猕猴桃又名奇异果，富含维生素C、维生素A、氨基酸、可溶性膳食纤维、矿物质等营养成分[1-3]。除此之外，猕猴桃还富含黄酮类、多酚类、萜类等活性成分[4-6]，具有抗氧化、抗衰老、预防心血管疾病等多种功能[7-8]。猕猴桃果酒作为猕猴桃精深加工产品之一，具有独特的风格，市场前景广阔[9-10]。但单一的猕猴桃发酵果酒存在风味淡薄、香气不突出等问题。为了改善猕猴桃果酒风味淡薄的问题，将猕猴桃与红茶混合发酵，在酒香的基础上赋予茶香，使果酒香气更加馥郁。
近年来，对茶酒的研发引起人们的重视，将茶叶应用于酿造低度酒，如天麻茶酒[11]、柠檬茶酒[12]、卷丹百合茶酒[13]等。将水果与茶叶结合研发新型果茶酒是现在茶酒行业的发展趋势，与传统茶酒相比，新型果茶酒兼具茶香与果香的特点。目前，以猕猴桃和红茶为原料进行发酵所制果茶酒的研究鲜有报道，且两者结合是否能在丰富口感的基础上增加其抗氧化活性也是待解决的主要问题。
综上，本试验以猕猴桃和红茶为主要原料，采用单因素试验和正交试验优化猕猴桃茶酒的生产工艺并对猕猴桃茶酒抗氧化活性进行研究。本研究基于猕猴桃和茶均具有极高的食用价值，将两者结合以提高营养价值和经济价值，以期获得一款感官特性优良且具有较强抗氧化活性的新型茶酒，为猕猴桃与红茶资源综合利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
猕猴桃、白砂糖、红茶：市售；酿酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；果胶酶（初始酶活500 U/mg）：上海源叶生物科技有限公司；偏重亚硫酸钾（食品级）、没食子酸标准品（纯度≥98.0%）：成都市科龙化工实剂厂；福林酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：合肥博美生物科技有限责任公司；其它试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
JYZ-E25榨汁机：九阳股份有限公司；GZ-250-HS11培养箱：广智科技设备有限公司；STARTER 2C pH计：奥豪斯仪器有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；HWS-12电热恒温水浴锅：上海齐欣科学仪器有限公司；AR1140电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 猕猴桃茶酒工艺流程
猕猴桃茶酒工艺流程见图1。
图1 猕猴桃茶酒工艺流程
Fig.1 Processing technology of kiwifruit tea wine
将猕猴桃中的杂质等异形物去除，挑选无损伤的猕猴桃，清洗、去皮榨汁待用，果胶酶添加量为60 mg/L。1 g红茶用100 mL水浸泡，在超声功率300 W、超声温度80℃条件下，茶叶超声提取15 min得到红茶。前期预试验结果表明，猕猴桃与茶汁体积比为1∶1发酵，酒香更加充盈。因此，后续试验将超声提取后的红茶与猕猴桃果汁以体积比1∶1混合，用250mL锥形瓶发酵，加入白砂糖调整糖度，添加偏重亚硫酸钾160 mg/L，添加柠檬酸调整发酵液pH值。酵母活化，在质量分数为5%的糖水中加入活性干酵母，其中酵母与糖水比为1∶30（g/mL），37℃保温30 min。发酵结束后，过滤猕猴桃茶酒，并于65℃水浴保温30 min，进行巴氏灭菌。
1.3.2 猕猴桃茶酒工艺优化单因素试验
1.3.2.1 酵母接种量对猕猴桃茶酒的影响
在初始发酵pH值为3.5、初始糖度20°Brix、猕猴桃与茶汁体积比为1∶1时，调整不同酵母接种量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%），26℃恒温发酵 7 d，考察酵母接种量对猕猴桃茶酒的影响。
1.3.2.2 初始糖度对猕猴桃茶酒的影响
