传统麦芽糖是我国历史悠久的淀粉糖食品，由麦类在发芽过程中产生的淀粉酶系水解淀粉制得[1-3]。麦芽中的淀粉酶主要有α-淀粉酶[4]、β-淀粉酶[5]和极限糊精酶等，多种淀粉酶的协同作用能够高效地将淀粉水解成麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖和葡聚糖等多种糖分[3，6-9]。相比蔗糖、葡萄糖等精制糖，传统麦芽糖由麦、米等谷物转化而来，谷物中的各类营养物质如蛋白质、氨基酸、维生素和矿物质等基本保留，营养价值较高，适宜大部分人群食用[2]。近年来，糖尿病患病人数持续增加。研究表明，人体持续性摄入过量的可消化糖能够引起糖尿病及其并发症[10-12]。传统麦芽糖食品可消化糖含量高，不能满足目前人们低糖、健康的饮食需求。
低聚异麦芽糖是一类含有一个或多个α-1，6糖苷键的低聚葡萄糖[13]。低聚异麦芽糖由于其特殊的分子结构，不能被口腔菌群发酵产酸，具有抗龋齿功能。同时，人体胃和肠道不能有效降解吸收低聚异麦芽糖，摄入低聚异麦芽糖不会升高血糖水平。并且低聚异麦芽糖能够增殖肠道双歧杆菌、提高肠道益生菌菌群占比，有利于机体健康。因此，低聚异麦芽糖是一种集甜味和保健功能于一体的功能性低聚糖[14-16]。另外，低聚异麦芽糖保湿性和黏度适中，适用于食品加工，糖果和糕点等食品中添加低聚异麦芽糖对食品质构无不良影响[17-18]。异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖也称为“有效三糖”，是低聚异麦芽糖的主要功能成分[19]。低聚异麦芽糖目前主要采用酶法催化生产[13-15]，以淀粉为原料，将淀粉酶法水解成麦芽糖，然后利用α-葡萄糖苷酶催化麦芽糖生成低聚异麦芽糖[20-22]。
本研究对传统麦芽糖制备过程中麦芽淀粉酶活性、糖化过程还原糖种类和含量等参数进行分析，并在糖化过程中添加α-葡萄糖苷酶，催化糖化液中的麦芽糖转化成低聚异麦芽糖，制作出含有低聚异麦芽糖的传统麦芽糖食品，旨在为传统食品利用现代生物技术提升健康功能提供思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
淮麦16号新鲜小麦、新鲜大米：市售；3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）溶液：常州市润友商贸有限公司；改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；葡萄糖、可溶性淀粉（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；食品级α-葡萄糖苷酶（酶活5.0×105U/mL）：江苏锐阳生物科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
恒温培养箱（StabS2型）：上海润度生物科技有限公司；恒温水浴锅（HH-1型）：国华（常州）仪器制造有限公司；离心机（1-14型）：德国Sigma公司；研磨机（YM-B05型）：品罗创新实业有限公司；紫外可见分光光度计（UV-1200B）：上海美谱达仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 麦芽培养与米饭制备
新鲜小麦用纯净水清洗3次后于纯净水中浸泡15h。利用育苗盘在20℃下进行麦芽培养，育苗盘中加入纯净水浸润小麦，每24h更换1次纯净水。小麦根须长出后，降低纯净水水位，使小麦根须接触到水即可。
利用纯净水清洗3次大米，然后加入1.5倍大米质量的纯净水，常压蒸煮30 min。
1.3.2 麦芽淀粉酶活力的测定
麦芽淀粉酶活力定义：每分钟催化淀粉水解产生相当于1 μmol葡萄糖还原力的还原糖的酶量为一个酶活力单位（1 U）。为了避免麦芽淀粉酶提取过程中由于麦芽研磨程度不同等因素造成的误差，本研究以每毫克麦芽蛋白中所含淀粉酶的酶活力，即淀粉酶比活力来分析麦芽培养过程中的淀粉酶活力变化情况。
于麦芽不同培养时间取适量麦芽加入5倍质量的纯净水，研磨机研磨2 min，研磨液8 000 r/min离心2 min，上清液即为麦芽淀粉酶酶液，用所得酶液进行蛋白浓度和淀粉酶活力测定。
蛋白浓度参照改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒说明书测定。
麦芽淀粉酶活力测定采用DNS法，以可溶性淀粉为底物[23]。稀释后的麦芽淀粉酶酶液与2%淀粉溶液按照体积比 1∶1混合，于50℃反应10 min，沸水浴10 min终止反应。反应液稀释适当倍数后与DNS溶液按照体积比1∶1混合，沸水浴15 min，冷却后于540 nm波长下测量吸光值。沸水浴失活的麦芽淀粉酶酶液进行相同的反应，并作为空白对照。
1.3.3 糖化过程
