巨峰葡萄是我国种植面积广泛的葡萄种类，因其颗粒大、水分高、颜色黑紫、口感甘甜，深受消费者青睐。然而，因皮薄、水分高、糖分高，巨峰葡萄易腐败，是公认的不易储存的葡萄品种[1]。25℃下巨峰葡萄贮藏4 d～5 d极易腐败变质，造成经济损失，因此，对巨峰葡萄保鲜技术的研究具有重要意义。
酒糟是高粱、大米等酿酒原材料酿酒后剩余的残渣，是酒行业最多的副产物，酒糟的精深加工及高值开发是酿酒行业面临的一个重要问题。酒糟中含有蛋白质、粗纤维、粗淀粉、无氮浸出物和微量元素等多种成分[2-3]。研究发现酒糟蛋白中以醇溶蛋白含量最高，可占总蛋白含量的（40.45±0.75）%。酒糟醇溶蛋白（prolamin from distiller's grains，PDG）中疏水性氨基酸含量高，二级结构以α-螺旋为主、耐热性好[4]，具有高疏水性、高稳定性及良好的胶凝能力和自组装性，在食品、医药等领域有较大的应用潜力[5]。目前对玉米醇溶蛋白（zein）的研究较为广泛，例如，用zein和大豆蛋白制成的复合膜包装橄榄油，可极大地减缓橄榄油氧化和酸败的速度[6]；zein还可用于果蔬的涂膜保鲜，延长食品的货架期[7]；Hoffman等[8]制备了一种含zein、乳酸链球菌肽和月桂酸的抗菌复合膜，对单增李斯特菌和肠炎沙门氏菌有明显抑制作用。然而，目前尚未见有关酒糟醇溶蛋白应用的报道。微生物侵染及氧化反应等均是食品腐败变质的重要原因，因此许多抗氧化剂及抑菌剂被用于食品保鲜，如重要的天然抗氧化剂抗坏血酸（vitamin C，VC）、世界卫生组织唯一批准的食用级天然抗菌肽——乳酸链球菌肽（nisin）[9]，以及来源丰富、价格低廉、具有良好成膜性的绿色食品保鲜剂壳聚糖[10]等。
本试验以白酒糟醇溶蛋白和壳聚糖为基本成分制备添加nisin和抗坏血酸的复合涂膜保鲜剂，应用于葡萄保鲜，通过失重率、还原糖含量、可滴定酸含量、可溶性固形物含量和丙二醛含量等指标，评价白酒糟醇溶蛋白复合涂膜对葡萄的保鲜效果，以期为酒糟的综合利用与开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
巨峰葡萄：市售，选择无病虫害、无机械损伤、成熟度一致的果实；白酒糟：山西省汾酒集团；VC、3，5-二硝基水杨酸试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；石英砂、壳聚糖（黏度 200 mPa·s～400 mPa·s，分子质量161.14，脱乙酰度90%）：山东西亚化学股份有限公司；nisin：苏州卓鑫生物科技有限公司；三氯乙酸、硫代巴比妥酸、甘油、酚酞、高岭土、草酸：生工生物工程（上海）股份有限公司。所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
KQ-250B超声清洗仪：昆山市超声有限公司；TU-1810紫外分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；HC-2518R高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；TMS-Pro质构仪：北京盈盛恒泰科技有限责任公司；101-2AB型电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；FA-25高速组织匀浆机：上海弗鲁克科技发展有限公司；PLA-1手持折光仪：日本爱拓公司。
1.3 试验方法
1.3.1 酒糟醇溶蛋白的提取
取干燥粉碎后的酒糟，按照1∶10（g/mL）料液比加入70%乙醇，调节pH值至10.0，超声辅助（250 W、50℃）提取30 min后离心（8 000 r/min，30 min），取上清液。重复提取3次，合并上清液。用Lowry法测定上清蛋白浓度[11]，计算提取率。用2 mol/L盐酸调节pH值至3.4，加入等体积蒸馏水，4℃静置12 h后，8 000 r/min离心30 min，将沉淀冷冻干燥后得到酒糟醇溶蛋白[12]。
1.3.2 涂膜保鲜液的制备
