双孢蘑菇（Agaricus bisporus）是一种营养价值高、全球消费普遍、种植面积广且收成良好的食用菌[1]。但双孢蘑菇在采后贮藏和销售运输中呼吸作用强、没有角质层的保护作用，极易受微生物侵染和机械损伤，导致褐变、子实体软化等，失去商品价值。有研究表明，双孢蘑菇在室温（20℃～25℃）下的贮藏期只有1 d～3 d[2-3]。涂膜保鲜法操作简单、成本低，可有效延长食用菌贮藏保鲜期[4]。生物源涂膜保鲜法常以无毒且廉价的多糖、蛋白质等大分子物质为基础，加以抑菌和助膜材料制成复合生物源涂膜剂，且通过涂抹、浸泡等方法，将其覆于蘑菇的表面，使其形成一层透明且兼具多种性能的膜[5]。有研究报道，生物源涂膜可有效防止子实体内外气体和水分等相互迁移，抑制食用菌、番茄等[6-7]多种园艺产品的呼吸作用，进而延缓组织衰老，其应用前景广阔。
魔芋胶和卡拉胶是从植物中提取的多糖，属于天然的食品添加剂。魔芋胶和卡拉胶复配主要依靠多糖间的协同作用，卡拉胶中半乳聚糖的硫酸酷基团可与魔芋胶中羟基形成氢键，从而提高复配凝胶强度[8-9]。二者复配的凝胶不但析水少、弹性大、脆度小，而且有着各单体胶所缺少的优点，在生物源涂膜保鲜市场的应用前景广阔[10]。庞杰等[11]利用魔芋胶、卡拉胶为基质配制保鲜薄膜，对食用菌和柑橘进行保鲜，结果表明，食用菌贮藏4 d后质量损失率和褐变度仅为5.5%和0.11%，柑橘贮藏半个月后腐烂率低于2%。乳酸链球菌素（nisin）是一种由乳酸链球菌产生的多肽物质，其能够抑制大部分革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、耐热芽孢杆菌、小球菌等）的生长[12]。nisin因摄入后可快速被人体蛋白酶消化分解成各种氨基酸而不会对人体产生毒害作用[13]，已被用于各种食品保鲜[14]。ε-聚赖氨酸（ε-polylysine，ε-PL）是一种天然存在的阳离子抗菌肽，属于安全性高的天然食品防腐剂，具有热稳定性好、水溶性好、抑菌谱广等优点[15]。近年来，ε-PL已经被用于柑橘、苹果、番茄等多种果蔬的采后防腐保鲜[16-17]，尤其是ε-PL与其它保鲜剂、抗菌剂等其它保鲜方法进行联合使用后，能有效协同增强其保鲜效果，但在双孢蘑菇采后保鲜中的研究还未见相关报道。为此，本文以魔芋胶和卡拉胶为主要成膜基质，添加ε-PL和nisin抑菌剂制成生物源抑菌剂复合涂膜剂，以期提高双孢蘑菇采后贮藏品质、为双孢蘑菇贮藏保鲜方法的开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
双孢蘑菇：江苏裕灌现代农业科技有限公司；魔芋胶、卡拉胶：浙江一诺生物科技有限公司；乳酸链球菌素：浙江新银象生物工程有限公司；ε-聚赖氨酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；以上试剂均为分析纯。Bradford法蛋白浓度测定试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）测定试剂盒、过氧化物酶（peroxidase，POD）测试盒、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）测试盒：南京建成生物工程研究所。
1.2 仪器与设备
SynergyH1/H1MF多功能酶标仪：美国伯腾仪器有限公司；HW600水浴锅：北京东方精瑞科技有限公司；WR-18色彩色差仪：深圳市威福光电科技有限公司；GY-4果实硬度计：浙江托普仪器有限公司；5810R冷冻离心机：德国Eppendorf公司。
1.3 处理方法
