目前关于蛋白质的提取分离一般有盐溶液法[1-3]、超声波法[4-5]、酸溶法[6]、碱溶法[7]、碱溶酸沉法[8-9]、酶法[10-12]等。这些方法普遍操作过程复杂、生产效率低，而且大多需要添加化学物质，易造成化学物质的残留，给食品安全带来隐患，影响产品的风味和口感。而在冷冻鱼糜生产过程中鱼肉肌原纤维蛋白的提取分离则采用了冷水（3℃～10℃清水）漂洗法[13-14]，该法操作简单，不使用除水以外的任何化学物质，生产的产品天然、绿色、安全，现主要用于白肉蛋白质的提取分离。鸭肉属于白肉[15]，蛋白质含量高达23.73%，相对其它畜禽肉，其价格低廉、来源广泛，是提取蛋白质的理想原料[16]。漂洗法主要是通过漂洗去除肉中的色素、血污、脂肪、无机盐、腥臭成分等，然后通过沉淀分离获得肉中的盐溶性蛋白质（肌原纤维蛋白）[17-19]。本研究借鉴鱼肉肌原纤维蛋白的提取分离方法，结合鸭肉与鱼肉（鱼糜制作一般选用低值低质鱼类）的品质差异，如鸭肉水分含量低、肌肉色泽深、肌纤维粗、组织结构紧实、微生物少等，在保证提取质量的前提下，从节能减耗和提高溶解度的实际考虑，规避3℃～10℃的冷水，采用与自来水或地下水温度相接近的凉水（20℃清水）替代冷水漂洗提取鸭肉肌原纤维蛋白。在单因素（鸭肉颗粒大小、水料质量比、漂洗次数、漂洗时间）试验的基础上，经正交试验确定最佳提取工艺条件，以期为鸭肉蛋白质的提取提供一定参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鸭胸肉（冷冻）：青岛和鑫源盛国际贸易有限公司；纱布：市售；凉水（20℃清水）：符合 GB 5749—2006《生活饮用水卫生标准》规定的自来水；浓盐酸、氢氧化纳、硫酸钾、乙醚（均为分析纯）：开封开化（集团）有限公司；浓硫酸（分析纯）：烟台双双化工有限公司。
1.2 仪器与设备
JR-120冻肉绞肉机、ZKJB-150真空搅拌机：河北元昌食品机械科技有限公司；GL.16G高速离心机：上海安亭科学仪器厂；101-2A电热鼓风干燥箱：北京永光明医疗仪器厂；KDN-04C数显温控消化炉、KDN-DI凯氏定氮仪：上海新嘉电子有限公司；SZF-06A脂肪测定仪：上海精隆科学仪器有限公司；SX-4-10灰分测定仪：北京科伟永兴仪器有限公司；JE602电子称：上海浦春计量仪器有限公司；PT3001手持电子温度计：广东美德时仪器仪表有限公司；BC/BD-318HD冰柜：青岛海尔股份有限公司；6202粉碎机：北京开创同和科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 工艺流程
原料肉→预处理→绞肉制粒→凉水漂洗→离心沉淀→恒温干燥→粉碎过筛→干样品
1.3.2 操作要点
1.3.2.1 原料肉
选择符合卫生检验检疫要求的冷冻带皮无骨鸭胸肉为原料，试验前采用空气解冻法进行解冻，解冻后肉温控制在10℃以下。
1.3.2.2 预处理
解冻后的鸭胸肉去除连皮脂肪，保留整块肌肉，并精修去除附在肌肉上面的脂肪、残毛、淤血、软骨、污物等，直至目测无可见脂肪组织和杂质。然后将肌肉切分成小块以方便绞肉制粒。
1.3.2.3 绞肉制粒
选用直径2 mm～6 mm的孔板将预处理好的鸭胸肉在绞肉机上绞成不同直径的颗粒状，绞制后肉温不超过10℃。
1.3.2.4 凉水漂洗
将鸭胸肉颗粒置于搅拌机中用凉水反复漂洗。
1.3.2.5 离心沉淀
将漂洗好的料液放入高速离心机，3 000 r/min离心20 min[20]。然后倾去漂浮在上层的油脂杂物及漂洗液，保留下层沉淀物。用3层纱布将沉淀物包裹并通过挤压除去多余水分，即得到非水溶性鸭肉肌原纤维蛋白湿样品。
1.3.2.6 恒温干燥
将湿样品放入电热鼓风干燥箱内，在60℃条件下干燥至恒重[21]。
1.3.2.7 粉碎过筛