准确称取0.04 g nisin和0.25 g VC溶于20 mL 2%壳聚糖溶液中，边搅拌边加入200 μL甘油。然后加入80 mL 5 mg/mL酒糟醇溶蛋白溶液，继续搅拌20 min后制得保鲜膜液。将葡萄连梗剪下，在保鲜膜液中浸没5 s，置于托盘中，标记为A组。在25℃条件下贮藏9d，并测定贮藏过程中葡萄的理化指标。试验设置2组对照，即未涂膜组（CK1组）和不加PDG的2%壳聚糖涂膜组（CK2组），以评价PDG的作用。
1.3.3 失重率的测定
采用称重法测定葡萄的失重率[13]。每2 d对各组葡萄样品进行称量，记录葡萄质量的变化，按公式（1）计算失重率。
式中：W为失重率，%；M0为葡萄的初始质量，g；M1为取样当天葡萄的质量，g。
1.3.4 硬度测定
用质构仪测定葡萄硬度。测定参数：针形探头，测前和回程速度均为60 mm/min，起始力0.05 N，穿刺距离8 mm，样品高度30 mm，每2 d测定1次葡萄的硬度[14]。每组平行测定3个样品，计算平均值。
1.3.5 可滴定酸（titratable acid，TA）含量的测定
分别称取A组、CK1组和CK2组葡萄样品2.5 g，研磨后装入25 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，混匀后过滤。取滤液10 mL于烧杯中，加入酚酞指示剂2滴，用0.1 mol/L NaOH滴定溶液至淡红色且30 s不变色，记录NaOH溶液用量，按公式（2）计算可滴定酸含量[15]。
式中：TA为可滴定酸含量，%；V为样品总体积，25 mL；C 为 NaOH 滴定液的浓度，0.1 mol/L；V1为滴定样品液消耗NaOH溶液的体积，mL；V0为滴定蒸馏水消耗 NaOH 溶液的体积，mL；f为折算系数，0.075 g/mmol；Vs为滴定的滤液体积，10 mL；m为样品质量，2.5 g。
1.3.6 可溶性固形物含量测定
取20颗葡萄，榨汁后纱布过滤，使用折光仪测定可溶性固形物含量[16]。每组测3次，取平均值。每2 d取一次样。
1.3.7 还原糖含量的测定
采用3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量[17]。取去皮后样品50 g，研磨至匀浆状态，准确称取2.0 g果浆置于锥形瓶中，加入30 mL蒸馏水，沸水浴中加热10 min。冷却后转移至100 mL容量瓶并定容。取1 mL溶液，加入3，5-二硝基水杨酸试剂，沸水浴加热5 min，冷却后测定540 nm处吸光度。配制并测定系列标准葡萄糖溶液，绘制标准曲线，计算得到回归方程y=0.268 7x-0.005 9（R2=0.998 6），其中 y 为 540 nm 处吸光度，x为葡萄糖浓度（mg/mL），按照回归方程计算样品还原糖含量。
1.3.8 丙二醛含量的测定
将葡萄剪碎，准确称取1.0 g样品，加入10 mL 10%三氯乙酸和少量石英砂研磨匀浆，8 000 r/min离心10 min。取上清液2 mL，加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）溶液混匀，于沸水浴中反应15 min，冷却后4 000 r/min离心10 min取上清液，并分别测 450、532、600 nm 处的吸光度 A450、A532、A600，按公式（3）计算丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量[18]。
式中：MDA为丙二醛含量，μmol/g；V为提取液体积，mL；W为果实组织鲜重，g。
1.4 数据处理
各组试验取3个平行样进行重复试验。使用Excel、SPSS等软件分析数据、制图。测定结果以平均数±标准差表示，P<0.05为显著性差异。
2 结果与分析
2.1 酒糟醇溶蛋白复合涂膜对葡萄外观的影响
将不同处理组的葡萄在25℃条件下贮藏9 d，每2 d记录1次葡萄的整体外观，外观变化见图1。
图1 酒糟醇溶蛋白复合涂膜对25℃贮藏葡萄外观的影响
Fig.1 Effect of prolamin emulsion coating on appearance of grapes during storage at 25℃
