鱼丸等鱼糜制品内含脂质和蛋白质等物质容易氧化变质[1]，一般通过保鲜膜包装并置于冷藏环境，来延长保鲜期，常见包装膜主要是阻隔氧气和水分，且基本是石油基衍生材料，存在降解时间长，环境污染大等问题[2]。因此，研究具有生物可降解性和抗菌功能的食品包装膜，对延长食品贮藏期和减少环境污染具有重要意义。
近几年，构建抗菌缓释体系是抗菌包装材料的研究热点。其中，将微胶囊技术应用在天然抗菌剂缓释体系中，具有适用性广和缓释效果好的特点[3-4]，该技术通常是以半透性的高分子材料为壁材，将一些易氧化、易挥发的物质包裹，制成微米或纳米的小粒子，得到缓释材料。张家涛等[5]研究茶多酚复合涂膜对美国红鱼鱼片的保鲜性能，发现几种茶多酚微胶囊复合涂膜，都能形成抗菌剂缓释体系，能有效抑制鱼片中微生物的生长。付秋莹等[6]以百里香精油为芯材，多孔淀粉为壁材，采用锐孔-凝固法成功制备具有优异缓释效果的微胶囊。
生物可降解包装材料是指在自然界中的微生物作用下（真菌、细菌等），能逐渐解体，最终降解成CO2、H2O、无机盐等[7-8]的材料。其中，聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）是一种水溶性可降解高分子，其透明度、光泽度、抗静电性能较好，但是其阻隔性能较差[9]。而壳聚糖（chitosan，CS）是一种无毒、生物可降解的天然高分子抑菌剂，常用于聚乙烯醇等高分子改性，是一种良好的成膜助剂[10]。课题组在前期研究发现CS和PVA二者共混制备可降解薄膜，能保留薄膜的优良力学性能以及透明度，且能提高薄膜的阻隔性能[11-12]。因此，在此基础上，通过微胶囊技术包埋不同的天然抗菌剂，并将微胶囊融入生物可降解膜中，有望构建良好缓释性能的食品保藏抗菌材料。
本文分别以香芹酚、百里香酚、牛至油作为芯材，以 β-环糊精（β-cyclodextrin，β-CD）作为壁材，通过饱和水溶液法来合成精油微胶囊，再将合成的微胶囊添加到CS与PVA复配为基底的抗菌膜中（CS/PVA），制成具有缓释性能的可降解抗菌膜，分析抗菌膜的力学性能、阻隔性能以及对鱼丸的保鲜性能，以期为鱼糜制品的新型缓释包装材料开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
β-环糊精（分析纯）：上海泰坦科技股份有限公司；百里香酚、香芹酚、牛至油、吐温-80、乙酸、甘油、1799聚乙烯醇（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；壳聚糖（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；甲基红、溴甲酚绿（均为分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.1.2 仪器与设备
红外光谱仪（Nicolef LS10）、傅里叶红外光谱仪（Nicolet 380）：美国热电公司；智能电子拉力试验机（XLWPC）：济南赛成有限公司；热重分析仪（TGS-3A）：厦门红辰科技有限公司；凯式定氮仪（K9840型）：济南海能仪器股份有限公司；生化培养箱（SPX-150-B-Z）：上海博迅实业有限公司；手轮立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX-50KBS）：上海申安医疗器械厂。
1.2 方法
1.2.1 鱼丸的制作工艺
鱼丸的制作方法参考文献[13]。
1.2.2 精油微胶囊的制备
采用饱和水溶液法，参考文献[14]的方法制备β-CD精油微胶囊。
1.2.3 CS/PVA基底膜的制备
将1 g CS加入乙酸溶液（质量分数2%）中，充分搅拌待用；将PVA与蒸馏水以1∶10（质量比）完全溶解待用；将CS乙酸溶液与PVA水溶液以3∶2（体积比）进行共混，并添加适量甘油和吐温-80后，在60℃下加热搅拌1 h得到混合成膜液，超声消泡，取一定量成膜液倒入模具中，在60℃烘箱中干燥9 h，获得CS/PVA膜[11]。
1.2.4 微胶囊/CS/PVA膜的制备
