苦荞麦俗称苦荞，学名鞑靼荞麦[Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn]，是蓼科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopyrum Mill）双子叶植物中的一种药食两用的小宗杂粮[1]。就其食用价值而言，被誉为“五谷之王”的苦荞麦常作为饮料、酒类以及面食中的添加物[2]。就其药用价值而言，苦荞黄酮已被证实在人体抗氧化[3]、清除自由基、降“三高”[4-7]等方面均有作用，因此又被誉为“三降食品”。
目前，许多研究已证实长期饮酒或是过度饮酒会对人体肝脏产生负面影响，造成肝脏解毒能力降低，最终诱发酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）[8]。酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver，AFL）是 ALD 的早期阶段，若未及时治疗还会诱发一系列炎症反应。相关研究表明，长期饮酒发展为酒精性脂肪肝病（alcoholic fatty liver disease，AFLD）的概率为 90%[9]。目前，在临床上治疗AFLD主要是通过戒酒和在戒酒过程中补充高蛋白食物以及多种维他命和叶酸来进行营养支持。同时，还可以通过药物来改善AFLD患者的临床症状和生物化学指标，但近40年来有关治疗AFLD的药物研究并未取得明显进展[10-11]。
前期研究了苦荞总黄酮（total flavonoids of tartary buckwheat，TFTB）的制备及成分分析[12]，并证实了TFTB的体外抗氧化活性及解酒作用[13]。目前对于TFTB能缓解AFLD的机制研究尚不完全。因此，本实验采用0.9%乙醇和0.01%硫酸亚铁体外诱导L-02细胞，拟进一步探究TFTB是否具有体外抑制AFL细胞脂肪变性、氧化损伤以及降低细胞内炎性因子的作用，为TFTB缓解AFLD的机制研究及苦荞黄酮类解酒护肝产品的开发提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
苦荞总黄酮：黄酮总含量为79.5%，由四川省资源微生物与生物技术重点实验室制备；L-02细胞：四川省资源微生物与生物技术重点实验室保藏。
RPMI-1640培养基、0.25%乙二胺四乙酸-胰酶（ethylenediamine tetraacetic acid-trypsin，EDTA-trypsin）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）：美国赛默飞世尔科技公司；油红O染液、二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：北京索莱宝科技有限公司；丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）试剂盒、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminase，AST）试剂盒、甘油三酯（triglyceride，TG）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒、总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）试剂盒、游离脂肪酸（nonestesterified fatty acid，NEFA）试剂盒：南京建成生物工程研究所；细胞增殖-毒性检测试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）：赛国生物科技有限责任公司；肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）试剂盒、白介素-6（interleukin-6，IL-6）试剂盒、白介素-8（interleukin-8，IL-8）试剂盒：上海酶联生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
CO2培养箱（3111）、连续波长酶标仪（Multiskan go）、生物安全柜（1389）：美国赛默飞世尔科技公司；低速离心机（TDZ5B-WS）：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；倒置显微镜（DIAPHOT）：日本尼康公司；紫外分光光度计（UV-2600）：日本岛津公司。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养
