菌酶协同水解玉米浆制备植物蛋白调味液工艺优化

玉米浆是湿法生产玉米淀粉的副产物，是价格低、产量高、品质良好的植物蛋白质资源，但其易变质、难运输，导致未能进行合理利用，造成优质资源的浪费[1-2]。因此，需进一步研究提高玉米浆的深加工利用的技术。如利用玉米浆生产植物蛋白调味液[3-4]，可以提高玉米浆附加值。

植物蛋白调味液（hydrolyzed vegetable protein，HVP）广泛应用于配制酱油、餐饮配料、休闲食品调味料等食品领域。目前，主要采用酸水解法、微生物发酵法和酶法生产HVP。酸水解法工艺简单、操作简便且产品得率高，是生产HVP中最为普遍的传统方法，但此法制备的产物含3-氯丙醇类致癌物质[5]，具有一定的食品安全隐患；微生物发酵法主要是通过发酵过程中产生的酶发挥作用，能有效降低生产成本，但微生物单独作用产生的酶含量低，无法满足实际生产需求；酶法的效率较高，酶解时间约为2 h～24 h[5-15]，水解反应程度易控制，但成本较高，且易产生苦味物质[5-6]，影响产品风味。

菌酶协同是利用微生物发酵和酶解结合水解原料的工艺，经微生物发酵工艺处理后，添加适量的蛋白酶制剂可以解决微生物产酶不足的问题，微生物在发酵过程中会产味、产香，改善水解液的风味，两者协同作用水解蛋白质原料，可以增加肽含量，提升水解液的营养价值。同时，从安全性考虑，菌酶协同作用生产的水解液，不会产生3-氯-1，2-丙二醇等有毒致癌物质，提高了食品安全性，且米曲霉种曲和酶制剂综合使用，降低了原料成本。

本文以玉米浆为原料，选用米曲霉种曲和风味蛋白酶为水解剂，综合考虑水解液的氨基酸态氮含量和可溶性蛋白含量，确定菌酶协同水解玉米浆制备HVP的适宜工艺，并对其品质指标进行测定，为玉米浆在食品领域的利用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料与试剂

米曲霉种曲：齐齐哈尔大学玉米深加工工程技术研究中心实验室自制；复配蛋白酶（酶活1.7×105U/g）、酸性蛋白酶（酶活5.0×104U/g）、木瓜蛋白酶（酶活1.1×105U/g）：南宁东恒华道生物科技责任有限公司；复合蛋白酶（酶活 6.9×104U/g）、风味蛋白酶（酶活 1.6×104U/g）、碱性蛋白酶（酶活 7.6×104U/g）：丹麦 Novo公司；玉米浆（干基粗蛋白含量为44.17%）：龙江阜丰生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

全自动氨基酸分析仪（日立L-8900型）：日立Hitachi公司；VELP-杜马斯定氮仪（NDA701）：北京盈盛恒泰科技有限责任公司；pH计（PB-10）：上海精密科学仪器有限公司；分析天平（FA1104）:上海上平仪器公司；紫外分光光度计（TU-1810）：北京普析通用仪器有限责任公司；立式压力蒸汽灭菌锅（YXQ-LS-30SII）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；智能磁力搅拌器（ZNCL-GS）：上海凌科实业发展有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 米曲霉种曲的制备

1.3.1.1 培养基比例

豆粕（g）∶麸皮（g）∶玉米浆（mL）∶水（mL）=3∶7∶1∶8[4]。

1.3.1.2 培养方法

接种量0.3%（质量分数），浅盘（24cm×18cm×2.7cm）培养，厚度约为1.5 cm，培养温度为30℃～32℃，培养时间为36 h（低温时48 h）。

1.3.2 米曲霉种曲水解玉米浆制备HVP

1.3.2.1 水解原料

水解原料为玉米浆。

1.3.2.2 预处理

玉米浆混和均匀，50℃水浴30 min，按玉米浆质量加入质量分数 2.1%的中和剂[Ca（OH）2∶NaOH=1∶6，质量比]调节pH值为5.5～6.0，50℃中和反应1 h[先加NaOH 反应 20 min，再加 Ca（OH）2反应 40 min]，得到预处理液。

1.3.2.3 水解

添加质量分数1.86%的米曲霉种曲，温度50℃，水解3 h，得到米曲霉种曲水解液。

1.3.3 菌酶协同水解玉米浆制备HVP

1.3.3.1 蛋白酶的筛选

前期探究米曲霉种曲水解玉米浆的工艺条件得出，水解的最适pH值为5.5～6.0，固定米曲霉种曲作为第一步水解剂，将第一阶段水解液体系的温度和pH值调至每种蛋白酶的适宜条件，固定加酶量2 000 U/g，在此基础上继续研究蛋白酶种类对玉米浆的水解效果。以可溶性蛋白含量和氨基酸态氮含量为指标，筛选出1种适合与米曲霉种曲协同作用水解玉米浆的蛋白酶。不同种类蛋白酶的反应条件如表1所示。