称取45 g培养的麦芽加入90 g纯净水，用研磨机研磨2min，与540g米饭混合均匀。密封并置于48、54、60℃水浴进行糖化。糖化过程中将糖化物混合均匀快速取样，糖化物1 g与5 mL纯净水振荡混匀，沸水浴10 min用以灭活淀粉酶，然后加纯净水定容至10 mL，充分振荡获得糖化物溶液。取出1 mL糖化物溶液8 000 r/min离心2 min，上清液稀释适当倍数后采用DNS法分析糖化物中还原糖总量。适当稀释后的糖化物溶液上清与DNS溶液按照体积比1∶1混合，沸水浴15 min，冷却后于540 nm波长下测量吸光值。
1.3.4 糖化物添加α-葡萄糖苷酶
取50 g糖化混合物于糖化开始分别加入0、15、20、25、30 μL α-葡萄糖苷酶，密封置于 54 ℃水浴进行糖化和转糖基反应。糖化过程中将糖化物混合均匀快速取样，糖化物样品1 g与5 mL纯净水振荡混匀，沸水浴10 min使淀粉酶和α-葡萄糖苷酶失活，然后加水定容至10 mL，充分振荡。取出1 mL溶解液8 000 r/min离心2 min，上清液稀释适当倍数后分析糖化液中糖的种类与含量。对于糖化过程中麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖、低聚异麦芽糖等糖的含量采用液相色谱分析，样品送至江南大学分析测试中心进行分析。
1.4 数据处理
所有试验均进行3次重复试验，所有数据用平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 麦芽培养过程淀粉酶活力分析
麦芽培养过程淀粉酶活力分析如图1所示。
图1 麦芽淀粉酶活力
Fig.1 The amylase activity in malt
如图1所示，干小麦（新鲜小麦）淀粉酶活力为6.7 U/mg蛋白，浸泡15 h后淀粉酶活力下降至5.0 U/mg蛋白。这一现象与艾志录等[24]的研究结果相似。根据赵玉锦等[25]和Yu等[4]的研究，这一现象出现的原因可能为在浸种开始后小麦胚中储存的淀粉酶被激活，然后输入到胚乳，在胚乳中淀粉酶吸附到淀粉颗粒上并结合。在提取淀粉酶离心处理过程中部分吸附到淀粉颗粒上的淀粉酶随淀粉颗粒沉降，吸附到淀粉颗粒并随淀粉颗粒沉降的淀粉酶，其酶活力无法检出。因此，小麦浸泡后所测的淀粉酶活力下降。在麦芽培养过程前24 h，麦芽淀粉酶活力由5.0 U/mg蛋白增加至7.0 U/mg蛋白。在麦芽培养24 h～48 h时，淀粉酶活力增加至23.6 U/mg蛋白，这与艾志录等[24]和王丽等[26]的研究结果相似。该结果表明种子萌发过程中淀粉酶大量合成。麦芽培养48 h后，淀粉酶活力增加不明显。因此，选择培养48 h的麦芽进行糖化制备麦芽糖。
2.2 温度对糖化过程的影响
已有研究指出，大麦芽中α-淀粉酶最适作用温度为55℃～60℃，β-淀粉酶最适作用温度为50℃～55℃[3]。同时，根据梁若楠等[27]和高熳熳等[28]对麦芽糖化工艺条件的研究，本研究选取48、54、60℃进行糖化，研究温度对糖化过程的影响，结果见图2。
图2 温度对糖化过程的影响
Fig.2 The effect of temperature on mashing process
如图2所示，温度越高糖化速度越快，糖化过程在9 h内快速进行，还原糖含量快速增加，9 h后糖化速度变慢。糖化12h后，48、54、60℃条件下糖化物中还原糖含量（葡萄糖当量）分别为104.5、121.6 g/kg和124.3 g/kg。同时，54℃和60℃糖化过程相近。48℃低于α-淀粉酶和β-淀粉酶最适催化温度，因此糖化过程中还原糖含量增加速度较慢。54℃和60℃处于α-淀粉酶和β-淀粉酶最适催化温度区间，因此糖化速度较快。9 h后糖化速度变慢，原因可能为1）淀粉酶能够接触到的底物淀粉基本被水解完全；2）保温时间长使淀粉酶失活；3）产物浓度过高抑制淀粉酶活性[3]。
2.3 低聚异麦芽糖合成
α-葡萄糖苷酶最适作用温度为52℃～56℃，因此选择54℃进行糖化和低聚异麦芽糖合成。9 h后糖化物中麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖和3种低聚异麦芽糖的含量见图3，3种低聚异麦芽糖（异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖）总量见图4，糖化物中糖的组分分析见图5。
图3 糖化物中麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖和3种低聚异麦芽糖的含量
Fig.3 The contents of maltose，glucose，maltotriose and three isomalto-oligosaccharides in mashing mixture
图4 可检测糖总量分析
Fig.4 The total contents of detectable sugars
图5 糖化物中糖的组分分析
Fig.5 The composition of sugars in mashing mixture
A.不添加 α-葡萄糖苷酶的糖化物；B.添加 25 μL α-葡萄糖苷酶的糖化物。a、b、c、d、e、f峰分别为葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖。
