γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA） 是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通过γ-羧基和α-氨基之间的酰胺键连接的水溶性高分子材料[1-2]。由于其对环境无污染，具有优良的生物降解性、成膜性、纤维性、保水性等特殊的理化性能，被广泛应用于医药、农业、环保、化妆品、食品等行业[3-7]。Ivánovics等[8]在炭疽芽孢杆菌中第一次发现γ-PGA，是其芽孢杆菌荚膜的主要成分；之后Bovarnick[9]从枯草芽孢杆菌的发酵液中发现了γ-PGA。微生物发酵制备γ-PGA主要使用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）等芽孢杆菌属。
目前微生物发酵存在产量不高，菌株性能不稳定，生产成本高，难以工业化生产等问题，筛选高产菌株、优化发酵培养基与培养条件是提高γ-PGA产量的几个主要手段。目前，γ-PGA生产菌株多为谷氨酸依赖型，常用碳源有葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油等。张雷等[10]利用响应面法优化，发现使用葡萄糖作为碳源发酵γ-PGA产量最高，达到28.1 g/L；盛洁等[11]以蔗糖为碳源利用响应面法优化得到的γ-PGA产量为41.2 g/L。糖蜜中以蔗糖为主[12]，因此糖蜜可以作为碳源被应用到微生物发酵中，姚丽萍等[13]研究了糖蜜为碳源发酵L-丝氨酸，最终L-丝氨酸产量为32.76 g/L，相较于蔗糖发酵产量提高了29.44%；徐海东等[14]使用糖蜜发酵乙醇，发酵结束乙醇浓度达到100.99 g/L。孔凡利等[15]使用菠萝皮渣与甘蔗糖蜜复合发酵酿制果醋，醋香味明显；刘红阳[16]利用枯草芽孢杆菌yt102以糖蜜为碳源发酵农用γ-PGA，产量可达32.7 g/L。
本研究为了提高γ-PGA产量，降低生产成本，以甘蔗糖蜜为碳源，对培养基组分进行响应面优化，采用单因素试验筛除培养基中对γ-PGA产量起抑制或无影响的组分，确定显著因子中心点，Box-Behnke设计[17]构建相应方程并预测得到最优培养基配方，为γ-PGA的工业化生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）CGMCC NO.23967：天津北洋百川生物技术有限公司。
1.1.2 主要试剂
胰蛋白胨（生化试剂）、酵母浸膏（生化试剂）、琼脂粉（分析纯）、葡萄糖（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、（NH4）2SO4、K2SO4、CaSO4·2H2O、FeSO4·7H2O、甘 油（均为分析纯）：维科特天津化工产品贸易有限公司；酵母膏（Ⅰ型～Ⅶ型）：北京奥博星生物技术有限责任公司；蛋白胨（Ⅰ型～Ⅵ型）：安琪酵母股份有限公司；味精（99%）：梅花生物科技集团股份有限公司；甘蔗糖蜜：市售；纯净水：杭州娃哈哈集团有限公司。
1.2 仪器与设备
752紫外分光光度计：天津市光学仪器厂；SBA-40E生物传感仪：山东省科学院生物研究所；LC-20AT高效液相色谱分析仪：日本岛津有限公司。
1.3 方法
1.3.1 培养基配制
LB固体培养基：NaCl 10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，琼脂2%。调节初始pH7.2～pH7.3，121℃灭菌20 min。
种子培养基：葡萄糖30 g/L、酵母膏7 g/L、K2HPO4·3H2O 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L，初始 pH（7.2±0.1），121 ℃灭菌 20 min。
初始发酵培养基：味精浓度70 g/L、糖蜜可溶性固形物 9%、酵母膏 10 g/L、蛋白胨 5 g/L、（NH4）2SO47 g/L、K2SO415 g/L、CaSO4·2H2O 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.1 g/L、甘油 60 mL/L，初始 pH（7.2±0.1），121℃灭菌20 min。