用RPMI-1640培养液（含10%FBS）对37℃、5%CO2培养箱内生长状态正常的L-02细胞进行培养，每2 d～3 d 换液 1 次；每 4 d～6 d，使用 0.25%EDTA-胰酶37℃消化3 min～5 min，待细胞呈流沙状脱落时停止消化，进行传代培养和细胞冻存[14]。
1.3.2 CCK-8法筛选AFL细胞模型乙醇诱导浓度
取T25培养瓶中融合度达80%的L-02细胞，使用0.25%EDTA-胰酶37℃消化3 min～5 min，待细胞呈流沙状脱落时停止消化，计数后接种于96孔培养板内，使每孔细胞数为5×103个。置于5%CO2、37℃条件下培养24 h后，设置乙醇组、硫酸亚铁组、空白对照组。乙醇组：L-02细胞悬液中乙醇体积终浓度分别为0.1%、0.5%、0.9%、1.3%、1.7%；硫酸亚铁组：L-02细胞悬液中FeSO4质量终浓度为0.01%；空白对照组：仅含L-02细胞悬液。于上述条件下培养48 h后，每孔加入10 μL CCK-8，再培养 50 min，使用连续波长酶标仪检测并记录各孔OD450值，计算细胞活性，计算公式为细胞活性/%=[（实验组OD值-空白OD值）/（空白对照组OD值-空白OD值）]×100[15]。实验重复3次，每组3个复孔。
1.3.3 AFL细胞模型的建立
取T25培养瓶中融合度达80%的L-02细胞，按照1.3.2中的消化条件进行消化，计数后接种于6孔培养板内，使每孔细胞数为6×105个。细胞贴壁后，将实验设为空白对照组、阴性对照组、模型组。空白对照组：仅含L-02细胞悬液；阴性对照组：L-02细胞悬液中FeSO4质量终浓度为0.01%；模型组：向阴性对照组中添加乙醇，使乙醇体积终浓度为1.3.2中筛选浓度。5%CO2、37℃条件下培养，2 d换液1次，4 d传代1次。诱导至第4代，命名为H4。使用油红O染色法并测定各组细胞上清液中TG、AST、ALT含量以检测AFL细胞模型是否构建成功[16]。实验重复3次，每组3个复孔。
1.3.4 CCK-8法筛选TFTB作用浓度
参考1.3.2中的方法，设置以下组别，空白对照组：仅含L-02细胞悬液；实验组：L-02细胞悬液中TFTB质量终浓度分别为 10、20、40、80、160、320 μg/mL[17]。实验重复3次，每组3个复孔。
1.3.5 TFTB处理模型组细胞
参考1.3.3中6孔培养板接种方法接种细胞，待细胞贴壁后设置以下组别。空白对照组：仅含L-02细胞悬液；处理前H4组：仅含H4组细胞悬液；TFTB处理组：向H4组细胞悬液中添加TFTB，使TFTB作用浓度为1.3.4中筛选浓度。37℃、5%CO2的条件下培养，2 d换液1次，观察16 d并收集各组细胞上清液。实验重复3次，每组3个复孔。
1.3.6 生化指标检测
对1.3.5中收集的各组细胞上清液进行生化指标检测，测定 TG、ALT、AST、MDA、NEFA、T-SOD、GSH-Px水平，均按照试剂盒说明书进行操作。同时，采用酶联免疫吸附法[18]测定各组细胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α水平。
1.4 数据处理
用GraphPad Prism 8进行数据分析与作图。数据表示为（平均值±标准差），通过单因素方差分析（Oneway ANOVA）进行组与组之间的统计学比较，p＜0.05表示具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 乙醇诱导浓度的确定
不同浓度的乙醇对L-02细胞的影响结果见表1。
表1 不同浓度的乙醇对L-02细胞生长的影响
Table 1 Effect of C2H5OH at different concentration on the growth of L-02 hepatocytes
注：**表示与空白对照组比较，差异极显著（p＜0.01）；****表示与空白对照组比较，差异高度显著（p＜0.000 1）。
组别 吸光度 细胞活性/%空白对照组 0.87±0.07 0.01%硫酸亚铁组 0.87±0.04 100.77 0.1%乙醇组 0.87±0.02 100.54 0.5%乙醇组 0.83±0.01 96.11**0.9%乙醇组 0.75±0.01 87.22****1.3%乙醇组 0.73±0.03 84.71****1.7%乙醇组 0.67±0.03 77.28****