取一定量微胶囊抗菌剂（PVA干重20%）用无水乙醇溶解后，加入基底混合成膜液，超声消泡；取一定量成膜液倒在模具中，在60℃烘箱中干燥9 h，获得抗菌膜[15]。此方法制得以下3种β-CD包埋的微胶囊抗菌膜：香芹酚β-CD微胶囊/CS/PVA抗菌膜（香芹酚膜）；百里香酚β-CD微胶囊/CS/PVA抗菌膜（百里香酚膜）；牛至油β-CD微胶囊/CS/PVA抗菌膜（牛至油膜）。
1.3 试验分组
用微胶囊抗菌膜封装品相均一的新鲜鱼丸，并在常温（25.0±0.5）℃下进行感官评价。试验组：A为鱼丸+香芹酚膜；B为鱼丸+百里香酚膜；C为鱼丸+牛至油膜；对照组：D为鱼丸+CS/PVA膜；E为鱼丸（无覆膜）。
1.4 测试方法
1.4.1 机械性能测试
参照GB/T 1040.1—2018《塑料拉伸性能的测定第1部分：总则》，测试抗菌膜的拉伸强度和断裂伸长率。
1.4.2 透气性能的测试
参照GB/T 1038—2000《塑料薄膜和薄片气体透过性试验方法压差法》测试抗菌膜的气体透过量。
1.4.3 感官指标的评定
参照GB 10136—2015《食品安全国家标准动物性水产制品》，制定评分标准[16]。评价人员由10人组成，对评分结果进行统计分析，感官评分取平均值。鱼丸感官评分标准见表1。
表1 鱼丸感官评分标准
Table 1 Fish balls freshness and sensory evaluation criteria project
分值 色泽 质地 气味8.0～10.0 颜色泛白，有光泽 富有弹性，无黏液 新鲜鱼香味5.0～7.9 颜色微微泛黄，稍有光泽香味淡，无腥臭味3.0～4.9 颜色泛黄，无光泽 稍有弹性，少量黏液较有弹性，无黏液无香味，腥臭味较重0～2.9 颜色变暗，无光泽 无弹性，黏液多 强烈恶臭味
1.4.4 pH值测定
参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准食品pH值的测定》，采用酸度计测定其pH值。
1.4.5 抑菌性能测定
参照琼脂扩散法，研究抗菌膜对革兰氏阳性菌（大肠杆菌）和革兰氏阴性菌（金黄色葡萄球菌）的抑菌试验[17]，其中抑菌圈直径包含滤纸（直径16 mm）。
1.4.6 挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVBN）值的测定
参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》，采用半自动凯氏定氮仪法测定鱼丸的TVB-N值。
1.5 数据分析
采用Origin 9.0软件绘制曲线，所有数据以平均值±标准差表示。
2 结果与讨论
2.1 微胶囊的性能分析
2.1.1 微胶囊的红外光谱
β-CD、百里香酚和3种微胶囊的傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscop，FTIR），如图 1所示。
图1 微胶囊的红外光谱
Fig.1 The FTIR spectra of essential oil microcapsules
如图1所示，在曲线a中β-CD的-OH和C-O-C伸缩振动峰，分别出现在3 340 cm-1和1 030 cm-1处[18]。在曲线b中百里香酚的FTIR光谱中，可观察到百里香酚芳香环上的C=C拉伸振动峰和C-O的伸缩振动峰，分别出现在1 870 cm-1左右和1 100 cm-1左右[19]。曲线c为物理混合的百里香酚和β-CD的红外图谱，图中较好地保留了β-CD和百里香酚的特征峰，其峰的振动强度与β-CD和百里香酚相比，峰形变化不大。而红外光谱图中百里香酚微胶囊的曲线d，除了有β-CD的特征峰以外，与百里香酚曲线b相比存在一定的差异，主要是1 870、1 100 cm-1处的2个峰强度有所减弱或者消失[20]，这可能是百里香酚的苯环通过疏水作用进入β-CD的空腔中，这表明百里香酚/β-CD微胶囊成功制得。同理可知，牛至油/β-CD抗菌微胶囊和香芹酚/β-CD微胶囊也成功制备。
2.1.2 微胶囊的热重分析
β-CD、百里香酚和3种微胶囊的热重曲线，如图2所示。
图2 微胶囊的TG图
Fig.2 TG curve of microcapsules