挑选洁白完整、无病害、无机械损伤、直径为3 cm～4 cm的双孢蘑菇，将菌柄切至1 cm后，随机分成3组，每组200个。对照组浸于蒸馏水中2 min，复合涂膜组浸于0.4%魔芋胶+0.2%卡拉胶中2 min，抑菌剂复合涂膜组浸于0.4%魔芋胶+0.2%卡拉胶+150 mg/L ε-PL+900 mg/L nisin中2 min。每个处理均重复3次。所有处理后的蘑菇置于干燥纸上晾干后，于温度为（4±1）℃、湿度为85%～90%的冷库中贮藏。
1.4 检测指标及方法
1.4.1 感官评价
感官评价的指标包括双孢蘑菇的颜色、气味、状态，每项指标各5分，满分20分。以低于10分～12分为消费者不可以接受。采后双孢蘑菇贮藏感官评分标准见表1。
表1 采后双孢蘑菇贮藏感官评分标准
Table 1 Sensory scoring standard of A.bisporus during postharvest storage
评价指标 评分标准 分值颜色 双孢蘑菇饱满圆润，菌盖洁白 5双孢蘑菇无褐变现象，菌盖呈黄白色 4双孢蘑菇轻微褐变，菌盖呈黄色 3双孢蘑菇明显褐变，菌盖呈浅褐色 2双孢蘑菇严重褐变，菌盖呈深褐色 1气味 蘑菇专属独特的浓郁鲜味，无其它任何异味 5蘑菇特有的鲜味较浓，无其它任何异味 4蘑菇特有的鲜味较轻，不愉快气味开始出现 3不愉快气味较浓，无蘑菇特有的鲜味 2不愉快气味浓重 1状态 双孢蘑菇整体呈现饱满圆润状态 5双孢蘑菇较圆润 4双孢蘑菇略不圆润 3双孢蘑菇呈现轻微萎蔫状态 2双孢蘑菇萎蔫状态严重 1总体印象 双孢蘑菇呈现优良状态，整体饱满圆润 5双孢蘑菇呈现较优良状态 4双孢蘑菇的质量一般 3双孢蘑菇的有腐烂现象，质量比较差 2双孢蘑菇呈现腐烂状态，质量极差 1
1.4.2 开伞率测定
开伞率的计算公式如下。
开伞率/%=开伞个数/双孢蘑菇总数×100
1.4.3 失重率测定
取样时称取每组质量。计算公式如下。
失重率/%=（G1-G2）/G1×100
式中：G1为贮藏前双孢蘑菇质量，g；G2为贮藏后双孢蘑菇质量，g。
1.4.4 色度测定
每组随机选取7个双孢蘑菇，每个菌盖位置均匀选取3个点，利用WR-18色差仪，测量每个点的L*值和色度值（a*和b*），并用下述公式计算褐变度（browning index，BI）和 △E。
式中：△L*、△a*、△b* 分别为各样品与对照组的L*、a*、b* 的差值。
1.4.5 硬度测定
每组随机选取7个双孢蘑菇，利用GY-4型果实硬度计测量，把硬度计垂直均匀地用力压入双孢蘑菇菌盖中心部位5 mm，记下此时硬度计的数值[18]，最终取7次测定平均值。
1.4.6 呼吸速率的测定
将加入15 mL 0.4 mol/L NaOH的培养皿置于干燥器底部，10个双孢蘑菇子实体放到隔板上，封盖并记质量，30 min后把培养皿从干燥器中取出。然后将NaOH移入烧杯，用10 mL蒸馏水洗涤3次，向其中加入2滴酚酞、5 mL饱和氯化钡，然后用0.2 mol/L草酸滴定至溶液中紫红色去除或消失，重新使样品变回透明，同时记录此时的草酸用量为V1，空白滴定（干燥器中没有任何样品）以相同的方法进行，记录V2为此时草酸的用量。呼吸速率以每小时每千克子实体释放的CO2质量表示，计算公式如下。
呼吸速率/[mg/（kg·h）]=（（V2-V1）×C×44）/（W×H）
式中：V1为样品滴定草酸的体积，mL；V2为空白滴定草酸的体积，mL；C为草酸浓度，0.2 mol/L；W为样品鲜重，g；H 为测定时间，h。
1.4.7 可溶性蛋白的测定
取2 g样品加6 mL、pH7.0的50 mmol/L磷酸缓冲盐溶液，充分研磨，在4℃条件下，10 000 r/min离心10 min，取上清。参照Bradford法蛋白浓度测定试剂盒的方法，将标准品稀释至不同浓度，各取20 μL加入96孔板中，再加入200 μL 1×G250染色液，于20℃～25℃放置3 min～5 min后在595 nm下测定吸光度。按照上述制作标准曲线方法测定样品中可溶性蛋白含量，计算公式如下。