由图1可知，第1天涂膜组葡萄比未涂膜组光泽明亮，贮藏第5天时，3组葡萄均未出现明显失水皱缩现象，然而贮藏第9天时，未涂膜组葡萄出现大幅度失水现象，表皮皱缩，无光泽。壳聚糖涂膜组中有60%的葡萄表面失水皱缩，光泽度明显下降，说明壳聚糖薄膜可在一定程度上减缓葡萄的失水作用。复合涂膜组中只有10%的葡萄出现轻微失水状态，光泽度好，表明PDG复合涂膜有效减缓了葡萄的蔫缩，对葡萄外观的保持效果最佳。
2.2 酒糟醇溶蛋白复合涂膜对葡萄失重率的影响
失重率是评价水果是否新鲜的一个重要指标。PDG复合涂膜对25℃贮藏葡萄失重率的影响见图2。
图2 酒糟醇溶蛋白复合涂膜对25℃贮藏葡萄失重率的影响
Fig.2 Effect of prolamin emulsion coating on weight loss rate of grapes during storage at 25℃
不同小写字母表示组间差异显著，P<0.05。
由图2可知，随着贮藏时间的延长，各组葡萄的失重率均逐渐升高。从第1天到第9天，两组涂膜组的失重率均小于未涂膜组。在贮藏第5天后，PDG复合涂膜组葡萄的失重率显著小于壳聚糖涂膜组（P<0.05）。在贮藏第9天时，未涂膜组的失重率高达（18.76±0.59）%，而PDG复合涂膜组的失重率仅为（12.28±0.70）%，较未涂膜组显著降低（P<0.05）。这一结果与海藻酸钠和溶菌酶复合涂膜对马陆葡萄贮藏的保鲜效果一致[19]。当果实经过涂膜处理后，保鲜膜液会在果实表面形成一层均匀的致密薄膜，这层膜对水分和气体具有阻隔性，减缓了果实的水分散失和营养物质的消耗。
2.3 酒糟醇溶蛋白复合涂膜对葡萄硬度的影响
PDG复合涂膜对葡萄硬度的影响见图3。
图3 酒糟醇溶蛋白复合涂膜对25℃贮藏葡萄硬度的影响
Fig.3 Effect of prolamin emulsion coating on hardness of grapes during storage at 25℃
不同小写字母表示组间差异显著，P<0.05。
由图3可知，在25℃贮藏期间，各组葡萄的硬度均呈现下降趋势。前3 d时，3组硬度没有明显差异。从第5天开始到贮藏后期，PDG复合涂膜组葡萄的硬度显著高于未涂膜组（P<0.05）。贮藏第9天时未涂膜组、壳聚糖涂膜组、PDG复合涂膜组葡萄的硬度较第1天时分别降低了46.11%、38.46%和31.97%。果胶酶及纤维素酶的活性是影响水果成熟后硬度的一个重要因素。酶的活性越高，果肉软化速度越快。贮藏后期未涂膜组果实硬度下降明显，涂膜组下降速度相对缓慢，第9天时PDG复合涂膜组的硬度大于未涂膜组，表明PDG复合涂膜组可有效抑制葡萄的软化过程。这一现象与前面的试验结果一致，未涂膜组失重率最高，而PDG复合涂膜组的失重率最低。据报道，抗菌肽壳聚糖复合膜液可较好地保持黄瓜的硬度[20]。这可能是涂膜处理后能抑制果实的呼吸作用，降低代谢速率及酶的活性，减缓软化过程。PDG为疏水性蛋白，PDG复合膜的阻气、阻水性比单一壳聚糖涂膜更强，保鲜效果也更好。
2.4 酒糟醇溶蛋白复合涂膜对葡萄可滴定酸含量的影响
可滴定酸是影响果实风味的一个重要因素。图4为PDG复合涂膜对葡萄可滴定酸含量的影响。
图4 酒糟醇溶蛋白复合涂膜对25℃贮藏葡萄可滴定酸含量的影响
Fig.4 Effect of prolamin emulsion coating on titratable acid content of grapes during storage at 25℃
不同小写字母表示组间差异显著，P<0.05。
由图4可知，在前3 d时各组葡萄的可滴定酸含量均比较稳定，但随着贮藏时间的延长，未涂膜组的可滴定酸含量逐渐增加。相比于未涂膜组，壳聚糖涂膜组和PDG复合涂膜组的可滴定酸含量整体变化较缓慢。贮藏第9天时，未涂膜组的可滴定酸含量较第1天增加了119.4%，壳聚糖涂膜组增加了75.2%，而PDG复合涂膜仅增加了50.7%。在贮藏结束时，PDG复合涂膜处理组的可滴定酸含量显著低于未涂膜组（P<0.05），保鲜效果最好。未涂膜组葡萄在贮藏后期可滴定酸含量迅速上升，可能是由果实变质引起。2个涂膜组在整个贮藏期间可滴定酸含量较为相近，这可能与其均含有保鲜成分壳聚糖有关[21]。
2.5 酒糟醇溶蛋白复合涂膜对葡萄可溶性固形物含量的影响
图5为PDG复合涂膜对葡萄可溶性固形物含量的影响。
图5 酒糟醇溶蛋白复合涂膜对25℃贮藏葡萄可溶性固形物含量的影响
