长根菇（Oudemansiella radicata）又名黑皮鸡枞菌、姬白蚁菌、蚁枞等，属于担子菌亚门，伞菌目，白蘑科，
富含氨基酸、三萜类、糖类、多酚等多种营养和生物活性成分[1-4]。具有免疫调节[5]、抗肿瘤[6]、抗氧化[7]等多种生理功能。植物多酚是植物新陈代谢过程中产生的化学成分，主要存在于植物的根、树皮、树叶和果实中，是一种重要的生物活性成分[8]。多酚中的大多数处于游离状态属于游离酚，另外一些则与其他物质结合为结合酚[9]。国内外研究表明多酚具有多种活性功能，如抑制细菌[10]、抗氧化[11-12]、抗癌[13]、抗炎[14]、抗病毒[15]和改善情绪[16]等。
本文主要通过超声辅助浸提长根菇多酚，采用响应面法对提取工艺进行优化，并考察其对·OH、DPPH·和ABTS+·的清除能力，为长根菇活性成分的提取以及在各种抗氧化功能食品中的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂设备
长根菇：中山市高校毕业生创业农业孵化基地。酒石碳酸钾钠：洛阳昊华化学试剂有限公司；福林酚试剂：上海罗恩试剂有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠：上海仪电科学仪器股份有限公司；过硫酸钾：广州凌飞化工有限公司；没食子酸：合肥千盛生物科技有限公司；2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：合肥巴斯夫生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，以上试剂均为分析纯。
MTQ 500电子天平：深圳市美孚电子有限公司；TG16-WS高速台式离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；UV759CRT紫外可见分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；8812电热恒温鼓风干燥箱：苏州昇远科技有限公司；3S超声波反应器：苏州江大五棵松生物科技有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 长根菇多酚的提取
将长根菇干制品放置于干燥箱中，烘干至恒重，过80目筛后置于密封袋在干燥条件下保存，采用超声辅助法提取多酚。在前期预试验基础上，称取适量长根菇粉末，按照试验条件加入一定浓度的乙醇溶液，置于超声波反应器，在超声功率300 W、频率28 kHz、温度40℃条件下提取多酚，设置不同的时间，超声提取后5 000 r/min离心15 min，取上清液，用福林-酚比色法测定上清液的多酚含量。
1.2.2 多酚含量的测定
采用福林-酚比色法测定长根菇多酚的含量，参考郭鸿儒[17]的方法，略作修改。配制5 mg/mL没食子酸标准溶液，然后分别取 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 没食子酸标准溶液定容至25 mL，加入0.2 mL福林酚，摇匀后反应3 min～8 min，再依次加入2 mL质量分数为7.5%的NaCO3溶液。混匀后反应1 h，760 nm处测定吸光度并绘制标准曲线，计算得到线性回归方程为y=21.112x-0.279 3，其中R2=0.9926，y为吸光度，x为没食子酸标准溶液浓度。样品中多酚含量按照公式（1）计算。
式中：M表示样品多酚含量，mg/g；X表示按一定比例稀释后的样品根据所绘制的标准曲线得到的质量浓度，g/mL；m表示样品质量，g；V表示样品液定容体积，mL；N表示样品液稀释倍数。
1.2.3 长根菇多酚提取工艺条件优化
1.2.3.1 单因素试验
以长根菇多酚得率为指标，分别考察液料比[10∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1（mL/g）]、乙醇浓度（25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%）、超声时间（30、60、90、120、150 min）对长根菇多酚得率的影响，以确定最佳单因素水平。