在初始发酵pH值为3.5、酵母接种量0.1%、猕猴桃与茶汁体积比为1∶1时，调整不同糖度（17、19、21、23、25 °Brix），26 ℃恒温发酵 7 d，考察初始糖度对猕猴桃茶酒的影响。
1.3.2.3 发酵温度对猕猴桃茶酒的影响
在初始发酵pH值为3.5、酵母接种量0.1%、初始糖度20°Brix、猕猴桃与茶汁体积比为1∶1时，调整不同发酵温度（22、24、26、28、30 ℃），恒温发酵 7 d，考察发酵温度对猕猴桃茶酒的影响。
1.3.2.4 发酵pH值对猕猴桃茶酒的影响
在酵母接种量0.1%、初始糖度20°Brix、猕猴桃与茶汁体积比为1∶1时，调整不同初始初始发酵pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0），26 ℃恒温发酵 7 d，考察初始发酵pH值对猕猴桃茶酒的影响。
1.3.3 猕猴桃茶酒工艺优化正交试验
在单因素试验的基础上，设计正交试验方案，确定最佳工艺条件组合。正交试验因素与水平见表1。
表1 正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal design
水平 A酵母接种量/%D初始发酵pH值1 0.8 21 24 3.0 2 1.0 23 26 3.5 3 1.2 25 28 4.0 B初始糖度/°Brix C发酵温度/℃
1.3.4 猕猴桃茶酒抗氧化活性分析
以0.3%维生素C溶液为阳性对照，猕猴桃茶酒稀释20倍，测定猕猴桃茶酒的DPPH自由基、2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate），ABTS] 阳离子自由基、·OH清除能力和铁离子还原能力，探究猕猴桃茶酒的抗氧化活性。
1.3.4.1 DPPH自由基清除能力测定
DPPH自由基清除能力参考金海炎等[14]的方法进行测定。
1.3.4.2 ABTS+自由基清除能力测定
ABTS+自由基清除能力参考吴双从等[15]的方法测定。
1.3.4.3 ·OH清除能力测定
·OH清除能力参考程宏桢等[16]的方法测定。
1.3.4.4 还原能力测定
还原能力参考程宏桢等[16]的方法测定。
1.3.4.5 总酚、总黄酮含量的测定
总酚含量采用福林酚法[17]测定。以没食子酸作为标准品进行定量，绘制没食子酸标准曲线，回归方程：y=0.235 1x-0.007 3，y为吸光度，x为没食子酸含量（mg/mL），相关系数 R2=0.996 9。
总黄酮含量参考李少鹏等[18]的方法测定。以芦丁作为标准品进行定量，绘制芦丁标准曲线，回归方程：y=0.189 8x-0.0177，y为吸光度，x为芦丁含量（mg/mL），相关系数R2=0.996 4。
1.4 理化指标与感官指标的测定
1.4.1 理化指标的测定
总酸含量参考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行测定[19]；酒精度采用酒精计测定；pH值采用pH计测定；可溶性固形物含量采用手持糖度计测定。
1.4.2 感官评定
挑选12名经过品评专业培训人员组成品评小组，感官评分参考葡萄酒与果酒评分标准。评分标准见表2。
表2 猕猴桃茶酒的感官评分标准
Table 2 Sensory scoring criteria of kiwifruit tea wine
项目 感官标准 分值外观（20） 黄色、澄清、透明，光泽感强 18～20澄清透明，无明显悬浮物，有一定光泽感 15～17澄清，无夹杂物，基本无光泽 12～14浑浊，色泽暗淡 0～11香气（30） 茶香、果香、酒香浓郁，协调 27～30果香、茶香、酒香偏淡，尚怡悦 23～26酒香、果香、茶香单薄，但无不良气味 18～22酒香、果香、茶香不足，有不良气味 0～17口感（40） 酒体丰满，茶味适中，醇厚协调，爽口 36～40酒体柔顺，有茶味，稍苦涩 30～35酒体较醇厚，偏酸，无茶味，无不良口味 24～29酒体寡淡，苦涩味重，或酸味重 0～23典型性（10） 典型完美，风味独特和谐 9～10有典型性 7～8略带特有风味，缺少典型性 5～6没有典型性 0～4