将恒重干燥样品置于干燥器中冷却到25℃，然后用粉碎机进行粉碎并过100目网孔筛，即得鸭肉肌原纤维蛋白样品。
1.4 鸭肉肌原纤维蛋白提取工艺优化试验设计
以鸭肉肌原纤维蛋白样品的蛋白质、脂肪、灰分、水分含量及感官评分为评价指标，通过单因素试验和正交试验对提取工艺参数进行优化，确定最佳提取工艺条件。
1.4.1 鸭肉肌原纤维蛋白提取基础工艺参数
经预试验，将基础工艺参数确定为鸭胸肉颗粒大小4 mm、水料质量比5∶1、漂洗次数3次、漂洗时间10 min。
1.4.2 单因素试验设计
1.4.2.1 最适水料质量比的选择
漂洗时，固定鸭肉颗粒大小4 mm、漂洗3次、漂洗10 min，设置水料质量比分别为 1 ∶1、3 ∶1、5 ∶1、7 ∶1、9∶1，按照1.3.1提取制备鸭肉肌原纤维蛋白，以蛋白质含量为主并结合其他辅助指标（样品的感官评分及脂肪、灰分、水分含量）研究分析水料质量比对提取效果的影响。
1.4.2.2 最适漂洗次数的选择
漂洗时，固定鸭肉颗粒大小4 mm、水料质量比5 ∶1、漂洗 10 min，设置漂洗次数分别为 1、2、3、4、5 次，按照1.3.1提取制备鸭肉肌原纤维蛋白，以蛋白质含量为主并结合其他辅助指标研究分析漂洗次数对提取效果的影响。
1.4.2.3 最适漂洗时间选择
漂洗时，固定鸭肉颗粒大小4 mm、水料质量比5 ∶1、漂洗 3 次，设置漂洗时间分别为 6、8、10、12、14 min，按照1.3.1提取制备鸭肉鸭肉肌原纤维蛋白，以蛋白质含量为主，并结合其他辅助指标研究分析漂洗时间对提取效果的影响。
1.4.2.4 最适颗粒大小选择
漂洗时，固定水料质量比5∶1、漂洗3次、漂洗10 min，设置鸭肉颗粒大小分别为 2、3、4、5、6 mm，按照1.3.1提取制备鸭肉肌原纤维蛋白，以蛋白质含量为主并结合其他辅助指标研究分析鸭肉颗粒大小对提取效果的影响。
1.4.3 正交试验设计
在单因素试验的基础上，确定水料质量比、漂洗次数、漂洗时间、鸭肉颗粒大小4个因素，以鸭肉肌原纤维蛋白样品的蛋白质含量、脂肪灰分水分含量总和、感官评分（色泽、气味、组织状态）为指标，选用L9（34）正交表进行正交试验。其中，营养成分测定每组试验重复3次取其平均值作为试验结果，感官评分以10位专业人员评定的平均值作为试验结果。正交试验因素水平设计见表1。
表1 正交试验因素水平
Table 1 Factor and level table of orthogonal test
水平D颗粒大小/mm 1 5∶1 3 10 2 2 7∶1 4 12 3 3 9∶1 5 14 4质量比 B漂洗次数 C漂洗时间/min因素A水料
1.5 鸭肉肌原纤维蛋白的营养成分测定
依据GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中的蛋白质测定》中的方法测定样品中蛋白质含量[22]；依据GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》中的方法测定样品中脂肪含量[23]；依据GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》中的方法测定样品中灰分含量[24]；依据GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》中的方法测定样品中水分含量[25]。
1.6 鸭肉肌原纤维蛋白的感官评价
选择10名感官评定专业人员对样品进行评定。评定方法：取适量试样置于白色瓷盘中，在自然光下通过视觉观察色泽和组织状态，通过嗅觉辨别气味，具体感官评价标准见表2。
表2 鸭肉肌原纤维蛋白感官评价标准
Table 2 Standard of sensory evaluation of duck myofibrin