由表1可知，在本实验中，空白对照组细胞活性设为100%。与空白对照组相比，0.01%硫酸亚铁组细胞活性为100.77%，表明0.01%硫酸亚铁对细胞活性无明显影响；0.1%乙醇组细胞活性为100.54%，表明当乙醇浓度为0.1%时对细胞活性无明显影响，并且还可略微促进细胞生长；1.3%和1.7%乙醇组细胞活性分别为84.71%、77.28%，分别降低了15.29%和22.72%，差异高度显著（p＜0.000 1），显微镜下观察发现细胞体积增大、边缘模糊、胞内有较多杂质，细胞大量脱壁，细胞活性明显降低；0.5%和0.9%乙醇组细胞活性分别为96.11%、87.22%，虽然分别降低了3.89%、12.78%，但在显微镜下观察发现细胞体积只略微增大，活细胞数目仍然较多，脱壁细胞较少。阮雪青[19]的研究表明，构建体外AFL模型时为在细胞功能衰退前获得AFL的若干指标，通常选择较高乙醇浓度和较短诱导时间。因此，本实验选择0.9%乙醇浓度来构建AFL细胞模型，该浓度乙醇对细胞形态及贴壁能力影响较小，且乙醇浓度适中，可缩短诱导时间，提高诱导效果。
2.2 细胞模型的鉴定
2.2.1 油红O染色倒置显微镜观察结果
油红O染色倒置显微镜观察结果见图1。
图1 倒置显微镜下油红O染色结果
Fig.1 Results of oil red O staining under inverted microscope
A.空白对照组L-02细胞；B.阴性对照组L-02细胞；C.模型组H4细胞。
经油红O染色后，通过倒置显微镜可观察到空白对照组（图1A）与阴性对照组（图1B）中有少数被染成橘红色的脂滴正常分布于细胞内；模型组（图1C）细胞中出现大量橘红色脂滴，呈连珠状有序排列，集中分布于细胞膜周围，表明0.9%乙醇和0.01%FeSO4共同诱导后的H4细胞产生了脂肪累积，AFL细胞模型构建成功。
2.2.2 细胞上清液肝功能指标验证
TG是人体内含量最多的脂类，其含量通常保持在一定范围内，过度饮酒会导致TG升高，产生脂肪累积[20]。AST和ALT常被用来反映肝细胞损伤程度，乙醇作用于L-02细胞导致AFLD发生发展的过程中会伴随着细胞膜通透性增加，AST、ALT从细胞内释放，细胞上清液中AST、ALT水平升高[21]。当L-02细胞经乙醇诱导至第4代，各组细胞上清液中TG、AST和ALT的变化结果见表2。
由表2可知，与空白对照组比较，阴性对照组细胞上清液中 TG、AST、ALT 含量无显著差异（p＞0.05）；模型组细胞上清液中TG、AST、ALT含量分别上升了185.71%、790.48%、193.44%，具有高度显著差异（p＜0.0001）。以上结果表明，空白对照组细胞通过0.9%乙醇和0.01%FeSO4的诱导转化成模型组细胞，且胞内产生了脂肪累积与变性，同时伴随细胞膜的损伤，造成ALT、AST大量渗漏到细胞上清液中，与卜晓芬等[17]、Kong等[22]的研究结果一致。因此，经0.9%乙醇和0.01%FeSO4诱导后的H4细胞上清液指标发生变化且符合酒精肝指标变化趋势，AFL细胞模型构建成功。
表2 各组细胞上清液TG、AST和ALT的变化
Table 2 Levels of TG，AST and ALT in supernatant of cells
注：****表示与空白对照组比较，差异高度显著（p＜0.000 1）。
组别TG/（mmol/L）AST/（IU/L）ALT/（IU/L）空白对照组 0.07±0.00 0.21±0.08 0.61±0.06阴性对照组 0.08±0.03 0.44±0.09 0.67±0.24模型组 0.20±0.00**** 1.87±0.17**** 1.79±0.27****
2.3 TFTB作用浓度的确定
使用 10、20、40、80、160、320 μg/mL TFTB 处理 H4细胞48 h后，H4细胞活性见表3。
表3 不同浓度的TFTB对H4细胞生长的影响
Table 3 Effect of TFTB at different concentration on the growth of H4cells
注：****表示与空白对照组比较，差异高度显著（p＜0.000 1）。
组别 吸光度 细胞活性/%空白对照组 0.96±0.01 10 μg/mL TFTB 处理组 0.98±0.06 102.53 20 μg/mL TFTB 处理组 0.96±0.08 99.92 40 μg/mL TFTB 处理组 0.92±0.09 96.37 80 μg/mL TFTB 处理组 0.81±0.07 84.55****160 μg/mL TFTB 处理组 0.51±0.03 53.78****320 μg/mL TFTB 处理组 0.28±0.03 29.58****
由表3可知，与空白对照组相比，TFTB浓度大于80 μg/mL时，H4细胞活性下降明显且低于80%，差异高度显著（p＜0.000 1）；10、20、40 μg/mL TFTB 处理组细胞活性分别为102.53%、99.92%、96.37%，对H4细胞分裂生长无显著影响（p＞0.05），但低浓度的TFTB会延长处理时间，降低作用效果；而80 μg/mL TFTB处理组细胞活性为84.55%，虽有所降低，但显微镜下观察发现活细胞数目仍较多且形态与空白对照组接近。同时，该作用浓度适中，节约处理时间，提高作用效果。因此，选择80 μg/mL作为TFTB的作用浓度。