1.2.3.2 响应面试验设计
在单因素试验基础上，以长根菇多酚得率为响应值，对提取工艺条件进行响应面优化。响应面试验设计见表1。
表1 响应面因素与水平
Table 1 Levels and factors of Box-Behnken design
度/%C超声时间/min 30 0 40∶1 45 60 1 50∶1 55 90
1.2.4 长根菇多酚的体外抗氧化活性研究
1.2.4.1 DPPH自由基清除率的测定
参考Hou等[18]的方法测定长根菇多酚的DPPH自由基清除率。取2.0mL不同浓度的长根菇多酚提取液，依次加入2mL0.2mmol/LDPPH自由基溶液，室温25℃下混合静置反应30 min，在517 nm波长处测定吸光度记为Ai，空白对照为2.0 mL蒸馏水，吸光度记为Aj，另一空白对照为2.0 mL体积分数为95%乙醇溶液，吸光度记为A0。DPPH·清除率按照公式（2）计算。
1.2.4.2 ABTS+·清除率的测定
参考张友维[19]的方法，略作修改。乙醇调零，长根菇多酚提取液和VC配制成不同浓度测定其ABTS+·清除率。先准确吸取3 mL ABTS溶液和1 mL不同浓度的样品分别加入试管中，混匀后避光反应5 min，在734 nm处测得吸光度记为Rj；再使用移液枪准确吸取1 mL乙醇溶液和3 mL ABTS溶液加入试管中，混匀后避光反应5 min，在734 nm处测得吸光度记为Rk。ABTS+·清除率按照公式（3）计算。
1.2.4.3 ·OH清除率的测定
参照刘皓涵等[20]的方法，略作修改。将样品用蒸馏水稀释至不同浓度，取5.0 mL待测液与3.0 mL 0.3 mmol/mL FeSO4、2.0 mL 0.3 mmol/mL 水杨酸-乙醇和0.1 mL 0.03%H2O2混匀后37℃静置反应10 min，空白不添加H2O2溶液，在510 nm处测其吸光度记为A1；空白蒸馏水的吸光度记为A0。羟基自由基清除率按照公式（4）计算。
1.3 数据处理
采用SPSS 21.0软件进行数据分析，试验计量数据采用平均值±标准差表示。
2 结果与讨论
2.1 长根菇多酚提取工艺条件研究
2.1.1 单因素试验结果
2.1.1.1 液料比对长根菇多酚得率的影响
以多酚得率为指标，固定超声时间为60 min、乙醇浓度为75%，确定不同液料比对长根菇多酚提取量的影响，结果见图1。
图1 液料比对长根菇多酚得率的影响
Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on the yield of polyphenols
由图1可知，在一定液料比范围内，长根菇多酚得率随着溶剂体积的增大而升高，在液料比为50∶1（mL/g）时，多酚得率达到最高水平，为6.57%，当液料比超过50∶1（mL/g）时，多酚得率无明显变化。出现这种现象的原因可能是乙醇作为提取溶剂，有利于多酚的溶解，随着溶剂体积的增加，多酚得率也会上升。但随着溶剂体积的增加，过多的乙醇在提取多酚的同时还会溶出其他成分，因此提取长根菇多酚的最适液料比为50 ∶1（mL/g）。
2.1.1.2 超声时间对长根菇多酚得率的影响
以多酚得率为指标，固定液料比为50∶1（mL/g），乙醇浓度为75%，确定不同超声时间对长根菇多酚提取量的影响，结果见图2。
图2 超声时间对长根菇多酚得率的影响
Fig.2 Effect of sonication time on the yield of polyphenols
由图2可知，超声时间为30 min～60 min时，长根菇多酚得率随着超声时间的延长而升高，超声时间为60 min时，多酚得率达到最高水平，为6.58%，当超声时间超过60 min后，多酚得率明显降低。这可能是超声时间过长会破坏长根菇多酚类物质中的邻二酚羟基等基团，从而导致多酚提取量下降，因此提取长根菇多酚的最佳超声时间为60 min。
2.1.1.3 乙醇浓度对对长根菇多酚得率的影响
