糖尿病是一种代谢性疾病，其发病原因多样且具有慢性高血糖的特征[1]。国际糖尿病联盟指出，2011年全球糖尿病患者人数已达3.7亿，其中80%在发展中国家，估计到2030年全球将有近5.5亿糖尿病患者[2]。肝损伤是糖尿病患者常见的慢性并发症之一[3-4]，研究表明，终末期的糖尿病患者由于肝病所导致的死亡人数远高于心血管疾病[5]。肝脏是人体最大的解毒器官且是最容易受损的器官之一[6]，是糖代谢的关键器官，糖尿病引起的高血糖如果超出了肝脏的清除能力范围，就会导致肝脏损伤并产生过量的氧自由基，使肝脏发生氧化应激反应从而引起细胞炎症因子的异常分泌，这是糖尿病导致肝损伤的主要机制[7]。目前临床治疗手段主要是针对糖尿病本身，并没有针对糖尿病所引发肝病的具体治疗方法。
魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）作为一种主要的活性成分分布于魔芋的块茎中并广泛应用于医药、食品和生物等领域[8]。KGM作为一种可溶性膳食纤维，其独特的结构赋予它许多优良特性，在食品应用领域，KGM具有增强免疫力、降血糖、降脂减肥、抗炎等多种保健功能[9]。但KGM存在分子量大、黏度大、溶解度小、溶解速度慢等问题，限制了其在食品中的应用[10]。通过将KGM降解，得到分子量较小的魔芋葡甘低聚糖（konjac manno-oligosaccharides，KOGM），KOGM是一种功能性低聚糖，具有提高机体抗氧化的能力以及降血脂、护肝、排毒与增强免疫功能的作用[11]。
目前尚无对魔芋葡甘聚糖和低聚糖复合材料功能性的研究，而鉴于魔芋葡甘聚糖和低聚糖均具有一定的保健功能，本课题组开发了一种魔芋精粉多酶酶解技术，对魔芋精粉进行适度酶解，使酶解物中同时含有适量速溶性葡甘聚糖和低聚糖，以便能生产出一种同时具有魔芋葡甘聚糖和低聚糖保健功能的复合性保健食品材料，同时克服魔芋精粉溶解速度过慢的缺陷。对该魔芋精粉酶解物的成分分析结果表明，该魔芋精粉酶解物中含有54.61%低聚糖，31.37%速溶性多糖和12.55%单糖。动物实验结果表明，该魔芋精粉酶解物同时具有降脂减肥、降血糖的功能，并对糖尿病引起的肝损伤和胰腺的损伤具有修复的功效。本文着重对其中的降血糖和对糖尿病大鼠的肝保护作用及其机制进行研究，旨在为魔芋精粉酶解物的进一步开发利用提供参考，进一步开发新型魔芋功能食品。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
魔芋精粉酶解物：陕西理工大学生物科学与工程学院黑色有机食品研究中心制备；8周龄SPF级雌性大鼠（体重220 g～260 g）：成都达硕实验动物有限公司；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）：阿拉丁试剂有限公司；柠檬酸、柠檬酸钠：上海试剂一厂；盐酸二甲双胍（批号：H20052118）：山东明仁福瑞达制药股份有限公司；二甲苯、三氯甲烷、异丙醇：天津市天力化学试剂有限公司；石蜡、苏木精-伊红染液：北京鼎国昌盛生物技术公司；中性树胶：中国上海标本模型厂；谷丙转氨酶（glutamic pyruvic transaminase，ALT）试剂盒、谷草转氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，AST）试剂盒、总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒：南京建成生物工程研究所；Trizol试剂：美国SIGMAALDRICH公司；Prime Script反转录试剂盒：中国TaKaRa公司；β-actin qPCR引物：西安热默尔生物技术公司；肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）、核因子E2相关因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative realtime polymerase chain reaction，qPCR）引物：通用生物系统（安徽）有限公司；活化B细胞κ轻链增强子的核因子（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）qPCR 引物：奥科鼎盛生物有限公司。所用化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