1.3.2 菌种培养方法
种子活化：在无菌操作台用接种环从甘油管中蘸取2环～3环菌液，划线于装有LB固体培养基的培养皿中，放置在37℃恒温培养箱中培养16 h。然后将培养皿中的菌种挑起，并均匀涂抹于斜面培养基上，37℃恒温培养12 h。
种子培养：接种前将灭菌后的葡萄糖溶液转入装有种子培养基的三角瓶中，然后使用接种环将活化好的菌种斜面接种于装有100 mL种子培养基的500 mL无挡板三角瓶中，置于转速为220 r/min的37℃恒温摇床中培养14 h～16 h。
发酵培养：将种子液以10%接种量接入含有5 mL发酵培养基的500 mL挡板三角瓶中，置于转速为220 r/min的37℃恒温摇床中培养72 h。
1.3.3 γ-PGA标准曲线制作
准确称取γ-PGA标准品0.100 0 g，于80 mL纯净水中溶解后定容至100 mL，配制成浓度为1 g/L的母液，取适量母液逐级稀释，配制 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的浓度梯度的标准液。以0.22 μm水相滤膜过滤上述5个梯度浓度的γ-聚谷氨酸标准液并装入2.5 mL的液相小瓶中，将样品放入高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪，利用紫外检测器检测，建立峰面积和标准品浓度的标准曲线。
HPLC的检测条件：紫外检测器、波长210 nm、凝胶渗透色谱柱、流动相0.05 mol/L无水Na2SO4溶液、流速 0.5 mL/min、停止时间 35 min、进样量 20 μL、检测器温度35℃、柱温30℃。
1.3.4 样品γ-PGA浓度测定
取发酵液15000r/min离心15min，取1mL上清液到100 mL容量瓶用流动相定容至100 mL，以0.22 μm水相滤膜过滤上述稀释后的样品并装入2.5 mL的液相小瓶中，放入HPLC仪，利用紫外检测器检测，利用标准曲线计算出样品浓度。
1.3.5 可溶性固形物含量测定
将样品滴到手持糖度计检测棱镜上，合上盖板，避免气泡产生，使溶液遍布棱镜表面；将手持糖度计的进光板对准光源或明亮处，眼睛通过目镜观察视场，蓝黄分界线的刻度值即为样品溶液的可溶性固形物含量。
1.3.6 工艺优化试验说明
1.3.6.1 单因素试验设计
探索培养基中甘油浓度（0、20、40、60、80 mL/L）、糖蜜可溶性固形物浓度（5%、7%、9%、11%、13%）、不同酵母膏种类、酵母膏浓度（1、4、7、10、13、16 g/L）、不同蛋白胨种类、（NH4）2SO4浓度（0、2、4、6、8、10 g/L）、K2SO4浓度（0、3、6、9、12、15 g/L）、CaSO4·2H2O 浓度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L）、MgSO4·7H2O 浓 度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L）、FeSO4·7H2O 浓度（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 g/L）、味精浓度（0、20、40、60、80、100 g/L） 对地衣芽孢杆菌 （Bacillus licheniformis）CGMCC NO.23967产γ-聚谷氨酸的影响。
1.3.6.2 响应面优化试验设计
采用三因素三水平响应面试验研究主要影响因子对地衣芽孢杆菌CGMCC NO.23967产γ-PGA的影响，通过单因素试验确定糖蜜可溶性固形物浓度、酵母膏浓度、FeSO4·7H2O浓度作为因变量，γ-PGA产量为响应值。试验因素与水平编码如表1所示。
表1 响应面设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface design
水平 A糖蜜可溶性固形物浓度/%C FeSO4·7H2O浓度/（g/L）-1 7 2 0.5 0 9 4 0.7 B酵母膏浓度/（g/L）1 11 6 0.9