以多酚得率为指标，固定液料比为50∶1（mL/g）、超声时间为60 min，研究不同乙醇浓度对长根菇多酚提取量的影响，结果见图3。
图3 乙醇浓度对长根菇多酚得率的影响
Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of polyphenols
由图3可知，乙醇浓度为25%～45%时，随着乙醇浓度的增加，多酚得率不断升高，而且呈现较快的增长速度，当乙醇浓度为45%时，多酚得率最高，为9.12%，随后下降。原因可能是乙醇浓度过高时，多酚与溶剂的极性相差很大，蛋白质变性沉淀，同时会有大量脂溶性、醇溶性物质溶解，导致酚类化合物的溶解度降低，因此选择最佳乙醇浓度为45%。
2.1.2 响应面试验设计及结果
在单因素试验基础上，对长根菇多酚提取工艺条件进行优化，响应面试验设计及结果见表2，回归模型的方差分析数据见表3。
表2 响应面试验设计及结果
Table 2 Response surface design and results
编号A液料比/（mL/g）B乙醇浓度/%C超声时间/min 得率R/%40∶1 55 90 4.4 2 30∶1 45 30 5.9 3 50∶1 45 90 8.8 4 30∶1 55 60 4.2 5 40∶1 45 60 9.2 6 40∶1 55 30 4.2 7 40∶1 45 60 8.7 8 40∶1 45 60 8.7 9 50∶1 55 60 7.1 10 30∶1 35 60 4.8 11 40∶1 35 30 4.5 12 40∶1 35 90 4.8 13 50∶1 45 30 7.8 14 40∶1 45 60 8.8 15 30∶1 45 90 5.9 16 50∶1 35 60 6.4 17 40∶1 45 60 8.9 1
表3 回归模型的方差分析
Table 3 Analysis of variance in response surface
注：**表示差异极显著（P<0.01）；*表示差异显著（P<0.05）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 60.17 9 6.69 158.90 <0.000 1 **A 10.81 1 10.81 256.97 <0.000 1 **B 0.045 1 0.045 1.07 0.335 4 C 0.28 1 0.28 6.69 0.036 2 *AB 0.42 1 0.42 10.04 0.015 7 *AC 0.25 1 0.25 5.94 0.044 9 *BC 2.5×10-3 1 2.5×10-3 0.059 0.814 4 A2 0.39 1 0.39 9.31 0.018 6 *B2 36.15 1 36.15 859.18 <0.000 1 **C2 8.91 1 8.91 211.87 <0.000 1 **残差 0.29 7 0.042失拟项 0.12 3 0.041 0.95 0.496 7纯误差 0.17 4 0.043总差 60.46 16
对试验结果进行二次回归分析，计算得到回归方程：R=8.86+1.16A-0.075B+0.19C+0.32AB+0.25AC-0.025BC-0.31A2-2.935B2-1.45C2。由表3可知，此模型的P＜0.000 1，表明长根菇多酚得率的回归模型的结果极显著。失拟项F值为0.95，由此可以看出回归模型的计算结果和检验结果的差异并没有表现出显著性。回归模型的总决定系数R2=0.995 1，显示该试验模型可靠；其修正相关系数R2adj=0.988 9，变异系数CV为3.08%，表明长根菇多酚得率的回归模型拟合性好，可以较好地预测长根菇多酚得率试验结果。综上所述，该模型可被用于分析和预测长根菇多酚的最佳提取工艺。由表3可知，液料比对长根菇多酚得率影响极显著，超声时间对多酚得率影响显著，乙醇浓度对多酚得率影响不显著。对比3个因素的F值的大小，可以推测出3个试验因素对多酚得率的影响顺序为液料比（A）＞超声时间（C）＞乙醇浓度（B）。
2.1.3 响应面试验的交互因素分析