2.4 TFTB对AFL细胞的影响
2.4.1 TFTB对AFL细胞上清液中肝功能指标TG、AST、ALT水平的影响
各组细胞上清液中TG、AST和ALT的变化见表4。
表4 各组细胞上清液TG、AST和ALT的变化
Table 4 Levels of TG，AST and ALT in supernatant of cells
注：****表示与空白对照组比较，差异高度显著（p＜0.000 1）；####表示与处理前H4组比较，差异高度显著（p＜0.000 1）。
组别TG/（mmol/L）AST/（IU/L）ALT/（IU/L）空白对照组 0.07±0.00 0.21±0.07 0.61±0.06处理前 H4组 0.20±0.00**** 1.87±0.17**** 1.79±0.27****80 μg/mL TFTB 处理组 0.17±0.00#### 0.72±0.28#### 0.56±0.11####
由表4可知，与处理前H4组比较，经80μg/mL TFTB处理后细胞上清液中TG、AST、ALT高度显著减少（p＜0.000 1），分别降低了15.00%、61.50%和68.71%。表明经80 μg/mL TFTB处理后，可抑制乙醇诱导后L-02细胞脂肪变性与堆积，也可减轻肝细胞的损伤程度。袁叶飞等[15]在体外构建的AFL细胞模型中观察到赶黄草总黄酮能明显降低细胞内TG水平且能明显缓解脂肪变性。闫帅峰等[23]通过构建大鼠AFLD模型，证明了苦荞能够减少脂肪在大鼠肝脏中的积蓄，但并未提出发挥效应的成分。综上，苦荞中的黄酮成分能够抑制体外诱导的AFL细胞模型脂肪变性与堆积。
2.4.2 TFTB对AFL细胞上清液中氧化应激指标MDA、NEFA、T-SOD、GSH-Px水平的影响
MDA含量能够反映机体抗氧化潜在能力与组织过氧化损伤程度，NEFA与机体的氧化应激有关，当NEFA处于较高浓度时，不仅会对细胞造成损伤，机体氧化系统与抗氧化系统的平衡状态也会发生变化。TSOD、GSH-Px则是生物体系中抗氧化系的重要组成成员。Masarone等[24]的研究表明，酒精长期作用于肝脏可诱导肝脏氧化应激，MDA、T-SOD和GSH-Px的水平变化可用来表示经乙醇诱导后以及药物作用后肝脏氧化损伤程度。Grummer等[25]认为奶牛血液中NEFA升高会导致氧化应激并伴随脂肪肝的产生。各组细胞上清液MDA、NEFA、T-SOD和GSH-Px的变化见表5。
表5 各组细胞上清液MDA、NEFA、T-SOD和GSH-Px的变化
Table 5 Levels of MDA，NEFA，T-SOD and GSH-Px in supernatant of cells
注：*表示与空白对照组比较，差异显著（p＜0.05）；****表示与空白对照组比较，差异高度显著（p＜0.000 1）；#表示与处理前H4组比较，差异显著（p＜0.05），####表示与处理前 H4组比较，差异高度显著（p＜0.000 1）。
组别MDA/（nmol/mL）NEFA/（μmol/L）T-SOD/（U/mL）GSH-Px空白对照组 0.83±0.07 198.39±17.44 21.67±0.05 125.65±1.98处理前 H4组 0.94±0.07* 463.27±2.65**** 17.77±0.22**** 97.66±2.75****80 μg/mL TFTB 处理组 0.81±0.07# 243.18±3.33#### 20.87±0.08#### 196.85±2.22####
由表5可知，与空白对照组比较，处理前H4组细胞上清液中MDA水平显著升高13.25%（p＜0.05），NEFA水平高度显著升高 133.51%（p＜0.000 1），T-SOD、GSH-Px水平分别高度显著降低18.00%、22.28%（p＜0.0001），表明乙醇能够诱导L-02细胞产生氧化损伤。
与处理前H4组比较，TFTB处理组细胞上清液中MDA水平显著降低 13.83%（p＜0.05），NEFA 水平高度显著降低 47.51%（p＜0.000 1），T-SOD、GSH-Px水平分别高度显著升高 17.44%、101.57%（p＜0.000 1），表明80 μg/mL TFTB可能是通过提高L-02细胞内T-SOD和GSH-Px的酶活性以及降低MDA、NEFA的水平来提高细胞的抗氧化能力。Li等[26]研究结果表明，醉酒小鼠模型组肝脏中的MDA明显升高，T-SOD、GSH-Px明显降低，而经枸杞色素和多糖治疗后可逆转前述情况。童钰琴等[13]在体外抗氧化活性实验中观察到苦荞麸皮总黄酮对超氧阴离子自由基（O2-·）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基及NO2-具有一定的清除能力，且在一定范围内呈现出量效关系。因此，TFTB可能通过提高L-02细胞内T-SOD和GSH-Px的酶活性并降低MDA、NEFA水平来抑制O2-·、DPPH·及NO2-等的产生，从而提高细胞的抗氧化能力，改善AFL细胞氧化损伤，因此具有缓解AFLD的潜能。