Fig.5 Effect of prolamin emulsion coating on soluble solids content of grapes during storage at 25℃
不同小写字母表示组间差异显著，P＜0.05。
由图5可知，本试验中3组样品可溶性固形物含量在贮藏前5 d均无显著性差异（P＞0.05）。第7天时，壳聚糖涂膜组和PDG复合涂膜液处理组的可溶性固形物含量显著高于未涂膜组（P＜0.05）。第9天时，PDG复合涂膜组可溶性固形物含量高于壳聚糖涂膜组（P＞0.05），显著高于未涂膜组（P＜0.05）。研究发现，贮藏期间果实可溶性固溶物含量与多种因素有关，如生长期间的光照强度、采摘时果实的成熟度、环境温度、果实品种、代谢作用等[22]。未完全成熟的果实在采摘后仍可进行部分多糖合成，使可溶性固形物含量增加，而呼吸代谢作用会消耗可溶性固形物。文献报道未完全成熟的草莓在采摘3 d后可溶性固形物含量达到最高，后期，随着贮藏期的延长可溶性固形物含量降低[23]。同样，用壳聚糖和佛手柑精油涂膜处理后的葡萄，在贮藏期间可溶性固形物含量呈现先小幅升高后降低的趋势[22]。本试验发现，3组样品在贮藏期间可溶性固形物的含量呈下降趋势。在贮藏第7天和第9天时，PDG复合涂膜液处理组葡萄的可溶性固形物含量显著高于未涂膜组，可能与其减缓了葡萄的呼吸分解作用有关。
2.6 酒糟醇溶蛋白复合涂膜对葡萄还原糖含量的影响
还原糖为可溶性糖，是果实中重要的能量贮藏物质，与果实的生理生化代谢密切相关[24]。PDG复合涂膜对葡萄还原糖含量的影响如图6所示。
图6 酒糟醇溶蛋白复合涂膜对葡萄还原糖含量的影响
Fig.6 Effect of prolamin emulsion coating on reducing sugar content of grapes
不同小写字母表示组间差异显著，P＜0.05。
由图6可知，在第5天、第7天和第9天时各组样品的还原糖含量均高于第1天。第5天、第7天和第9天时未涂膜组葡萄的还原糖含量高于涂膜组，PDG复合涂膜组葡萄糖含量变化缓慢。第9天时，未涂膜组、壳聚糖涂膜组和PDG复合涂膜组的还原糖含量分别为（19.40±0.78）%、（18.17±0.59）%和（16.10±0.40）%，3组葡萄的还原糖含量差异显著（P＜0.05）。以上结果表明在贮藏后期2种涂膜组葡萄的还原糖含量较未涂膜组葡萄更稳定，PDG复合涂膜组可显著抑制还原糖含量的升高，相比壳聚糖涂膜的效果更优。
2.7 酒糟醇溶蛋白复合涂膜对葡萄丙二醛含量的影响
丙二醛是细胞氧化产物，可提示细胞衰老进程[25]。图7为PDG复合涂膜对葡萄丙二醛含量的影响。
图7 酒糟醇溶蛋白复合涂膜对葡萄丙二醛含量的影响
Fig.7 Effect of prolamin emulsion coating on malondialdehyde content of grapes
不同小写字母表示组间差异显著，P＜0.05。
由图7可知，随着贮藏时间的延长，各组葡萄样品的丙二醛含量均逐渐增加。贮藏第9天时，3组样品中丙二醛含量分别为（12.60±0.49）、（12.26±0.33）、（7.68±0.57）μmol/g，PDG复合涂膜组葡萄的丙二醛含量显著低于未涂膜组和壳聚糖涂膜组（P＜0.05）。由此可得，PDG复合涂膜减缓丙二醛的生成，使其在果实中维持一个较低水平，保护果实组织的细胞膜系统，有利于延缓果实衰老，延长水果的保鲜期。
3 结论
本试验以白酒糟醇溶蛋白和壳聚糖为基本成分，制备了添加乳酸链球菌素和抗坏血酸的复合涂膜液，并将其用于葡萄的保鲜研究。结果表明，白酒糟醇溶蛋白复合涂膜能明显延长巨峰葡萄的贮藏期，使其外观处于一个良好的状态。相比于未处理组和壳聚糖涂膜液处理组，酒糟醇溶蛋白复合涂膜组葡萄在25℃贮藏期间，硬度变化最小、失重率最小、可滴定酸含量增加也最少。贮藏第9天时，酒糟醇溶蛋白复合涂膜组葡萄的丙二醛含量显著低于未涂膜组（P<0.05），表明涂膜处理可显著降低葡萄的氧化程度。酒糟醇溶蛋白复合膜液处理组的失重率和丙二醛含量等指标均优于壳聚糖涂膜组，表明酒糟醇溶蛋白复合膜液的保鲜效果优于单一壳聚糖涂膜。
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