1.5 数据分析
使用Excel 2010处理数据，每组试验重复3次；使用SPSS 25.0软件进行统计分析；使用Origin 2021软件作图。
2 结果与分析
2.1 猕猴桃茶酒单因素试验结果
2.1.1 酵母接种量对猕猴桃茶酒品质的影响
酵母接种量对猕猴桃茶酒品质的影响见表3。
表3 酵母接种量对猕猴桃茶酒品质的影响
Table 3 Effect of yeast inoculation amount on the quality of kiwifruit tea wine
注：同列不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
酵母接种量/% 酒精度/%vol 感官评分0.4 8.37±0.14e 59.29±0.11e 0.6 8.79±0.15d 64.37±0.14d 0.8 9.89±0.12c 73.43±0.13b 1.0 11.35±0.13b 77.84±0.11a 1.2 11.72±0.12a 69.36±0.12c
由表3可知，猕猴桃茶酒的感官评分随着酵母接种量的增加呈先升高后降低的趋势。酵母接种量为1.0%时，感官评分最高，为77.84，且显著高于其它接种量的感官评分（p＜0.05）。酵母接种量对猕猴桃茶酒精度影响较大，不同处理组间差异显著（p＜0.05）。酵母接种量直接影响茶酒的品质，这是由于酵母接种量过大，导致菌体生长过快，快速代谢大量副产物，进而对酒的风味产生不良影响[20]。而酵母接种量过小会导致发酵不充分，发酵速率慢，酒精转换量低。因此，选择酵母菌接种量0.8%、1.0%、1.2%用于后续试验。
2.1.2 初始糖度对猕猴桃茶酒品质的影响
初始糖度对猕猴桃茶酒品质的影响见表4。
表4 初始糖度对猕猴桃茶酒品质的影响
Table 4 Effect of initial sugar content on the quality of kiwifruit tea wine
注：同列不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
初始糖度/°Brix 酒精度/%vol 感官评分17 9.27±0.11e 60.14±0.10e 19 10.18±0.14d 63.23±0.15d 21 10.93±0.13c 64.76±0.13c 23 11.36±0.12b 79.46±0.14a 25 12.09±0.15a 72.59±0.12b
由表4可知，随着初始糖度的升高，猕猴桃茶酒感官评分呈现先上升后下降的趋势。初始糖度为23°Brix时，感官评分最高，为79.46，且显著高于其它组（p＜0.05）；当初始糖度为 17 °Brix～25 °Brix时，酒精度随着初始糖度的增加呈上升的趋势。当初始糖度为25°Brix时，其酒精度为 12.09%vol，显著高于其它组（p＜0.05）。糖作为酵母细胞生长的能源物质，决定了酵母新陈代谢的快慢，从而影响发酵进程及酒精生产。但糖度过高，会影响酒的感官品质[21]，基质中糖度过高可能会对其它微生物活动产生不利影响。因此，选择初始糖浓度 21、23、25 °Brix用于后续试验。
2.1.3 发酵温度对猕猴桃茶酒品质的影响
发酵温度对猕猴桃茶酒品质的影响见表5。
表5 不同发酵温度对猕猴桃茶酒品质的影响
Table 5 Effect of fermentation temperature on the quality of kiwifruit tea wine
注：同列不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