2.4.3 TFTB对AFL细胞上清液中炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α 水平的影响
IL-6主要用于检测积累性肝损伤，TNF-α可加速中性粒细胞的转移导致活性氧增加，进而造成肝脏的损伤[27]，这两项指标的升高意味着严重的肝病甚至恶性肿瘤[28]。IL-8是一种有效的趋化因子，由巨噬细胞、肝细胞等多种细胞产生，多项研究表明患有AFLD患者的血浆及肝脏中的IL-8水平会增加[29]。Li等[26]的研究发现AFLD模型小鼠血清中IL-6、TNF-α显著上升（p＜0.05）。Wang等[30]的研究表明IL-8可通过蛋白激酶B/缺氧诱导因子-1α通路（protein kinase B/hypoxia inducible factor-1α pathway，Akt/HIF-1α pathway）加剧肝脂变性。各组细胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的变化见表6。
表6 各组细胞上清液IL-6、IL-8和TNF-α的变化
Table 6 Levels of IL-6，IL-8 and TNF-α in supernatant of cells pg/mL
注：****表示与空白对照组比较，差异高度显著（p＜0.000 1）；#表示与处理前H4组比较，差异显著（p＜0.05），####表示与处理前 H4组比较，差异高度显著（p＜0.000 1）。
组别 IL-6 IL-8 TNF-α空白对照组 14.81±3.34 14.81±6.13 53.00±2.79处理前 H4组 33.80±2.71**** 103.03±6.13**** 62.95±7.85 80 μg/mL TFTB处理组30.99±1.15 69.43±2.29#### 45.42±0.30#
由表6可知，与空白对照组比较，处理前H4组细胞上清液中IL-6、IL-8水平分高度显著升高128.22%、595.68%（p＜0.000 1），TNF-α 水平升高 18.77%（p＞0.05），表明乙醇能够诱导L-02细胞产生炎症反应。
与处理前H4组比较，80 μg/mL TFTB处理组细胞上清液中IL-6水平下降8.31%（p＞0.05），IL-8水平高度显著下降 32.61%（p＜0.000 1），TNF-α 水平显著下降27.85%（p＜0.05），表明 80 μg/mL TFTB 能够降低 AFL细胞产生炎性因子的水平，起到缓解相关炎症反应的作用。王雪等[31]在体外构建小鼠腹腔巨噬细胞RAW 264.7炎症模型中观察到天山堇菜总黄酮在0.78μg/mL～12.5 μg/mL 能明显降低促炎症因子 TNF-α、IL-6、IL-1β的水平，具有较好的抗炎活性。而本研究表明，80 μg/mL的TFTB能明显降低AFL细胞上清液中炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α的水平。由此可见，黄酮缓解相关炎症反应的作用浓度因黄酮来源不同而呈现较大的差异。胡一冰等[32]研究发现，苦荞籽提取物也可缓解炎症反应，抑制小鼠耳肿胀及大鼠蛋清性足肿胀。目前，还未有文献报道TFTB对体外诱导的AFL细胞炎症反应的抑制作用。结合上述实验结果，TFTB可通过降低炎性因子水平来缓解AFL细胞损伤，从而发挥保肝潜能。
3 结论
本文以TFTB为原料，以0.9%乙醇和0.01%FeSO4成功建立体外AFL细胞模型，研究了TFTB对AFL细胞的影响。研究结果显示，80 μg/mL的TFTB可以减少酒精性脂肪肝L-02细胞上清液中TG、AST、ALT、MDA、NEFA的含量，并升高T-SOD、GSH-Px的含量，表明TFTB不仅可以抑制AFL细胞模型脂肪积累与变性，还可以减轻乙醇对肝细胞膜及肝细胞的氧化损伤，从而具有缓解AFLD的潜能。同时，80 μg/mL TFTB也可降低酒精性脂肪肝L-02细胞上清液中IL-8、TNF-α的含量，表明TFTB能够缓解炎症反应。因此，在保健食品及相关产品的开发中，考虑其能够改善AFLD的潜能及缓解炎症的功效作用，为产品开发提供新的理论依据。
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