1.4 数据处理
采用Design-expert 8.0.6软件进行响应面试验数据处理，采用Origin 2018作图，Excel进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 培养基成分单因素试验
碳氮源对γ-PGA产量的影响如图1所示。
图1 碳氮源对γ-PGA产量的影响
Fig.1 Effect of the carbon and nitrogen source on the yield of γ-PGA
A.甘油浓度；B.糖蜜可溶性固形物浓度；C.酵母膏种类；D.酵母膏浓度；E.蛋白胨种类；不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图1A可知，当甘油浓度为0～40 mL/L时，γ-PGA产量差异不明显，当甘油浓度在高于40 mL/L时，γ-PGA产量明显下降，由此可见，当甘油浓度低时，对该菌株的γ-PGA产量影响不大，当甘油浓度较高时抑制该菌株产γ-PGA，因此后续试验发酵培养基中不再添加甘油。甘油在初始发酵培养基中成本占比相对较高，因此当发酵培养基中去除甘油后，发酵成本显著降低。由图1B可知，γ-PGA产量在糖蜜可溶性固形物浓度为5%～9%时，随着糖蜜可溶性固形物浓度增加而增加，在糖蜜可溶性固形物浓度为9%时达到最大，最大产量为（36.02±0.76）g/L，当糖蜜可溶性固形物浓度为9%～13%时，随着糖蜜可溶性固形物浓度的增加，γ-PGA产量下降。因此，选择糖蜜可溶性固形物添加量9%为最佳添加量。由图1C可知，使用Ⅲ型酵母膏γ-PGA的产量明显高与其他种类的酵母膏，产量最高。可以看出不同型号的酵母膏对γ-PGA产量影响显著，可能不同种类型号所含成分有差异，因此，选择Ⅲ型酵母膏作为最佳酵母膏，后续试验使用Ⅲ型酵母膏。由图1D可以看出，当酵母膏浓度为4 g/L时γ-PGA产量最高，低于4 g/L时随着酵母膏浓度的增加，γ-PGA产量增加，当酵母膏浓度高于4 g/L时，γ-PGA产量随酵母膏浓度的增加而减少，因此选择4 g/L为酵母膏最佳浓度。由图1E可知，在不添加蛋白胨的情况下，酵母膏与糖蜜所提供的有机氮源已经可以满足菌体自身生长需求，不需要额外再添加有机氮源，因此，后续试验不再添加蛋白胨，进一步降低了成本。
金属元素与味精对γ-PGA产量的影响如图2所示。
图2 金属元素与味精对γ-PGA产量的影响
Fig.2 Effect of metallic element and monosodium glutamate on the yield of γ-PGA
A.K2SO4浓度；B.（NH4）2SO4浓度；C.CaSO4·2H2O浓度；D.MgSO4·7H2O浓度；E.FeSO4·7H2O浓度；F.味精浓度；不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图2A可知，随着K2SO4浓度的提高，γ-PGA产量降低，钾离子在微生物体内直接参与物质运输，但在本试验中钾离子的添加出现抑制现象，推测糖蜜中可能含有足够的钾离子（4.45%）满足菌体生长需求。因此，将K2SO4从培养基中除去，后续试验不再添加，发酵培养基成本进一步降低。由图2B可知，（NH4）2SO4的添加并不会对γ-PGA的产量有促进作用，相反，当（NH4）2SO4浓度高于8 g/L时，对γ-PGA有明显抑制作用，因此，后续试验不再添加（NH4）2SO4。由图2C、2D可知，CaSO4·2H2O与MgSO4·7H2O浓度对γ-PGA产量均无显著影响。由图2E可知，FeSO4·7H2O的浓度对γ-PGA产量影响较大，当FeSO4·7H2O浓度在0～0.7 g/L时，随着FeSO4·7H2O浓度增加，γ-PGA产量明显增加，并在FeSO4·7H2O浓度为0.7 g/L时达到最高；当FeSO4·7H2O浓度高于0.7 g/L时，γ-PGA产量变化不明显。因此，选择0.7 g/L为FeSO4·7H2O的最佳添加浓度。γ-PGA生产菌株按是否需要大量外源添加谷氨酸单体分为谷氨酸依赖型与非谷氨酸依赖型[18]。味精作为γ-PGA的前体物质，味精的浓度对γ-PGA产量比较明显，由图2F可知，当味精浓度在0～80 g/L时，γ-PGA产量显著增加，当味精浓度高于80 g/L时，γ-PGA产量不再增加。因此选择80 g/L为味精最佳添加浓度。