GA-3型血糖仪及试纸：三诺生物传感股份有限公司；RM23335CWEU型石蜡切片机：德国Leica有限公司；BPH-9162精密恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；KD-T电脑生物组织摊烤片机：科迪仪器设备有限公司；Motic BA400光学显微镜：日本奥林巴斯仪器有限公司；THERMO-GO酶标仪：日本日立公司；TDL-5C低速毫氏大容量离心机：湖南赫西仪器装备有限公司；ETC811基因扩增仪：东胜创新生物科技有限公司；ABI QuantStudio 1实时荧光定量PCR仪：赛默飞世尔科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 建模、给药及取材
适应性喂养大鼠1周后，单次注射STZ（45 mg/kg）建立糖尿病大鼠模型，对照组大鼠注射等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，1周后测定空腹血糖，挑选血糖值≥16.7 mmol/L[12]的大鼠随机分为模型组、二甲双胍组及魔芋精粉酶解物低、中、高剂量组，10只/组。
建模成功后，分别给予魔芋精粉酶解物低、中和高剂量组大鼠0.625、1.250、2.500 g/（kg·d）魔芋精粉酶解物[13]，给予二甲双胍组大鼠0.140 g/（kg·d）二甲双胍，给予对照组大鼠和模型组大鼠等体积生理盐水。连续给药6周，在每周末禁食12 h，不禁水，测量每组大鼠的体质量并测量其空腹血糖水平。
给药6周后，禁食12 h，不禁水，颈椎脱臼处死大鼠，眼球取血。将采集的血液置于4℃静置2 h，3 500 r/min离心10 min，收集上层血清，置于-80℃储存。将部分肝脏组织包裹在锡箔中并置于-80℃。用组织固定剂固定肝组织用于病理组织苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）观察。
1.3.2 血清相关指标的检测
按照试剂盒说明书检测 AST、ALT、MDA、T-SOD、GSH-Px。
1.3.3 实时荧光定量聚合酶链式反应检测肝组织中mRNA表达
采用Trizol法提取大鼠肝组织总RNA，按照Prime Script反转录试剂盒说明，反转录获得相应cDNA。以鼠β-actin作为内参基因，采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测大鼠肝组织中TNF-α、NF-κB和Nrf2基因的mRNA表达水平，每个基因设置3个重复。扩增体系：SYBR-Green Mix 5 μL，Primer F/R 0.8 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 2.4 μL。反应程序：95 ℃预变性 10 min；95℃变性15 s；60℃退火1 min。溶解曲线收集信号的程序：95℃预变性 15 s；60℃变性1 min；95℃退火15 s。引物序列见表1。
表1 qPCR引物序列
Table 1 qPCR primer sequence
引物名称 引物序列（5'-3'）β-actin-F CGTTGACATCCGTAAAGAC β-actin-R TAGGAGCCAGGGCAGTA TNF-α-F CCACCACGCTCTTCTGTCTACTG TNF-α-R TGGGCTACGGGCTTGTCACT Nrf2-F CCAGCACATCCAGACAGACACC Nrf2-R GAATATCCAGGGCAAGCGACTC NF-κB-F ACGAATCTGTTTCCCCTCATCT NF-κB-R TGGGTGCGTCTTAGTGGTATC
1.3.4 肝脏组织病理学
肝组织于4%多聚甲醛中避光固定24 h，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红（HE）染色，光学显微镜下观察病理情况。
1.4 数据处理
采集荧光实时定量PCR仪中每孔的阈值循环数（cycle threshold，Ct）值，采取F=2-ΔΔCt算法计算所检测基因的相对表达量，使用SPSS 26.0统计软件进行数据处理及统计学分析。结果以平均值±标准差形式表示，采取单因素方差分析及多重比较分析组间差异，P＜0.05视为差异具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 魔芋精粉酶解物对糖尿病大鼠体质量的影响
魔芋精粉酶解物对各组大鼠体质量的影响见表2。
表2 魔芋精粉酶解物对各组大鼠体质量的影响（n=10）
Table 2 Effect of enzymatic hydrolysate of konjac powder on body mass of rats in each group（n=10）