评价指标 评分标准 分值色泽（40分）30～40 16～29 0～15气味（40分）淡黄色或微黄色，色泽均匀，有光泽颜色较黄，色泽较均匀，光泽淡呈黄色，色泽不均匀，无光泽30～40 16～29 0～15组织状态（20分）不腥或略有腥味，无其它异味比较腥，无其它异味腥味重，有怪味呈粉末状，粗细均匀，无肉眼可见杂质、不结块呈粉末状，粗细较均匀，无肉眼可见杂质、稍有结块呈粉末状，粗细不均匀，有肉眼可见杂质、有结块15～20 8～14 0～7
1.7 试验数据处理与分析
单因素试验中蛋白质、脂肪、灰分、水分含量，鸭肉肌原纤维蛋白色泽、气味、组织状态评分用SPSS 24.0软件进行显著性分析，正交试验结果用正交设计助手Ⅱ3.1统计软件进行分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 水料质量比对鸭肉肌原纤维蛋白提取效果的影响
水料质量比对鸭肉肌原纤维蛋白基本营养成分含量的影响结果见表3，水料质量比对鸭肉肌原纤维蛋白感官评分的影响结果见图1。
由表3和图1可知，随着水料质量比的增加，蛋白质含量和感官评分呈上升趋势，脂肪、水分、灰分含量总和呈下降趋势，水料质量比7∶1与水料质量比1∶1、3∶1、5∶1相比，蛋白质含量、脂肪含量、水分含量、灰分含量具有显著性差异（P＜0.05）。结果表明凉水添加量越大，肌原纤维蛋白的提取效果越好；但当水料质量比大于7∶1时，凉水添加量的变化对肌原纤维蛋白提取效果的影响不太明显。其原因可能是在一定范围内，凉水越多，鸭肉中的水溶性成分（如血色素、无机盐等）向凉水中扩散溶解的速度越快，漂洗掉的脂肪微粒漂浮到水面后会远离肉粒，经过离心分离后，水溶性成分去除会更容易、更彻底。反之，凉水添加量越少，料液的黏度越大，漂洗时搅拌的阻力加大，阻碍了肉中灰分、糖类、色素等成分与水之间的相互渗透与扩散，油脂不易分离出来，提取的蛋白质含量低、色泽差、腥味重。结合提取效果、节能降耗、成本控制的需要，因此水料质量比确定为7∶1较为适宜。
图1 不同水料质量比对鸭肉肌原纤维蛋白感官评分的影响
Fig.1 Influence of mass ratio of water to material on sensory evaluation of duck myofibrin
表3 水料质量比对鸭肉肌原纤维蛋白基本营养成分含量的影响
Table 3 Influence of mass ratio of water to material on basic nutrient content of duck myofibrin
注：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
水料质量比 蛋白质含量/% 脂肪含量/% 水分含量/% 灰分含量/% 脂肪、水分、灰分含量总和/%1∶1 80.09±1.13d 5.80±0.05a 5.72±0.03a 3.63±0.03a 15.15±0.01a 3∶1 85.12±0.16c 3.88±0.06b 4.31±0.06b 2.88±0.02b 11.07±0.02b 5∶1 89.01±0.44b 1.05±0.03c 3.93±0.05c 2.41±0.03c 7.39±0.11c 7∶1 91.38±0.16a 0.55±0.02d 3.26±0.05d 1.83±0.01d 5.64±0.02d 9∶1 91.58±0.06a 0.46±0.01e 3.27±0.02d 1.76±0.01e 5.49±0.00e
2.1.2 漂洗次数对鸭肉肌原纤维蛋白提取效果的影响
漂洗次数对鸭肉肌原纤维蛋白基本营养成分含量的影响结果见表4，漂洗次数对鸭肉肌原纤维蛋白感官评分的影响结果见图2。