2.2 响应面设计试验结果
选取糖蜜可溶性固形物浓度（A）、酵母膏浓度（B）、FeSO4·7H2O 浓度（C）为试验因素，γ-PGA 产量（Y）为响应值进行响应面试验，并对结果进行方法分析，响应面试验设计与结果如表2所示，方差分析如表3所示。
表2 响应面试验设计与结果
Table 2 Design and results of response surface
试验号 糖蜜可溶性固形物浓度酵母膏浓度FeSO4·7H2O浓度γ-PGA产量/（g/L）1-1 -1 0 56.73±0.11 2 1-1 0 53.67±0.30 3-1 1 0 57.38±0.24 4 1 1 0 55.61±0.41 5-1 0 -1 55.75±0.66 6 1 0 -1 55.82±0.32 7-1 0 1 62.14±0.10 8 1 0 1 57.35±0.07-1 0 53.17±0.25 10 0 1 0 55.31±0.13 11 0 -1 1 59.01±0.18 12 0 1 1 62.89±0.42 13 0 0 0 66.31±0.72 14 0 0 0 67.19±0.29 15 0 0 0 66.71±0.02 16 0 0 0 66.50±0.19 17 0 0 0 65.58±0.16 9 0
表3 响应面试验结果方差分析
Table 3 Analysis of variance of response surface results
注：*表示存在显著性差异（P＜0.05）；**表示存在极显著性差异（P＜0.01）。
项目 平方和 自由度 均方 F值模型 404.92 9 44.99 47.43 A 11.39 1 11.39 12.01 B 9.26 1 9.26 9.76 C 57.00 1 57.00 60.09 AB 0.43 1 0.43 0.45 AC 5.92 1 5.92 6.24 BC 0.76 1 0.76 0.80 A2 114.73 1 114.73 120.95 B2 122.37 1 122.37 129.01 C2 50.80 1 50.80 53.55残差 6.64 7 0.95失拟项 5.24 3 1.75 5.00纯误差 1.40 4 0.35总和 411.56 16 P值＜0.000 1 0.010 5 0.016 7 0.000 1 0.524 7 0.041 1 0.401 9＜0.000 1＜0.000 1 0.000 2显著性****** * ******0.077 0
使用Design Expert软件对响应面试验结果进行分析，得到以γ-PGA产量为因变量，A、B、C为自变量的二次多项式回归方程：γ-PGA产量Y=66.46-1.19A+1.08B+2.67C+0.33AB-1.22AC+0.43BC-5.22A2-5.39B2-3.47C2。线性模型自变量系数的正系数表示促进作用，负系数表示抑制作用[19]，B、C系数为正表示在研究范围内有利于提高γ-PGA的产量，A则相反。当回归系数和各独立因素之间的交互作用P值低于0.05时，在统计学上认为是差异显著的[20]，由表3可知，本试验的P＜0.000 1，说明回归方程的显著性为差异极显著。失拟项P值为0.077＞0.05，说明失拟项不显著。从表中可以看出，C、A2、B2和 C2对 γ-PGA 产量影响极显著（P＜0.01），A、B 与 AC 差异显著（P＜0.05），交互项 AB、BC差异不显著（P＞0.05）。另外，该模型决定系数为R2=0.983 9，R2Adj=0.963 1，均大于0.95，说明拟合程度较好，预测值与实际值具有高度的相关性，可以应用于地衣芽孢杆菌CGMCC NO.23967菌株发酵γ-PGA的理论预测。