注：a表示与对照组比较差异显著（P＜0.05）；b表示与模型组比较差异显著（P＜0.05）；c表示与二甲双胍组比较差异显著（P＜0.05）；f表示与给药前比较差异显著（P＜0.05）。
组别 剂量/[g/（kg·d）]体质量/g给药前 给药6周末对照组 262.85±11.85 305.67±18.48f模型组 240.71±9.32a 240.71±20.50a二甲双胍组 0.140 232.14±6.98a 217.50±6.89abf魔芋精粉酶解物低剂量组0.625 230.23±8.06a 262.50±8.66abcf魔芋精粉酶解物中剂量组1.250 238.12±6.89a 255.53±9.88abcf魔芋精粉酶解物高剂量组2.500 238.88±3.76a 255.83±14.21abcf
如表2所示，与对照组大鼠比较，在给药前，模型组、二甲双胍组、魔芋精粉酶解物低、中和高剂量组大鼠体质量均显著下降（P＜0.05）。与模型组大鼠比较，在给药6周末，二甲双胍组大鼠体质量显著降低（P＜0.05），魔芋精粉酶解物低、中和高剂量组大鼠体质量显著提升（P＜0.05）。与二甲双胍组比较，在给药6周末，魔芋精粉酶解物低、中和高剂量组大鼠体质量显著上升（P＜0.05）。与给药前比较，二甲双胍组大鼠体质量显著降低（P＜0.05），对照组和魔芋精粉酶解物低、中和高剂量组大鼠体质量显著上升（P＜0.05）。综上所述，魔芋精粉酶解物与二甲双胍药物相比，更具有提升糖尿病体质量的效果。
2.2 魔芋精粉酶解物对糖尿病大鼠血糖的影响
魔芋精粉酶解物对各组大鼠血糖的影响见表3。
表3 魔芋精粉酶解物对各组大鼠血糖的影响（n=10）
Table 3 Effect of enzymatic hydrolysate of konjac flour on blood glucose of rats in each group（n=10）
注：a表示与对照组比较差异显著（P＜0.05）；b表示与模型组比较差异显著（P＜0.05）；f表示与给药前比较差异显著（P＜0.05）。
血糖/（mmol/L）给药前 给药6周末对照组 5.37±0.47 4.91±0.36模型组 27.45±3.17a 32.61±1.64a二甲双胍组 0.140 26.52±4.77a 21.62±2.36abf魔芋精粉酶解物低剂量组组别 剂量/[g/（kg·d）]0.625 25.70±0.84a 21.88±3.99abf魔芋精粉酶解物中剂量组1.250 27.03±2.90a 22.08±4.01abf魔芋精粉酶解物高剂量组2.500 27.47±1.89a 22.72±2.55abf
如表3所示，与对照组大鼠比较，在给药前，模型组、二甲双胍组、魔芋精粉酶解物低、中和高剂量组大鼠空腹血糖水平显著升高（P＜0.05）。与模型组大鼠比较，在给药6周末，二甲双胍组、魔芋精粉酶解物低、中和高剂量组大鼠空腹血糖水平显著降低（P＜0.05）。与给药前比较，二甲双胍组、魔芋精粉酶解物低、中和高剂量组大鼠空腹血糖水平显著降低（P＜0.05）。综上所述，魔芋精粉酶解物具有降低血糖的效果。
2.3 魔芋精粉酶解物对糖尿病大鼠血清中ALT、AST活性的影响
魔芋精粉酶解物对糖尿病大鼠血清中AST、ALT活性的影响见表4。
如表4所示，与对照组大鼠比较，模型组、二甲双胍组、魔芋精粉酶解物低、中和高剂量组大鼠血清中ALT、AST水平显著升高（P＜0.05）。与模型组大鼠比较，二甲双胍组和魔芋精粉酶解物低、中和高剂量组大鼠ALT水平显著下降（P＜0.05），魔芋精粉酶解物低、中剂量组AST水平显著下降（P＜0.05）。与二甲双胍组大鼠比较，魔芋精粉酶解物低、中剂量组AST水平显著下降（P＜0.05）。与魔芋精粉酶解物低剂量组比较，中剂量组大鼠血清中AST水平显著下降（P＜0.05），高剂量组大鼠血清中AST水平显著升高（P＜0.05）。与魔芋精粉酶解物中剂量组大鼠比较，高剂量组大鼠血清中AST水平显著升高（P＜0.05）。结果表明，魔芋精粉酶解物低、中和高剂量与二甲双胍一样，可显著降低糖尿病大鼠血清中ALT水平，并且魔芋精粉酶解物低、中剂量显著降低糖尿病大鼠血清中AST水平。综上所述，魔芋精粉酶解物相比二甲双胍能更有效改善糖尿病大鼠肝损伤程度。
表4 魔芋精粉酶解物对糖尿病大鼠血清中AST、ALT活性的影响（n=10）
Table 4 Effect of enzymatic hydrolysate of konjac flour on the activities of AST and ALT in serum of diabetic rats（n=10）