由表4和图2可知，漂洗次数在1次～4次时，随着漂洗次数的增加，蛋白质含量和感官评分呈上升趋势，脂肪、灰分、水分含量总和呈下降趋势；但漂洗次数超过4次后，漂洗次数的增加对试样感官评分影响极其微小，漂洗4次与漂洗1、2、3次相比，蛋白质含量、脂肪含量、水分含量具有显著性差异。这表明在一定范围内，凉水漂洗次数越多，肌原纤维蛋白的提取效果越好；但漂洗次数过多，反而对肌原纤维蛋白的提取不利。其原因可能是在一定范围内，漂洗次数越多，水与肉粒间相互挤压、摩擦、碰撞的概率和频次越高，便于肉粒在水中的均匀分布，这对肌原纤维蛋白的提取是非常有利的。但漂洗次数过多，则可能会引起肌原纤维蛋白的轻微流失和肉质亲水膨胀程度的增加，而亲水膨胀程度的增加则不利于蛋白质的脱水干燥，也会影响蛋白质含量。同时漂洗次数过多也易造成水、电、人工等消耗的增加。综合考虑提取效果和成本因素，因此漂洗次数确定为4次较为适宜。
表4 漂洗次数对鸭肉肌原纤维蛋白基本营养成分含量的影响
Table 4 Influence of rinsing times on basic nutrient content of duck myofibrin
注：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
漂洗次数 蛋白质含量/% 脂肪含量/% 水分含量/% 灰分含量/% 脂肪、水分、灰分含量总和/%1 82.11±0.22d 5.33±0.03a 5.12±0.09a 3.21±0.05a 13.66±0.10a 2 86.51±0.31c 3.09±0.07b 4.11±0.07c 2.31±0.12b 9.51±0.36b 3 90.95±0.34b 0.72±0.04c 4.05±0.04c 1.72±0.08c 6.46±0.30c 4 91.66±0.06a 0.39±0.01d 3.91±0.04d 1.65±0.06c 5.95±0.14d 5 91.11±0.36b 0.38±0.02d 4.72±0.07b 1.62±0.07c 6.72±0.18c
图2 漂洗次数对鸭肉肌原纤维蛋白感官评分的影响
Fig.2 Influence of rinsing times on sensory evaluation of duck myofibrin
2.1.3 漂洗时间对鸭肉肌原纤维蛋白提取效果的影响
漂洗时间对鸭肉肌原纤维蛋白基本营养成分含量的影响结果见表5，漂洗时间对鸭肉肌原纤维蛋白感官评分的影响结果见图3。
表5 漂洗时间对鸭肉肌原纤维蛋白基本营养成分含量的影响
Table 5 Influence of rinsing time on basic nutrient content of duck myofibrin
注：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
漂洗时间/min 蛋白质含量/% 脂肪含量/% 水分含量/% 灰分含量/% 脂肪、水分、灰分含量总和/%6 83.76±0.48d 3.78±0.03a 4.86±0.03a 3.00±0.02a 11.64±0.08a 8 88.02±0.24c 1.45±0.03b 4.77±0.03b 2.29±0.01b 8.51±0.01b 10 90.20±0.41b 0.68±0.02c 4.53±0.04c 1.69±0.02c 6.90±0.04c 12 92.21±0.23a 0.37±0.01d 3.30±0.02d 1.48±0.02d 5.15±0.05d 14 92.38±0.18a 0.31±0.01e 3.25±0.03d 1.45±0.02d 5.01±0.06e
图3 漂洗时间对鸭肉肌原纤维蛋白感官评分的影响
Fig.3 Influence of rinsing time on sensory evaluation of duck myofibrin