由图2中可知，曲线a（β-CD）出现2个失重区，第一个区域在100℃附近，可能是β-CD空腔中有少量的水分受热后损失；第二个区域为β-CD受热分解，即在315℃时开始发生热降解，到350℃时基本结束。而曲线b（百里香酚）只有一个失重区，在75℃左右就开始失重，在180℃左右，完全受热分解。与百里香酚和β-CD相比，曲线c百里香酚/β-CD微胶囊热重曲线明显不同，在100℃之前处于缓慢失重状态，这可能是β-CD空穴中的结晶水被百里香酚占据，导致100℃之前的结晶水失重过程没有出现，而后缓慢失重可能是百里香酚精油的释放导致，直至β-CD的热降解阶段，可知β-CD包裹百里香酚挥发时长，热稳定性更好[21]。香芹酚/β-CD微胶囊在300℃左右开始热降解，而牛至油/β-CD微胶囊在200℃左右就开始热降解。综上，3种精油微胶囊中精油与β-CD作用都较为牢固，能使得精油的挥发性降低，达到良好的缓释效果。
2.2 抗菌膜的性能分析
2.2.1 抗菌膜的机械性能
图3为在抗菌微胶囊相同添加量下，3种抗菌膜的拉伸强度和断裂伸长率对比图。
图3 抗菌膜的机械性能
Fig.3 Mechanical properties of antibacterial films
由图3可知，与CS/PVA膜（未添加微胶囊）相比，添加微胶囊后3种抗菌膜的拉伸强度均有所下降，断裂伸长率都增加。其中牛至油膜和百里香酚膜的拉伸强度下降较多，而香芹酚膜的拉伸强度下降最少，这可能是微胶囊的加入能起到增塑作用，减小了分子间的作用力，柔性增加，拉伸强度降低；同时，百里香酚膜的断裂伸长率增加最多，这可能与添加的微胶囊颗粒（精油/β-CD）在膜中分散程度不同引起的[18]。因此，精油抗菌膜的断裂伸长率相对CS/PVA膜有所提高，且百里香酚膜力学性能最佳，说明添加的抗菌微胶囊能提高膜的延展性。
2.2.2 抗菌膜的阻隔性能
图4为3种抗菌膜和空白对照组的气体透过系数。
图4 抗菌膜的气体透过系数
Fig.4 Gas permeability of antibacterial films
由图4可知，氧气的透过系数相差不大，表明CS/PVA膜的阻隔性较好，而二氧化碳的透过系数变化比较明显。与对照组（CS/PVA膜）相比，添加微胶囊后抗菌膜的二氧化碳透过系数都有所下降，这可能是适量微胶囊加入膜中，能延长二氧化碳分子在CS/PVA基底膜中的扩散路径。其中，牛至油膜二氧化碳透过系数下降最多，其次是百里香酚膜，下降最少的是香芹酚膜，这可能原因是百里香酚/β-CD微胶囊粒径最小，且在膜中分布更加均匀，使得二氧化碳分子在抗菌膜中的扩散路径更长，导致二氧化碳分子的透过系数更低[21]。
2.2.3 抗菌膜的红外光谱分析
图5为抗菌膜和空白组膜的红外光谱图。
图5 抗菌膜的红外光谱
Fig.5 The FTIR spectra of antibacterial films
由图5可知，4条曲线在3000cm-1左右出现了PVA的C-H的弯曲振动峰，在3 500cm-1左右的特征峰对应的是PVA的-OH伸缩振动峰。1 422、1 660 cm-1为壳聚糖酰胺的特征吸收峰[22]，983 cm-1附近的吸收峰是PVA与植物精油之间形成的环醚键，这种交联作用限制了CS/PVA分子链的运动[23]，会影响抗菌膜的稳定性以及阻隔性能。
2.3 抗菌膜对鱼丸的保藏效果影响
2.3.1 贮藏期间感官评分的变化
图6为不同膜封装鱼丸在常温（25.0±0.5）℃下贮藏过程中的感官评分曲线。
图6 贮藏过程中鱼丸的感官评分
Fig.6 Sensory score of fish balls during storage
由图6可知，在前2 d，不同膜包裹的鱼丸的感官评分几乎相同，但随着贮藏时间的延长，不同膜封装的鱼丸的感官评分曲线有明显差异，在第4天时，无包覆膜和CS/PVA膜的感官评分下降比较明显，且CS/PVA的感官评分高于无包覆膜，这可能是CS和PVA本身的抑菌官能团的作用。在第5天，3种抗菌膜包裹的鱼丸的感官品质相对较为稳定，评分曲线下降较为平缓，感官评分明显高于无抗菌膜包裹的鱼丸，这可能与抗菌膜中微胶囊内抗菌剂的缓释效果有关[24-25]，即在贮藏后期抗菌剂还能维持较高的浓度，从而延缓鱼丸变质。其中，采用香芹酚膜包覆的鱼丸的感官评分稍优于另外2种抗菌膜，而无膜包覆的鱼丸感官评分最低。制备的3种植物精油微胶囊抗菌膜的缓释保鲜效果都比较明显，能延长鱼丸货架期。