可溶性蛋白含量/（g/kg FW）=（m'×V）/（Vs×m×1 000）
式中：m'为从标准曲线查得的蛋白质质量，μg；V为样品提取液总体积，mL；Vs为测定时所取样品提取液体积，mL；m 为样品质量，g。
1.4.8 酶活测定
PPO、SOD、CAT和POD酶液的提取方法如下：称取1 g样品加入9 mL 50 mmol/L磷酸盐缓冲液[pH 7.0，含 1%聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP），1 mmol/L 二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）]，充分研磨，4℃、10 000 r/min离心5 min。酶活测定方法参照相应酶活测定试剂盒说明书。
1.4.9 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的测定
采用硫代巴比妥酸法测定MDA。样品：提取液（10%三氯乙酸）（体积比1∶5）在冰浴下研磨，4℃、8 000 r/min离心10 min，吸取上清液。取0.2 mL上清液和0.6 mL 10%三氯乙酸（内含0.5%硫代巴比妥酸，用0.05 mol/L NaOH配制），混合后煮沸20 min，冷却至室温（20℃～25℃），于10 000 r/min离心10 min，取上清液分别在532、600、450 nm测定吸光度。重复3次，取得平均值，计算公式如下。
MDA含量/（mmol/kg FW）=（c×V）/（Vs×m×1 000）
式中：c=6.45×（OD532-OD600）-0.56×OD450，为反应混合液中MDA浓度，μmol/L；V为样品提取液总体积，mL；Vs为测定时所取样品提取液体积，mL；m为样品质量，g。
1.5 数据统计分析
用Excel2019软件对所有的数据进行数据处理，并用Origin2017制图，SPSS21进行显著性分析（P<0.05）。
2 结果与分析
2.1 不同涂膜处理对采后双孢蘑菇贮藏期间感官品质的影响
为明确不同涂膜处理对采后双孢蘑菇贮藏期间品质的影响，对各组进行感官评价，结果如图1所示。
图1 不同涂膜处理对采后双孢蘑菇贮藏期间感官品质的影响
Fig.1 Effects of different coating treatments on sensory quality of A.bisporus during postharvest storage
由图1可知，对照组最先发生褐变和品质下降现象，分别于第2、3、4天，开始出现轻微褐变、明显病斑和腐烂的迹象，在贮藏第2、4、6天时的感官评分分别为14、6、4；复合涂膜处理组在贮藏第2、4、6天时的感官评分别为14、9、8，说明复合涂膜处理一定程度抑制了蘑菇贮藏中感官品质的下降；抑菌剂复合涂膜组样品感官品质在贮藏期间最优，于第4天出现褐变现象，贮藏6 d内未出现腐烂迹象，在贮藏第2、4、6天时的感官评分别为20、15、11。通过以上结果可以看出，抑菌剂复合涂膜处理能够明显延缓双孢蘑菇采后贮藏过程中感官品质的下降。
2.2 不同涂膜处理对双孢蘑菇贮藏期间失重率和开伞率的影响
失水是造成双孢蘑菇失重的首要原因之一，会造成双孢蘑菇萎蔫，影响蘑菇贮藏品质。开伞是双孢蘑菇衰老的一个重要指标[19]。不同涂膜处理对采后双孢蘑菇贮藏期间失重率和开伞率的影响见图2。
图2 不同涂膜处理对采后双孢蘑菇贮藏期间失重率和开伞率的影响
Fig.2 Effects of different coating treatments on weight loss and the cap opening ratio of A.bisporus during postharvest storage