由表5和图3可知，随着凉水漂洗时间的延长，蛋白质含量和感官评分呈上升趋势，脂肪、灰分、水分含量总和呈下降趋势，漂洗时间12 min与漂洗时间6、8、10 min相比，蛋白质含量、脂肪含量、水分含量、灰分含量具有显著性差异（P＜0.05），漂洗时间 6 min～12 min时上述变化趋势较为明显，12 min～14 min范围内变化趋势非常平缓。一般情况下，漂洗时间越长，肉粒中的水溶性成分（无机盐、血色素、酶等）越有充足的时间向水中溶解扩散，脂肪微粒也因受水冲击时间充分更易与肉分离，这对于肌原纤维蛋白的提取分离都是非常有利的。但漂洗时间过长则对肌原纤维蛋白提取效果影响不明显，还会造成资源浪费、降低生产效率、提高生产成本。综合考虑提取效果、资源节约、成本控制等因素，将漂洗时间确定为12 min较为适宜。
2.1.4 颗粒大小对鸭肉肌原纤维蛋白提取效果的影响
颗粒大小对鸭肉肌原纤维蛋白基本营养成分含量的影响结果见表6，颗粒大小对鸭肉肌原纤维蛋白感官评分的影响结果见图4。
图4 颗粒大小对鸭肉肌原纤维蛋白感官评分的影响
Fig.4 Influence of particle size on sensory evaluation of duck myofibrin
表6 颗粒大小对鸭肉肌原纤维蛋白基本营养成分含量的影响
Table 6 Influence of particle size on basic nutrient content of duck myofibrin
注：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
6 83.05±0.16e 5.95±0.06a 5.01±0.10a 3.03±0.05a 13.99±0.21a
由表6和图4可知，鸭肉肌原纤维蛋白的提取效果随着肉颗粒大小的增加呈现先增加后减少的趋势，在颗粒大小为3 mm时达到最佳状态，颗粒大小为3 mm与颗粒大小为4、5、6 mm相比，蛋白质含量、脂肪含量、水分含量、灰分含量具有显著性差异（P<0.05）。其原因可能是肉颗粒尺寸偏大不利于蛋白质的提取分离及脂肪、灰分、糖类、色素、腥味成分（血污、氨类等）等的去除。一方面因为颗粒变大后，肉粒与水接触的表面积变小，会影响水溶性成分和脂肪分子的溶解分散，不利于水分子向肉组织中的渗透和蛋白质提取物的脱水干燥；另一方面，颗粒变大，相当于肉粒个体数量减少，漂洗时肉粒间挤压、摩擦、碰撞的可能性降低，不利于肌原纤维蛋白质的提取分离。但肉粒并非越小越好，因为颗粒过小肉粒容易呈浆糊状黏结在一起，不利于水溶性成分的溶出和蛋白提取物的脱水干燥，肉颗粒大小为3 mm时，肌原纤维蛋白提取效果优于肉颗粒大小为2 mm的提取效果。综上所述，颗粒大小确定为3 mm较为适宜。
2.2 正交试验结果
根据2.1单因素试验结果，以水料质量比、漂洗次数、漂洗时间和鸭肉颗粒大小为主要因素，按照1.4.3的方法开展L9（34）正交试验并进行结果分析，确定凉水漂洗法提取鸭肉肌原纤维蛋白的最佳工艺参数。正交试验结果见表7。
表7 正交试验结果
Table 7 Results of orthogonal test
试验号 因素 蛋白质含量/%A BC D脂肪、灰分、水分含量总和/% 感官评分1 88.16 8.36 89.1 2 1 2 2 2 90.68 7.25 92.2 1 1 1 1 3 89.92 8.10 91.2 4 2 1 2 3 88.27 8.11 89.3 1 3 3 3 5 92.83 5.88 93.8 6 2 3 1 2 91.79 6.12 93.0 2 2 3 1 7 87.95 8.67 89.2 8 3 2 1 3 89.85 8.29 91.0 3 1 3 2 9 3 3 2 1 91.98 6.03 93.2蛋白质含量 K1 268.761 264.381 269.799 272.970 K2 272.889 273.360 270.930 270.420 K3 269.781 273.690 270.699 268.041 k1 89.587 88.127 89.933 90.990 k2 90.963 91.120 90.310 90.140 k3 89.927 91.230 90.233 89.347 R 1.376 3.103 0.377 1.643