发酵温度/℃ 酒精度/%vol 感官评分22 9.34±0.11e 72.37±0.12d 24 10.72±0.15c 74.24±0.13c 26 11.58±0.12a 77.12±0.13b 28 11.19±0.12b 78.61±0.15a 30 9.58±0.14d 65.56±0.13e
由表5可知，随着发酵温度的升高，猕猴桃茶酒的感官评分与酒精度均呈先上升后下降的趋势。发酵温度为26℃时，酒精度达到最高值11.58%vol，而感官评分在28℃时达到最大值78.61，发酵温度对猕猴桃茶酒精度影响较大，不同处理组差异显著（p＜0.05）。发酵温度越高，猕猴桃茶酒挥发性香气成分越容易损失，所以发酵温度的升高不利于酒的感官品质；由于26℃与28℃时的猕猴桃茶酒感官评分差异不大，且酵母生长代谢有最适温度区间，过高或过低的温度均会影响酵母生长代谢，不利于酒精的生产转化[22]。因此，选择发酵温度24、26、28℃用于后续试验。
2.1.4 初始发酵pH值对猕猴桃茶酒品质的影响
初始发酵pH值对猕猴桃茶酒品质的影响见表6。
表6 初始发酵pH值对猕猴桃茶酒品质的影响
Table 6 Effect of initial pH on the quality of kiwifruit tea wine
注：同列不同小写字母表示差异显著（p＜0.05）。
初始发酵pH值 酒精度/%vol 感官评分3.0 10.43±0.13b 71.25±0.12c 3.5 11.38±0.10a 77.53±0.11a 4.0 9.67±0.11c 75.44±0.15b 4.5 9.11±0.12d 69.38±0.13d 5.0 8.45±0.11e 63.95±0.14e
由表6可知，猕猴桃茶酒的感官评分与酒精度随着pH值的升高均呈先升高后下降的趋势。pH值为3.5时，猕猴桃茶酒的酒精度和感官评分均为最高值，分别为11.38%vol和77.53，与其他各组差异显著（p＜0.05）。但当pH值高于3.5时，猕猴桃茶酒的酒精度与感官评分均迅速下降，可能是由于pH值的升高，会导致猕猴桃茶酒发生不良化学反应，如氧化褐变。因此，选择初始发酵pH3.0、3.5、4.0用于后续试验。
2.2 正交试验结果
根据单因素试验结果，选择酵母接种量（A）、初始糖度（B）、发酵温度（C）和初始发酵 pH 值（D）4个因素，以感官评分与酒精度为评价指标，采用L9（34）正交试验设计对猕猴桃茶酒发酵工艺进行优化。正交试验设计方案及结果分析见表7。
表7 正交试验结果
Table 7 Orthogonal test results
试验号 A酵母接种量感官评分1 1 1 1 1 9.4 67.9 2 1 2 2 2 10.5 71.2 3 1 3 3 3 9.8 70.9 4 2 1 2 3 11.6 77.0 5 2 2 3 1 10.5 71.7 6 2 3 1 2 11.3 65.1 7 3 1 3 2 8.1 72.6 8 3 2 1 3 11.6 73.4 9 3 3 2 1 10.1 74.6 B初始糖度C发酵温度D初始发酵pH值酒精度/%vol
续表7 正交试验结果
Continue table 7 Orthogonal test results
试验号酒精度A酵母接种量B初始糖度C发酵温度D初始发酵pH值酒精度/%vol感官评分感官评分k1 k2 k3 R k1 k2 k3 R 9.900 9.700 10.767 10.000 11.133 10.867 10.733 9.967 9.933 10.400 9.467 11.000 1.233 1.167 1.300 1.033 70.000 72.500 68.800 71.400 71.267 72.100 74.267 69.633 73.533 70.200 71.733 73.767 3.533 2.300 5.467 4.134