由图2可知，各处理组失重率和开伞率均随着贮藏时间的延长而逐渐上升。贮藏6 d时，抑菌剂复合涂膜组的失重率和开伞率均小于其它两组，在第2天时对照组和复合涂膜组开始出现开伞，而抑菌剂复合涂膜组在第3天才开始出现开伞，并且在第5天的开伞率显著低于其它两组（P＜0.05），分别是对照组和复合涂膜组的73.7%和77.8%。结果说明抑菌剂复合涂膜处理可以在一定程度上抑制双孢蘑菇的失重率和开伞率的升高，从而延长双孢蘑菇的贮藏保鲜期。
2.3 不同涂膜处理对双孢蘑菇贮藏期间硬度和呼吸速率的影响
不同涂膜处理对采后双孢蘑菇贮藏期间硬度和呼吸速率的影响见图3。
图3 不同涂膜处理对采后双孢蘑菇贮藏期间硬度和呼吸速率的影响
Fig.3 Effects of different coating treatments on hardness and respiration rate of A.bisporus during postharvest storage
硬度是反映双孢蘑菇品质的重要参数[20]。由图3A可知，贮藏6 d中3组双孢蘑菇的硬度均整体呈下降趋势。抑菌剂复合涂膜组的硬度整体高于对照组，贮藏前3 d显著高于对照组（P＜0.05），贮藏第1天时的硬度是对照组的1.20倍。总体来看，抑菌剂复合涂膜组与复合涂膜组在硬度上差异不显著（P＞0.05），仅在贮藏第1天和第4天略高于复合涂膜组，但两组的硬度均在贮藏前期显著高于对照组（P＜0.05），说明抑菌剂复合涂膜处理能够有效抑制双孢蘑菇硬度的下降。
呼吸作用虽然为双孢蘑菇提供正常生命活动所必需的能量，但同时也消耗了大量的营养物质，造成双孢蘑菇品质下降，是判断子实体衰老的重要指标之一。如图3B所示，贮藏6 d中，抑菌剂复合涂膜组的呼吸速率均低于对照组。其中贮藏第2天时，抑菌剂复合涂膜组与其它两组差异明显，其呼吸速率分别是复合涂膜组、对照组的59.6%和43.3%。该结果表明抑菌剂复合涂膜处理可抑制双孢蘑菇采后贮藏中呼吸速率的上升。谢雯君等[21]也发现涂膜处理能够抑制子实体呼吸作用，延长双孢蘑菇的保鲜品质。
2.4 不同涂膜处理对双孢蘑菇贮藏期间可溶性蛋白和MDA含量的影响
不同涂膜处理对采后双孢蘑菇贮藏期间可溶性蛋白和MDA的影响见图4。
图4 不同涂膜处理对采后双孢蘑菇贮藏期间可溶性蛋白和MDA的影响
Fig.4 Effects of different coating treatments on soluble protein and MDA of A.bisporus during postharvest storage
双孢蘑菇的贮藏品质与可溶性蛋白含量有着密切联系，可溶性蛋白含量越多，细胞膜的稳定性越强，双孢蘑菇子实体的抗性越高[22]。由图4A可知，抑菌剂复合涂膜组和复合涂膜组在整个贮藏过程均抑制了可溶性蛋白含量的下降，其中抑菌剂复合涂膜组抑制效果更明显。贮藏第2天，抑菌剂复合涂膜组的可溶性蛋白含量是对照组的1.21倍，是复合涂膜组的1.07倍，这说明抑菌剂复合涂膜处理可有效抑制采后双孢蘑菇子实体内可溶性蛋白的降解。
MDA是膜脂过氧化的主要分解产物，其含量反映了植物体内细胞所受伤害的严重性，MDA越高，说明双孢蘑菇细胞受到的伤害越严重[23]。由图4 B可知，随着贮藏时间的延长，3组样品MDA含量均呈现整体增长的趋势，而抑菌剂复合涂膜组的MDA含量整体低于对照组和复合涂膜组。第6天的抑菌剂复合涂膜组的MDA含量与其它两组差异显著（P＜0.05），分别是对照组、复合涂膜组的70.7%、74.6%，说明抑菌剂复合涂膜处理可以延缓MDA的积累，从而抑制双孢蘑菇的膜脂过氧化。
2.5 不同涂膜处理对双孢蘑菇贮藏期间L*值、BI值、△E值和PPO酶活的影响
不同涂膜处理对采后双孢蘑菇贮藏期间L*值、BI值、△E值和PPO酶活的影响见图5。
图5 不同涂膜处理对采后双孢蘑菇贮藏期间L*值、BI值、ΔE值和PPO酶活的影响