由图3、图5可知，不添加α-葡萄糖苷酶的糖化过程产生麦芽糖、葡萄糖和麦芽三糖含量分别为157.5、11.0 g/kg和18.7 g/kg，无异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖3种低聚异麦芽糖产生（图3、图5A）。糖化过程中加入α-葡萄糖苷酶可使麦芽糖和麦芽三糖含量明显下降，同时葡萄糖含量明显增加（图3、图5B）。这是由于α-葡萄糖苷酶具有水解糖苷和转糖苷双重功能，可从α-葡萄糖苷、双糖、低聚糖等的非还原性末端切开α-1，4糖苷键并释放出葡萄糖，又可将葡萄糖以α-1，6糖苷键连接到另一个葡萄糖或麦芽糖类底物上生成低聚异麦芽糖[20-22]。因此，在麦芽糖、麦芽三糖存在情况下α-葡萄糖苷酶催化合成低聚异麦芽糖会不可避免地水解麦芽糖和麦芽三糖生成葡萄糖[15]。随着α-葡萄糖苷酶添加量的增加，体系中低聚异麦芽糖总量逐渐增加，葡萄糖含量逐渐上升，麦芽糖和麦芽三糖的含量逐渐减少。添加 25 μL 和 30 μL α-葡萄糖苷酶低聚异麦芽糖总量相近，因此，50 g糖化混合物中添加25 μL α-葡萄糖苷酶能满足低聚异麦芽糖合成需求。
不添加α-葡萄糖苷酶，体系中可检测总糖量为187.2 g/kg。添加 25 μL α-葡萄糖苷酶后，体系中可检测总糖量为165 g/kg，其中麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖总量为79.9 g/kg，异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖总量为85.1 g/kg（图3）。添加α-葡萄糖苷酶后，体系中可检测的糖总量有所下降（图4）。推测原因是液相色谱对体系中的麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖和3种代表性低聚异麦芽糖（异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖）进行检测，但是在α-葡萄糖苷酶催化过程中也会产生其他低聚异麦芽糖如异麦芽四糖、异麦芽五糖等。与图5A相比，图5B显示在异麦芽三糖检测峰后（12 min～15 min）出现了其他检测峰，这些检测峰应该代表更大分子量的异麦芽四糖、异麦芽五糖等，这部分低聚异麦芽糖含量没有分析。因此，体系中可检测糖总量有所下降[15]。
通过添加α-葡萄糖苷酶，糖化物中麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖总量从187.2 g/kg降至79.9 g/kg，降低57.3%。同时，糖化物中产生低聚异麦芽糖，其中异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖占可检测糖总量的51.6%。该结果表明在传统麦芽糖制备过程中引入α-葡萄糖苷酶，与麦芽中的淀粉酶协同催化，同时进行糖化与转苷作用，将传统糖化过程产生的麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖等转化成低聚异麦芽糖，可制备含低聚异麦芽糖的传统麦芽糖食品。
3 结论
传统麦芽糖历史悠久，至今仍在各地传统美食中扮演重要角色。但是，传统麦芽糖不能满足目前人们对低糖、健康的饮食需求。本研究对麦芽中淀粉酶活性进行分析，确定合适的发芽时间为48 h。结合糖化过程与α-葡萄糖苷酶适宜作用温度，确定合适的糖化温度为54℃。通过分析糖化物中麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖和低聚异麦芽糖含量，确定α-葡萄糖苷酶最优添加量为每50 g糖化混合物添加25 μL。通过添加α-葡萄糖苷酶，糖化物中麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖总量从187.2g/kg降至79.9 g/kg，降低57.3%。同时，糖化物中产生低聚异麦芽糖，其中异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖总量为85.1 g/kg，占可检测糖总量的51.6%。糖化物通过后续加工可制作出直接食用的含低聚异麦芽糖的麦芽糖食品。本研究首次在传统麦芽糖制作糖化过程中添加α-葡萄糖苷酶，结果表明α-葡萄糖苷酶的添加可有效将传统麦芽糖制作糖化过程中产生的可消化糖转化成低聚异麦芽糖，明显降低可消化糖含量，同时生成具有保健功能的低聚异麦芽糖。相比直接在传统麦芽糖制作过程中添加商品化精制的低聚异麦芽糖产品来制备含低聚异麦芽糖的传统麦芽糖食品，添加α-葡萄糖苷酶的方法具有低成本优势，而且添加α-葡萄糖苷酶既能降低可消化糖含量，也不会对其他营养成分产生影响，这为传统食品利用现代生物技术提升健康功能提供了思路。
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