由表7可知，以酒精度和感官评分作为评价指标的最优组合分别为A2B2C1D3和A3B1C2D3，由极差R可知，影响猕猴桃茶酒酒精度和感官评价因素主次顺序分别为 C＞A＞B＞D，C＞A＞D＞B；综合考虑酒精度与感官评分，猕猴桃茶酒工艺的理论最优组合为A2B2C2D3（验证组）。由L9（34）正交试验结果可知A2B1C2D3组合酒精度与感官评分均为最高，因此，将直观分析所得的最优组合A2B1C2D3作为对照组和由均值k得到的理论最优组合A2B2C2D3作为验证组同时进行3次重复验证试验，结果见表8。
表8 验证试验数据
Table 8 Data of validation test
组别 酒精度/%vol 感官评分A2B1C2D3 11.5 76.4 A2B2C2D3 11.9 80.4
由表8可知，A2B2C2D3（验证组）的感官评分与酒精度均大于A2B1C2D3（对照组）。综合上述分析，确定正交试验的最优组合为A2B2C2D3，即最佳猕猴桃茶酒生产工艺条件为酵母接种量1.0%、发酵温度26℃、初始糖度23°Brix、初始发酵pH4。该工艺条件发酵后的猕猴桃茶酒酒精度为11.9%vol，感官评分为80.4。
3 猕猴桃茶酒的理化指标测定结果
3.1 理化指标结果
最优工艺条件发酵所得的猕猴桃茶酒的可溶性固形物含量 8.5 °Brix、酒精度 11.9%vol、总酸含量7.7 g/L、pH3.8、总酚含量1.57 mg/mL、总黄酮含量0.84 mg/mL。猕猴桃茶酒外观呈黄色，清亮透明，有光泽；具有优雅的猕猴桃果香气，茶香、酒香和谐；口感鲜美，醇和、爽口柔和，酸度适宜；酒体较协调，具有果酒的典型风格。综上，根据正交试验所得最优发酵条件生产的猕猴桃茶酒的感官指标、理化指标均符合国标要求。
3.2 抗氧化活性检测结果
抗氧化活性检测结果见图2。
图2 猕猴桃茶酒的抗氧化能力
Fig.2 Antioxidant capacity of kiwifruit tea wine
由图2（a）可知，猕猴桃茶酒DPPH自由基清除率随着猕猴桃茶酒用量增加而逐渐升高，在猕猴桃茶酒超过0.8 mL时抗氧化能力大于维生素C，此时的DPPH自由基清除率为93.7%，且在猕猴桃茶酒使用量超过0.8 mL时，其抗氧化能力逐渐趋于平缓，仅有轻微的上下浮动。
由图2（b）可知，猕猴桃茶酒ABTS+自由基清除率随着猕猴桃茶酒用量增加而逐渐升高，在样品用量超过1.6 mL时抗氧化能力与维生素C溶液的抗氧化能力接近，ABTS+自由基的清除率为93.4%。当样品用量低于1.6 mL时，维生素C溶液ABTS+自由基的清除率优于发酵的猕猴桃茶酒。
由图2（c）可知，猕猴桃茶酒·OH清除率在样品用量为0.2 mL～1.6 mL时，随着猕猴桃茶酒样品用量的增加，抗氧化能力明显增强，在样品用量1.6 mL时，猕猴桃茶酒·OH清除率为试验组内·OH自由基清除率的最大值，此时·OH的清除率为78.78%。维生素C溶液·OH的清除率一直优于发酵的猕猴桃茶酒。
由图2（d）可知，猕猴桃茶酒还原能力随着样品用量的增加呈先上升后趋于平稳的趋势。在猕猴桃茶酒样品用量为1.6 mL时，吸光度为0.947，与VC还原能力相当。还原能力的变化趋势区别于其他抗氧化指标的变化趋势可能与其抗氧化机制有关，其检测原理是抗氧化物质将三价铁还原为二价铁，二价铁与2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪生产蓝色物质，在593 nm处有最大吸收，吸光度越大表明猕猴桃茶酒的抗氧化性越高。
4 结论
以猕猴桃和红茶为原料，猕猴桃茶酒的最优发酵工艺条件为酵母接种量1.0%、猕猴桃果汁与红茶汤体积比1∶1、初始发酵pH值为4、初始糖度23°Brix，26℃发酵7 d，发酵制成猕猴桃红茶复合茶酒DPPH自由基、ABTS+自由基清除率均大于90%，总酚含量达到1.57 mg/mL，猕猴桃茶酒兼具猕猴桃果香与红茶清香，使两者在营养、香气及口感上互补且具有一定的抗氧化性。猕猴桃红茶复合茶酒的研发为茶酒产业发展开辟了新途径，对丰富猕猴桃产品及开发新型的茶酒具有一定的研究意义。
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