诱导剂（终浓度0.4 mmol/L），于25℃、220 r/min条件下诱导20 h使蛋白得到大量表达，同时设置无IPTG诱导剂的对照组。诱导结束后用PBS缓冲溶液重悬菌体沉淀，再离心（8 000 r/min，15 min）收集菌体，反复3次以充分清洗菌体。最后用PBS缓冲溶液将菌体溶解，超声破碎获得全蛋白，经离心（8 000 r/min，15 min）后分别收集沉淀和上清液，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析[14-15]。
1.7 重组蛋白纯化
收集超声裂解后的包涵体蛋白，用漂洗液重悬后，进行8 000 r/min、15 min离心处理，弃掉上清液，重复3次以去掉部分杂蛋白。然后将蛋白沉淀溶解在结合液中，经0.22 μm滤膜过滤后将滤液结合到预先处理好的Ni SepHaroseTM6 Fast Flow纯化柱中，置于摇床上于4℃下结合2 h。待流穿液排干后，用结合液反复洗涤柱子，直到无蛋白从洗涤液中流出。最后用洗脱液重复洗脱目的蛋白，取样后用SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度，将洗脱液置于-80℃下保存备用[16-18]。
1.8 重组蛋白复性
将纯化后的重组蛋白用洗脱液稀释后，放入预先处理好的透析袋中，并用夹子夹紧。将样品置于4℃磁力搅拌器上分别于透析液I（含6 mol/L尿素）、II（含4 mol/L尿素）、III（含2 mol/L尿素）、IV（含1.5 mol/L尿素）、V（含1 mol/L尿素）、VI（含0.5 mol/L尿素）和透析液母液中各透析1次，每次12 h，且每次换液前取样用于SDS-PAGE电泳分析。将复性后的蛋白溶液加入到过膜水冲洗过的超滤管中，离心浓缩（3 500 r/min，4℃）后用Bradford法测定浓缩后蛋白的浓度，直至浓度达到0.5 μg/mL后停止浓缩，蛋白样品经SDS-PAGE电泳分析，再用ImageJ 1.51软件进行灰度分析，蛋白纯度大于80%的样品置于-80℃下保存备用[19]。
1.9 多克隆抗体制备
首次免疫取400 μg纯化后的重组蛋白样品稀释后，加入等体积的弗氏完全佐剂并混匀，充分乳化后多点背部皮下注射免疫实验动物新西兰大白兔，设置免疫前兔子耳静脉血作为阴性对照。加强免疫时，向200 μg蛋白样品中加入等体积的弗氏不完全佐剂混匀，每间隔10 d加强1次免疫，共进行3次加强免疫。最末次免疫1周后，取兔子耳静脉血用来检测抗体的效价，当效价达到20 000以上后，用麻醉剂麻醉兔子，取颈动脉血，于5 000 r/min离心20 min，收集30 mL血清，于-80 ℃下冻存[20]。
1.10 抗体效价的检测
采用酶联免疫吸附测定法测定抗血清效价[21-22]。一抗为免疫后兔血清，将纯化后的抗原用包被液稀释至浓度为 2 μg/mL，加至 96孔板（100 μL/孔），4 ℃包被8 h～12 h；用 PBST（含 0.05%（体积分数）Tween-20的PBS，pH7.4）洗涤2次，10%脱脂乳37℃恒温孵育2 h；将多抗血清用PBS溶液进行梯度稀释，设置空白对照为只加PBS，设置阴性对照为1∶200稀释的阴性血清，各组均加入酶标板中于37℃恒温孵育1 h，后用PBST溶液洗涤3次。二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1∶20 000稀释），先在37℃恒温孵育1 h，取出后用 PBST 溶液洗涤 3 次。经过 3，3′，5，5′，-四甲基联苯胺显色后用酶标仪测定OD450时的吸光值，当试验组与阴性对照组血清的OD450比值＞2.0时为阳性，最大OD值的1/2对应稀释倍数即为抗血清效价。
1.11 多克隆抗体的纯化及特异性分析
1.11.1 Protein A纯化
用Protein A结合液稀释血清样品，过0.22 μm的水系滤膜除去血清中的细胞残渣和小颗粒杂质后，将滤液样品注入以Protein A SepharoseTMCL-4B为填料的结合柱中，充分混匀后于25℃结合2 h。结合完成后用Protein A结合液冲洗柱子，直至流出的溶液中无蛋白为止。再用Protein A洗脱液重复洗脱以获得较高纯度抗体，用Western Blotting检测纯化后抗体特异性。
1.11.2 CNBr纯化
将CNBr-activated SepHaroseTM4 Fast Flow填料加入结合柱预处理，用CNBr结合液平衡至pH8.3后，将纯化后的抗原蛋白加入柱中混匀，置于摇床上4℃结合8 h～12 h。结合后用CNBr结合液反复冲洗柱子，直至流出液中无蛋白测出，然后加入Tris-HCl（0.1 mol/L，pH8.0）25℃封闭4 h。之后依次用溶液1（0.1 mol/L Tris、0.5 mol/L NaCl，pH3.5）及溶液 2（0.2 mol/L Gly、1 mol/L NaCl，pH3.5）交替冲洗，将柱中填料调至中性，最后用Protein A结合液平衡柱子。将Protein A纯化后的血清抗体加入柱子中，与抗原蛋白25℃室温下结合2 h，结合完成后收集洗脱液，并进行SDS-PAGE电泳分析抗体纯度。每毫升纯化完的抗体中加入300 μL 30%的甘油和10 μL 1%的NaN3，分装后贮存于-80℃冰箱中，用Western Blotting检测抗体特异性。
1.11.3 Western Blotting检测抗体特异性