2.3.2 贮藏期间pH值的变化
图7为不同膜封装鱼丸的在常温（25.0±0.5）℃下贮藏过程中的pH值曲线。
图7 贮藏过程中鱼丸pH值的变化
Fig.7 Changes of pH of fish balls during storage
由图7可知，随着贮藏时间的延长，pH值呈现先上升后下降的趋势，这主要是因为鱼丸中微生物繁殖并分解蛋白质，产生了碱性化合物，引起pH值上升[11]。从第2天开始pH值下降，这可能与鱼丸中淀粉等的水解产物发生无氧降解，以及微生物利用糖类产生乳酸等有关。贮藏时间为4 d～5 d时，有添加微胶囊的抗菌膜的pH值下降幅度较小，这可能是微胶囊中植物精油缓慢释放，抑制了细菌的生长繁殖，从而减小pH值的降低幅值[21]，其中，香芹酚膜组的pH值变化幅度最小，无包覆保鲜袋组的pH值变化的幅度最大。
2.3.3 贮藏期间TVB-N值的变化
图8为不同膜封装的鱼丸在常温（25.0±0.5）℃下贮藏过程中TVB-N的变化曲线。
由图8可知，前2 d所有试验组的TVB-N值变化程度都较为接近，在贮藏第2天后，3组精油微胶囊膜包裹的鱼丸TVB-N值曲线斜率较小，可能是微胶囊中抗菌剂的缓释出来抑制了鱼丸中微生物的繁殖，减少鱼丸TVB-N值的产生[19]，其中香芹酚膜包裹鱼丸TVBN值曲线斜率最小，其它TVB-N值的曲线斜率增大顺序：百里香酚膜＞牛至油膜＞CS/PVA膜＞无包裹组，这与上述pH值的结果一致，且在贮藏第5天的时候无包裹组保鲜效果超过30 mg/100 g，鱼丸已经明显腐败。
图8 贮藏过程中鱼丸TVB-N值的变化
Fig.8 TVB-N changes of fish balls during storage
2.4 抗菌膜的抑菌性能
图9分别是抗菌膜对大肠杆菌和革兰氏阴性菌的抑菌效果图，表2是抑菌圈直径的均值。
图9 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈
Fig.9 The inhibition zone of Escherichia coli and Staphylococcus aureus
表2 抗菌膜抑菌圈数值
Table 2 Antibacterial film inhibition zone value
抗菌膜种类 大肠杆菌抑菌圈/mm 金黄色葡萄球菌抑菌圈/mm CS/PVA膜 16.5 18.1百里香酚膜 20.1 20.2牛至油膜 21.5 22.4香芹酚膜 22.8 23.2
结合图9和表2可知，4组抗菌膜对金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）的抑菌效果都较好，且都要优于对大肠杆菌（革兰氏阴性菌）。其中，香芹酚膜对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果最好，而牛至油膜和百里香酚膜对大肠杆菌的抑制效果次之，CS/PVA膜抑制效果最差，这是因为精油微胶囊的在培养基中有效抗菌浓度及其对不同菌的抗菌机理不同有关。
3 结论
本文成功制备了β-CD包裹的香芹酚、百里香酚、牛至油3种微胶囊，并将微胶囊添加到壳聚糖和聚乙烯醇复配的基底膜中，研究添加不同种类的微胶囊对抗菌膜的力学性能和抗菌性能的影响。结果表明，在添加等质量抗菌剂胶囊（PVA干重20%）的情况下，相对CS/PVA膜，3种微胶囊添加到基底膜中，都使得膜的断裂伸长率增加，拉伸强度下降，阻隔性能增强，其中百里香酚膜力学性能和阻隔性能最佳。此外，3组精油抗菌膜在常温（25.0±0.5）℃下真空封装鱼丸，由鱼丸贮藏期间TVB-N值、pH值和感官评分变化可知，添加香芹酚/β-CD微胶囊的抗菌膜缓释抑菌效果最好，该研究有望为天然抗菌剂合成微胶囊抗菌膜，并应用在食品保鲜方面提供实践参考，同时也有利于减少石油基塑料对环境的污染问题。
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