注：a表示与对照组比较差异显著（P＜0.05）；b表示与模型组比较差异显著（P＜0.05）；c表示与二甲双胍组比较差异显著（P＜0.05）；d表示与魔芋精粉酶解物低剂量组比较差异显著（P＜0.05）；e表示与魔芋精粉酶解物中剂量组比较差异显著（P＜0.05）。
组别剂量/[g/（kg·d）]ALT/（U/L）AST/（U/L）对照组 22.56±7.30 53.31±27.80模型组 83.03±6.78a 307.57±34.10a二甲双胍组 0.140 67.48±0.88ab 296.59±64.97a魔芋精粉酶解物低剂量组0.625 71.38±5.52ab 220.17±11.92abc魔芋精粉酶解物中剂量组1.250 58.99±19.54ab165.34±14.17abcd魔芋精粉酶解物高剂量组2.500 65.16±0.65ab 319.23±21.08ade
2.4 魔芋精粉酶解物对糖尿病大鼠血清中MDA、TSOD、GSH-Px的影响
魔芋精粉酶解物对糖尿病大鼠血清中MDA、TSOD、GSH-Px的影响见表5。
表5 魔芋精粉酶解物对糖尿病大鼠血清中MDA、T-SOD、GSHPx的影响（n=10）
Table 5 Effects of enzymatic hydrolysates of konjac flour on MDA，T-SOD and GSH-Px in serum of diabetic rats（n=10）
GSH-Px/（U/mL）对照组 4.25±0.46 94.59±4.70 694.78±62.57模型组 7.04±0.27a60.57±3.90a356.04±61.32a二甲双胍组 0.140 5.23±0.87ab85.89±14.02b527.57±42.20ab魔芋精粉酶解物低剂量组组别 剂量/[g/（kg·d）]MDA/（nmol/mL）T-SOD/（U/mL）0.625 5.96±0.68ab85.81±2.75b369.01±27.03ac
续表5 魔芋精粉酶解物对糖尿病大鼠血清中MDA、T-SOD、GSH-Px的影响（n=10）
Continue table 5 Effects of enzymatic hydrolysates of konjac flour on MDA，T-SOD and GSH-Px in serum of diabetic rats（n=10）
注：a表示与对照组比较差异显著（P＜0.05）；b表示与模型组比较差异显著（P＜0.05）；c表示与二甲双胍组比较差异显著（P＜0.05）；d表示与魔芋精粉酶解物低剂量组比较差异显著（P＜0.05）。
GSH-Px/（U/mL）魔芋精粉酶解物中剂量组组别 剂量/[g/（kg·d）]MDA/（nmol/mL）T-SOD/（U/mL）1.250 5.85±0.65ab77.03±7.78ab405.05±4.50ac魔芋精粉酶解物高剂量组2.500 5.63±0.60ab70.71±2.23acd482.16±35.40abd
如表5所示，与模型组大鼠比较，二甲双胍组及魔芋精粉酶解物低、中和高剂量组大鼠血清中MDA水平显著下降（P＜0.05）；二甲双胍组、魔芋精粉酶解物低、中剂量组大鼠血清中T-SOD水平显著上升（P＜0.05）；二甲双胍组、魔芋精粉酶解物高剂量组大鼠血清中GSH-Px水平显著提升（P＜0.05）。综上所述，魔芋精粉酶解物可以改善糖尿病大鼠的脂质过氧化水平并提升抗氧化酶活性，使氧化应激反应得到改善。
2.5 魔芋精粉酶解物对糖尿病大鼠肝组织中TNF-α、NF-κB、Nrf2基因表达的影响
魔芋精粉酶解物对糖尿病大鼠肝组织中TNF-α、NF-κB、Nrf2mRNA 的影响见表 6。
如表6所示，与模型组大鼠比较，二甲双胍组、魔芋精粉酶解物低、中和高剂量组大鼠肝组织中TNF-α和NF-κB mRNA相对表达量显著下降（P＜0.05）。与二甲双胍组比较，魔芋精粉酶解物低剂量组大鼠肝组织中Nrf2mRNA相对表达量显著增加（P＜0.05）。结果表明，魔芋精粉酶解物能显著降低糖尿病大鼠肝组织中TNF-α和NF-κB mRNA相对表达量，同时魔芋精粉酶解物低剂量相比二甲双胍能维持糖尿病大鼠肝组织中Nrf2mRNA相对表达量。综上所述，魔芋精粉酶解物能有效抑制糖尿病大鼠肝组织中炎症因子的表达。
表6 魔芋精粉酶解物对糖尿病大鼠肝组织中TNF-α、NF-κB、Nrf2mRNA 的影响（n=10）
Table 6 Effects of enzymatic hydrolysate of konjac flour on TNF-α，NF-κB and Nrf2mRNA in liver tissue of diabetic rats（n=10）