Fig.5 Effects of different coating treatments on L*，BI and ΔE value and PPO activity of A.bisporus during postharvest storage
酚类物质在氧气和多酚类氧化酶的相互作用下，被氧化成醌类物质，是导致双孢蘑菇褐变的主要原因[24]。由图5A可知，3组样品的L*值均随着贮藏时间的延长逐渐降低，在3 d～6 d抑菌剂复合涂膜组的L*值显著高于对照组（P＜0.05），最高达对照组的1.03倍。由图5B和图5C可知，BI值和△E值随着贮藏时间的延长逐渐增大。在整个贮藏期间，对照组的BI值和△E值均高于复合涂膜组和抑菌剂复合涂膜组。第6天时，对照组的BI值分别为复合涂膜组和抑菌剂复合涂膜组的1.09倍和1.13倍。贮藏第4天，抑菌剂复合涂膜组的△E值为对照组的30.2%。从整体来看，复合涂膜组和抑菌剂复合涂膜组在整个贮藏期间的L*值、BI值、△E值无明显差异。由图5D可知，对照组PPO酶活在贮藏过程中整体呈上升趋势，抑菌剂复合涂膜组和复合涂膜组的PPO酶活在整个贮藏期间均低于对照组，尤其在第5天，抑菌剂复合涂膜组的PPO酶活仅为对照组的71.9%，说明抑菌剂复合涂膜处理能抑制双孢蘑菇贮藏中PPO酶活增加。以上结果说明，抑菌剂复合涂膜处理可以有效地抑制双孢蘑菇褐变，使其更好地维持保鲜品质。
2.6 不同涂膜处理对双孢蘑菇贮藏期间抗氧化相关酶活性的影响
SOD、POD和CAT是主要的抗氧化酶，能够消除双孢蘑菇子实体内活性氧的积累[25]。不同涂膜处理对采后双孢蘑菇贮藏期间SOD、POD和CAT酶活的影响见图6。
图6 不同涂膜处理对采后双孢蘑菇贮藏期间SOD、POD和CAT酶活的影响
Fig.6 Effects of different coating treatments on SOD，POD and CAT activities of A.bisporus during postharvest storage
由图6A可知，3组处理的SOD酶活均呈先上升后下降，继而再上升又下降的趋势。与对照组相比，抑菌剂复合涂膜组和复合涂膜组均明显促进了SOD酶活的上升，尤其贮藏后4 d抑菌剂复合涂膜组的SOD酶活均高于其它组。第3天抑菌剂复合涂膜组的SOD酶活是复合涂膜组的1.18倍，是对照组的1.59倍。由图6B可知，双孢蘑菇中POD酶活呈现波动上升的趋势。各处理组中，抑菌剂复合涂膜组的POD酶活在贮藏后4 d高于其它组，3 d～6 d显著高于对照组（P＜0.05），第6天时的POD酶活分别是复合涂膜组和对照组的1.96倍和2.21倍。由图6 C可以看出，3组样品的CAT酶活均呈先下降后上升继而再下降又上升的趋势。整个贮藏期间，抑菌剂复合涂膜处理对CAT酶活的上升没有显著诱导效果，仅在贮藏第3天，该组的CAT酶活与复合涂膜组和对照组的差异显著（P＜0.05），分别是复合涂膜组和对照组的1.09倍和1.27倍。以上结果表明，抑菌剂复合涂膜处理可以明显增强SOD、POD、CAT三种抗氧化酶的活性，有利于提高双孢蘑菇采后贮藏期间的抗氧化能力。
3 结论
本试验将涂膜保鲜法与抑菌剂相结合，对双孢蘑菇进行不同的涂膜处理。结果显示，抑菌剂复合涂膜处理不仅有效抑制双孢蘑菇的失重率、呼吸速率和开伞率的上升，同时也有效地延缓了硬度的下降、可溶性蛋白的降解以及抑制多酚氧化酶的活性，从而减轻了褐变现象。此外，抑菌剂复合涂膜处理还可以增强双孢蘑菇中抗氧化物酶活，降低膜脂过氧化产物在子实体内的积累。通过以上结果可以得出，抑菌剂复合涂膜处理能够有效维持采后双孢蘑菇品质，有利于双孢蘑菇采后贮藏的保鲜，在食用菌保鲜领域有一定的实用价值，具有广阔的发展前景。
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