取20 μg经Bradford[23]法定量的双孢蘑菇全蛋白，待SDS-PAGE电泳结束后，于40 V电压下转膜1 h，洗膜后加入10 mL 10%脱脂乳粉，置于4℃的水平摇床上密封12 h～18 h。加入一抗（Anti-AbbHLH多克隆抗体，1∶10 000稀释），放入水平摇床中室温25℃孵育1 h。取出后用TBST缓冲液（含体积分数0.05%Tween-20的 TBS，pH7.5）洗膜 3次，再加入 1 μL 二抗（HRP 标记的羊抗兔抗体，1∶10 000稀释），放于摇床上室温25℃孵育1 h，用TBST缓冲液冲洗膜3次，最后用ECL显色试剂盒进行显色[24]。
2 结果与分析
2.1 AbbHLH目的基因扩增产物的鉴定
基因AbbHLH的扩增见图1。
图1 基因AbbHLH的扩增
Fig.1 Full length amplification of AbbHLH gene
由图1可知，得到了片段大小为1 600 bp左右的PCR产物，与预期基本一致。
2.2 重组表达质粒的鉴定
重组表达载体的双酶切验证见图2。
图2琼脂糖凝胶电泳表明获得大小分别为1600bp和7 000 bp左右的基因片段，且大小和预期相符。经质粒测序后结果表明：成功克隆得到一条大小为1 599 bp的基因片段，该片段与双孢蘑菇AbbHLH基因cDNA片段一致性达到99.37%，且未发现任何氨基酸突变，说明重组质粒pET-28a（+）-AbbHLH构建成功。
图2 重组表达载体的双酶切验证
Fig.2 Double digestion verification of recombinant plasmid pET-28a（+）-AbbHLH
2.3 重组质粒的原核表达
重组蛋白6×His-AbbHLH的诱导表达见图3。
图3 重组蛋白6×His-AbbHLH的诱导表达
Fig.3 SDS-PAGE analysis of the expression of the recombinant protein 6×His-AbbHLH
由图3可知，将IPTG诱导前后的全细胞表达结果进行对比后可以看出，含有6×His的AbbHLH蛋白在诱导后的表达量约为70 kDa。对诱导后的菌体进行超声破碎后，收集上清液和破碎沉淀分别经SDS-PAGE分析，结果显示出6×His-AbbHLH融合蛋白主要以包涵体的形式存在。
2.4 融合蛋白的纯化及复性
SDS-PAGE检测亲和纯化后的融合蛋白见图4。
由图4可知，纯化后的融合蛋白纯度达80%，较纯化前有了明显提高。
图4 SDS-PAGE检测亲和纯化后的融合蛋白
Fig.4 SDS-PAGE analysis of the affinity purification of recombinant protein
融合蛋白之所以表达在包涵体中可能是由于菌体产生蛋白的速度过快而无足够的时间形成正确空间结构，二硫键没有正确配对[25]，从而导致蛋白之间发生了非特异性结合，使其溶解度和活性降低，因此需要将纯化后的蛋白进行梯度透析以恢复其活性状态。纯化后蛋白的复性及浓缩见图5。
图5 纯化后蛋白的复性
Fig.5 Renaturation of purified protein
由图5可知，重组蛋白在透析过程中较稳定，基本无降解。将复性后的蛋白用超滤管于4℃下浓缩以提高蛋白浓度，再用SDS-PAGE检测，经Image J灰度软件分析，其结果见图6。
图6 纯化后蛋白的浓缩
Fig.6 Concentration of purified protein
由图6可知，融合蛋白纯度达到了80%，经Bradford法测定浓缩后的蛋白浓度可达0.5 mg/mL，能够用于后续免疫动物实验的抗原。
2.5 多克隆抗体制备
间接酶联免疫吸附测定法测定抗血清的效价见图7。
图7 间接ELISA法测定抗血清的效价
Fig.7 Determination of the antiserum titer with ELISA method
由图7可知，Anti-AbbHLH多克隆抗体的效价为102 400。
2.6 多克隆抗体纯化与特异性分析
Western Blotting检测Anti-AbbHLH的特异性见图8。
图8 Western Blotting检测Anti-AbbHLH的特异性
Fig.8 The specificity of anti-AbbHLH was detected by Western Blotting
由图8可知，相对分子质量为70kDa左右出现了明显的条带，分子量大小与预期一致，说明Anti-AbbHLH多克隆抗体制备成功。通过Western Blotting实验对Protein A纯化后的抗体进行特异性检测，发现抗体中大部分的杂带已被去除，但仍含有部分非特异性结合的抗体。将CNBr纯化后的抗体进行Western Blotting检测，结果显示纯化后的抗体可与贮藏后0 h与2 h的双孢蘑菇AbbHLH蛋白发生特异性结合，在约70 kDa处出现明显的条带，且基本无其它杂带，表明得到了高纯度、特异性强的多克隆抗体。
3 结论
本文成功获得了以包涵体形式存在的6×His-AbbHLH融合蛋白，经纯化复性后得到纯度大于80%的水溶性抗原蛋白，用此抗原蛋白免疫新西兰大白兔得到了效价为102 400的AbbHLH转录因子的多克隆抗体，用Protein A及CNBr对抗体进行亲和纯化后，用Western Blotting检测该抗体能够特异性识别采后不同贮藏时期双孢蘑菇中的AbbHLH蛋白，表明所制备的多克隆抗体可用于双孢蘑菇体内的AbbHLH蛋白检测，为bHLH转录因子在双孢蘑菇采后继续发育中的作用机制的阐明提供了重要方法支持。
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