续表7 正交试验结果
Continue table 7 Results of orthogonal test
试验号 因素 蛋白质含量/%A BC D脂肪、灰分、水分含量总和/% 感官评分脂肪、灰分、水分含量总和K1 23.709 25.140 22.770 20.271 K2 20.109 21.420 21.390 22.041 K3 22.989 20.250 22.650 24.501 k1 7.903 8.380 7.590 6.757 k2 6.703 7.140 7.130 7.347 k3 7.663 6.750 7.550 8.167 R 1.200 1.630 0.460 1.410感官评分 K1 272.499 267.600 273.099 276.099 K2 276.099 276.999 274.701 274.401 K3 273.399 277.401 274.200 271.500 k1 90.833 89.200 91.033 92.033 k2 92.033 92.333 91.567 91.467 k3 91.133 92.467 91.400 90.500 R 1.200 3.267 0.534 1.533
由表7可知，影响鸭肉肌原纤维蛋白样品蛋白质含量的各因素主次关系为B＞D＞A＞C，最优组合为A2B3C2D1；影响样品脂肪、灰分、水分含量总和的各因素主次关系为 B＞D＞A＞C，最优组合为 A2B3C2D1；影响样品感官评分的各因素主次关系为B＞D＞A＞C，最优组合为A2B3C2D1。从以上3个结果综合分析：影响鸭肉肌原纤维蛋白提取效果的各因素主次关系为B＞D＞A＞C，即凉水漂洗次数＞鸭肉颗粒大小＞水料质量比＞凉水漂洗时间；其最优组合为A2B3C2D1，即水料质量比7∶1、凉水漂洗次数5次、凉水漂洗时间12 min、鸭肉颗粒大小2 mm。
2.3 验证试验
因上述最优组合没有在正交试验中出现，故还需据此开展验证性试验加以验证，经3次重复试验，鸭肉肌原纤维蛋白样品的蛋白质含量达92.91%，脂肪、灰分、水分含量总和达5.67%，感官评分94.10，优于正交试验表中的A2B2C3D1组合。提取的鸭肉肌原纤维蛋白色泽微黄（见图5）、无腥味、颗粒均匀、组织松散，故将A2B3C2D1组合确定为鸭肉肌原纤维蛋白提取的最佳工艺技术参数。
图5 最优条件提取制备的鸭肉肌原纤维蛋白
Fig.5 Extracted and prepared duck myofibrin under optimal conditions
3 结论
借鉴冷冻鱼糜加工过程中冷水漂洗法提取鱼肉肌原纤维蛋白的生产工艺，通过单因素试验和正交试验，确定凉水漂洗法提取鸭肉肌原纤维蛋白的最佳工艺技术条件为水料质量比7∶1、漂洗次数5次、漂洗时间12 min、鸭肉颗粒大小2 mm。在此条件下，提取的鸭肉肌原纤维蛋白色泽微黄、无腥味、颗粒均匀、组织松散，蛋白质含量达92.91%。与常规禽肉蛋白质提取方法相比，该法的最大优点是整个提取过程中不使用除水以外的任何化学物质，所得蛋白质天然、绿色、安全，更有利于健康。对于提取过程中部分水溶性蛋白质的流失的问题还有待于今后进一步深入研究。
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