注：a表示与对照组比较差异显著（P＜0.05）；b表示与模型组比较差异显著（P＜0.05）；c表示与二甲双胍组比较差异显著（P<0.05）；d表示与魔芋精粉酶解物低剂量组比较差异显著（P＜0.05）。
组别 剂量/[g/（kg·d）]TNF-α mRNA NF-κB mRNA Nrf2mRNA对照组 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00模型组 5.38±4.76a 3.28±2.19a 2.70±4.64二甲双胍组 0.140 0.65±0.42b 0.68±0.49b 0.75±0.46魔芋精粉酶解物低剂量组0.625 1.57±1.09b 0.59±0.21b 3.64±1.59ac魔芋精粉酶解物中剂量组1.250 1.31±0.82b 0.46±0.28b 2.48±1.59魔芋精粉酶解物高剂量组2.500 0.44±0.29b 1.32±0.79bd 1.20±0.74d
2.6 魔芋精粉酶解物对糖尿病大鼠肝组织病理损伤的影响
魔芋精粉酶解物对糖尿病大鼠肝组织病理损伤的影响见图1。
图1 魔芋精粉酶解物对糖尿病大鼠肝组织病理损伤的影响
Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysate of konjac powder on pathological damage of liver tissue in diabetic rats
如图1所示，对照组中大鼠肝组织的结构和形态没有异常且没有炎症细胞浸润。模型组大鼠的肝组织结构紊乱，且着色不均匀并深染。二甲双胍组、魔芋精粉酶解物低、中和高剂量组大鼠肝组织病理形态学改变减轻；其中低剂量组病变最轻。结果表明，魔芋精粉酶解物对糖尿病大鼠的肝损伤具有一定程度的改善作用。
3 讨论与结论
糖尿病是目前威胁人体健康的非传染性疾病之一，其导致的慢性肝损伤是常见的并发症，严重者可导致肝硬化甚至肝癌。因此对魔芋精粉酶解物降血糖及保肝的研究对维持人体健康有着重要意义。
糖尿病以高血糖为主要特征并伴随有多饮、多食、多尿、消瘦等症状[14]。本研究结果表明，魔芋精粉酶解物对糖尿病大鼠具有提升体质量和良好的降血糖作用。与文献报道KGM具有的降血糖作用相一致[15]，且具有更好地改善糖尿病体重减轻的效果。这可能与魔芋精粉酶解物中含有一定比例的KOGM有关[16]。
AST和ALT是临床肝功能检查的主要指标，在慢性或急性肝损伤后，存在于肝细胞中的ALT和AST会渗入血液导致血清中的AST和ALT水平上升[17]。本研究结果表明，魔芋精粉酶解物能降低糖尿病大鼠血清中的AST和ALT水平。与文献报道KGM降低糖尿病大鼠血清中AST和ALT水平的结果一致[18]，说明魔芋精粉酶解物对糖尿病引发的肝损伤具有一定的预防保护作用。
持续的高血糖会导致肝损伤并产生过量氧自由基，导致肝细胞膜上发生脂质过氧化反应并生成大量MDA，使机体内抗氧化酶（如GSH-Px、SOD）水平降低[19]。本研究结果表明，魔芋精粉酶解物可以降低糖尿病大鼠血清中MDA含量，提高SOD、GSH-Px水平。与文献报道KOGM具有的降低血清中MDA以及提高SOD、GSH-Px水平的结果相一致[20]。这也许与KOGM含量及其抗氧化性有关[21-22]。
在各类肝损伤中，炎症因子均发挥重要作用。其中TNF-α通过上调肝细胞膜上的TNF-R，对肝细胞产生直接的致伤作用[23-24]。本研究结果表明，魔芋精粉酶解物降低糖尿病大鼠肝组织中TNF-α相对表达量从而起到护肝作用。NF-κB能精确调控炎症因子TNF-α的表达并影响组织细胞的生理和病理过程[25-26]。本研究结果表明，魔芋精粉酶解物能降低糖尿病大鼠肝组织中NF-κB的相对表达量，从而抑制下游炎症因子TNF-α的活性进而保护糖尿病大鼠的肝脏。同时组织病理学观察显示，魔芋精粉酶解物组肝组织结构紊乱和深染程度减轻，这表明魔芋精粉酶解物对STZ诱导的糖尿病肝损伤起到了改善作用。Nrf2是调节机体氧化应激的重要因子，其通过调节多种抗氧化酶及蛋白的表达，从而增强细胞及组织的氧化耐受能力[27-28]。本研究结果表明，魔芋精粉酶解物低剂量相比二甲双胍能提升糖尿病大鼠肝组织中Nrf2的相对表达量，从而增强肝脏组织的抗氧化能力。
综上所述，魔芋精粉酶解物可以有效改善STZ诱导的糖尿病肝损伤，机制可能与降血糖、降低脂质过氧化水平、提高机体清除氧自由基能力以及抗炎作用有关。这为魔芋精粉酶解物的进一步开发利用奠定了理论基础，以便进一步开发新型魔芋功能食品等。
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