分别将模型中的一个因素固定在中间水平，得到另外2个因素交互作用对多酚得率影响的子模型，并根据模型绘制三维曲面图，见图4。
图4 液料比、乙醇浓度和超声时间交互作用对长根菇多酚得率的影响
Fig.4 Effect of interaction of liquid-to-material ratio，ethanol concentration，and sonication time on the yield of polyphenols
由图4可知，当液料比不变时，随着乙醇浓度的增大，多酚得率呈先上升后下降的趋势；当乙醇浓度不变时，随着溶剂体积的变化，多酚得率逐渐增加；当液料比不变时，随着超声时间的逐渐延长，多酚得率呈现先上升后下降的趋势；当超声时间保持不变时，随着溶剂体积的增加，多酚得率逐渐升高；当乙醇浓度保持不变时，随着超声时间的延长，多酚得率呈先上升后下降的趋势；当超声时间保持不变时，随着乙醇浓度的增加，多酚得率呈现先上升后下降的趋势。
根据Design-Expert软件优化，得到长根菇多酚提取的最佳工艺条件为乙醇浓度45%、超声时间65 min、液料比50∶1（mL/g），在该条件下，长根菇多酚的得率可达到9.76 mg/g。为检验模型预测的准确性，采用以上得到的最佳提取条件提取3次，实际得到长根菇多酚的平均得率为9.82 mg/g，与预测值拟合率为99.39%，表明预测值和实际值良好吻合，优化模型可靠。
2.2 长根菇多酚体外抗氧化活性
2.2.1 ABTS+·清除能力
长根菇多酚的ABTS+·清除率如图5所示。
图5 长根菇多酚与VC的ABTS+·清除能力
Fig.5 ABTS+·scavenging rate of VCand polyphenols
由图5可知，多酚与VC的ABTS+·清除率均随浓度的升高而升高，具有明显的浓度依赖性。多酚与VC的ABTS+·清除率的IC50分别为280 μg/mL和170 μg/mL，多酚的ABTS+·清除能力略低于VC，当浓度为1 000μg/mL时，多酚与VC的ABTS+·清除能力基本相同。
2.2.2 ·OH清除能力
长根菇多酚的·OH清除率如图6所示。
图6 长根菇多酚与VC的·OH清除能力
Fig.6·OH scavenging rate of VCand polyphenols
由图6可知，多酚与VC对·OH均有较好的清除作用，且均具有明显的剂量依赖性，当浓度为240 μg/mL时，多酚与VC的清除率最高，分别达到65.68%和79.63%。经计算多酚与VC对·OH清除率IC50分别为110.78 μg/mL 和 68.41 μg/mL，说明 VC的·OH 清除能力明显高于多酚。
2.2.3 DPPH·清除能力
长根菇多酚的DPPH·清除率如图7所示。
图7 长根菇多酚与VC的DPPH·清除能力
Fig.7 DPPH·scavenging rate of VCand polyphenols
由图7可知，多酚与VC的DPPH·清除率随浓度的增加逐渐上升，当浓度大于200 μg/mL时，多酚的DPPH·清除率增长缓慢。当浓度为300 μg/mL时，多酚与VC的DPPH·清除率分别为60.56%和95.71%。经计算多酚与VC的DPPH·清除率IC50分别为178.78 μg/mL和30.24 μg/mL，多酚的DPPH·自由基清除能力明显小于 VC。
3 结论
在单因素试验基础上，通过响应面试验优化得到长根菇多酚的最佳提取工艺条件为乙醇浓度45%、超声时间 65 min、液料比 50 ∶1（mL/g），在该条件下，长根菇多酚的得率达到9.82 mg/g；体外抗氧化研究表明，长根菇多酚具有较好的ABTS+·、·OH和DPPH·清除能力，且呈现剂量依赖性，其IC50分别为280、110.78μg/mL和 178.78 μg/mL，其中当浓度为 1 000 μg/mL 时多酚与VC的ABTS+·清除能力基本相同，其余浓度条件下均小于VC的ABTS+·、·OH和DPPH·清除能力。该研究为长根菇抗氧化产品的开发提供了一定的参考依据。
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