响应面设计的曲面图可以清晰地展示出两种变量之间的交互作用，以及各变量对γ-PGA产量的影响[21]，本研究利用响应面法揭示了糖蜜可溶性固形物浓度、酵母膏浓度与FeSO4·7H2O浓度对γ-PGA产量的影响，控制其中一个因素不变，另外两个因素交互作用而呈现出来的三维曲面图与等高线图如图3～图5所示。
图3 糖蜜可溶性固形物浓度与酵母膏浓度交互作用对γ-PGA产量的影响
Fig.3 Effect of interaction between soluble solid concentration of molasses and yeast extract concentration on the yield of γ-PGA
图4 糖蜜可溶性固形物浓度与FeSO4·7H2O浓度交互作用对γ-PGA产量的影响
Fig.4 Effect of interaction between soluble solids concentration of molasses and FeSO4·7H2O concentration on the yield of γ-PGA
图5 酵母膏浓度与FeSO·47H2O浓度交互作用对γ-PGA产量的影响
Fig.5 Effects of interaction between yeast extract concentration and FeSO·47H2O concentration on the yield of γ-PGA
从三维曲面图可以看出随着各因素的用量增加，γ-PGA产量也随之增加，到达最高点后，随着各因素用量继续增加，γ-PGA产量开始呈现下降趋势。响应面弯曲度越大说明两个因素的交互作用越明显，与图4相比图3与图5弯曲程度最高，三者的响应面弯曲程度顺序为糖蜜可溶性固形物浓度与FeSO4·7H2O浓度的交互作用＞酵母膏浓度与FeSO4·7H2O浓度的交互作用＞糖蜜可溶性固形物浓度与酵母膏浓度的交互作用。
响应面的等高线图可以反映出两个因素交互作用对响应值的影响，如果等高线形状为椭圆形，则两个因素交互作用显著；等高线越接近圆形，则两个因素交互作用越不显著 [22]。图3与图5中等高线图接近圆形，表明糖蜜可溶性固形物浓度与酵母膏浓度、酵母膏浓度与FeSO4·7H2O浓度的交互作用对γ-PGA产量影响不显著，图4等高线图近似椭圆形，表明糖蜜可溶性固形物浓度与FeSO4·7H2O浓度的交互作用对γ-PGA产量影响显著。图3酵母膏浓度与糖蜜可溶性固形物浓度交互作用的等高线在糖蜜可溶性固形物浓度一侧排列更为紧密，说明糖蜜可溶性固形物浓度对γ-PGA产量的影响比酵母膏浓度更大；图5酵母膏浓度与FeSO4·7H2O浓度交互作用的等高线排列紧密程度差距不明显；而图4糖蜜可溶性固形物浓度与FeSO4·7H2O浓度交互作用的等高线在糖蜜可溶性固形物浓度一侧排列更紧密，说明糖蜜可溶性固形物浓度相比于FeSO4·7H2O浓度对γ-PGA产量影响更大。
2.3 响应面优化试验预测结果验证
回归方程表明当糖蜜可溶性固形物浓度为8.68%、酵母膏浓度4.23 g/L、FeSO4·7H2O浓度为0.78 g/L，味精浓度为80 g/L时，γ-PGA产量预测值最高达67.17 g/L。为了验证响应面分析的准确性，通过模拟出的最佳培养基参数进行6次重复发酵验证，得到γ-PGA产量平均值为（67.88±0.41）g/L。试验值与预测值相差0.71 g/L，有99%的概率接近实际值，说明响应面试验模型可靠，为后续发酵罐放大试验与工业化生产奠定了基础。
3 结论
以甘蔗糖蜜为碳源发酵γ-PGA，用单因素试验筛选出初始培养基中，对γ-PGA产量有消极作用或无显著影响的因素以提高产量及降低成本，应用响应面法确定了糖蜜可溶性固形物、酵母膏与FeSO4·7H2O浓度。结果显示，最佳培养基为糖蜜可溶性固形物浓度8.68%、酵母膏浓度4.23 g/L、FeSO4·7H2O浓度0.78 g/L，味精浓度80 g/L，在此条件下γ-PGA产量为（67.88±0.41）g/L，相较于优化前（31 g/L）优化后γ-PGA产量提高了1.19倍。为后续放大试验与工业化生产奠定基础，为糖蜜发酵γ-PGA提供方案。
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