1.3.3.2 菌酶协同水解玉米浆的条件优化

依次优化加酶量、温度、pH值和水解时间。加酶量为 500、1 000、1 500、2 000、2 500 U/g；温度为 50、55℃；pH 值梯度为 6.0、6.5、7.0、7.5和 8.0；水解时间为 1、2、3、4、5 h。水解结束后，转移至沸水浴灭酶 15 min，4 000 r/min离心10 min取上清液进行氨基酸态氮含量和可溶性蛋白含量的测定。

1.3.3.3 正交法优化确定最佳水解条件

根据1.3.3.2的试验结果，选取pH值（A）、水解时间（B）、加酶量（C）为自变量，氨基酸态氮含量和可溶性蛋白含量为评价指标，建立L9（33）正交试验，进一步优化菌酶协同水解玉米浆的工艺条件。采用层次分析法确定氨基酸态氮含量和可溶性蛋白含量的权重系数，根据综合评分进行正交结果的极差与方差分析，确定米曲霉种曲和风味蛋白酶协同水解玉米浆的最佳工艺参数。

1.3.4 粗蛋白含量的测定

取10mL玉米浆于称量瓶中，70℃条件下烘干10h，烘干后粉碎，称取样品30 mg～50 mg于锡箔纸中，包成球形，放入杜马斯定氮仪，读数并记录粗蛋白含量。

1.3.5 可溶性蛋白含量的测定

1.3.5.1 标准曲线的制作

利用Lowry法[16]测定可溶性蛋白含量，以牛血清白蛋白浓度为横坐标，640 nm吸光度为纵坐标，作标准曲线，如图1所示，得到线性回归方程y=0.002 8x+0.020 6，R2=0.996 5。

1.3.5.2 样品可溶性蛋白含量的测定

样品稀释后取1mL，加入甲液5mL，混匀静置10 min，再加乙液0.5 mL迅速混匀，30℃水浴保温30 min，测定640nm吸光度，样品可溶性蛋白含量计算公式如下。

式中：X为由标准曲线得出的样品稀释液的蛋白浓度，μg/mL；N为样品的稀释倍数。

1.3.6 氨基酸态氮含量的测定

参考GB/T 18186—2000《酿造酱油》测定氨基酸态氮含量。

取5 mL样品置于100 mL容量瓶定容，混匀取20 mL，置于200 mL烧杯中，加60 mL水，开启磁力搅拌器，用氢氧化钠标准溶液（0.05 mol/L）滴定至酸度计指示pH值8.2，加入10mL甲醛溶液（37%～40%），混匀。再用氢氧化钠标准滴定溶液继续滴定至pH值9.2，记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液体积。同时取80 mL水，重复滴定步骤做试剂空白试验，计算公式如下。

式中：X为样品中氨基酸态氮的含量（以氮计），g/100 mL；V1为样品稀释液消耗0.05 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；V2为空白试验消耗0.05 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；V3为样品稀释液取用量，mL；C为氢氧化钠标准滴定溶液浓度，mol/L；0.014为1 mL氢氧化钠标准滴定溶液（浓度为1.0 mol/L）相当于氮的质量，g。

1.3.7 呈味氨基酸含量的测定

采用酸水解法[17]测定，取适量20 mg左右样品于安瓿管中加入6 mol/L盐酸，氮吹5 min后封管，于105℃烘箱中水解24 h，测定样品蛋白中呈味氨基酸含量。

1.4 数据处理

试验数据采用SPSS软件、Yaahp软件处理，采用Origin软件作图。

2 结果与分析

2.1 米曲霉种曲对玉米浆水解效果的影响

米曲霉是我国食品生产中常用的菌株，具有生长速度快、酶系丰富[18]、适应能力强等特点，利用米曲霉制作种曲，制曲过程中产生丰富的酶系，其中蛋白酶可以将玉米浆中的蛋白质分解为小肽、氨基酸等物质[19]，再结合微生物自身代谢活动，提高玉米浆中有机氮源的利用率，增加水解液的鲜味和香气。因此，利用米曲霉种曲水解玉米浆是必要步骤。水解液的鲜味和香气主要来自氨基酸态氮，可溶性蛋白含量越高越易吸收，它们直接影响植物蛋白调味液的品质，因此研究米曲霉种曲对水解产物中氨基酸态氮含量和可溶性蛋白含量的影响，结果见图2。

由图2可知，玉米浆经米曲霉种曲水解3h后，相比玉米浆原液，氨基酸态氮含量显著提高了0.11 g/100 mL（p＜0.05），可溶性蛋白含量提高了 6.0 mg/mL，米曲霉种曲发酵过程中产生蛋白酶，玉米浆中的蛋白质被水解为具有一定空间结构的小分子蛋白，增加了蛋白质的溶解性。

2.2 菌酶协同作用对玉米浆水解效果的影响

2.2.1 蛋白酶的筛选

外加的蛋白酶可以解决微生物产酶不足的问题，两者协同作用水解玉米浆蛋白，能够提高反应速率，缩短反应时间，充分分解大分子营养物质，增加肽含量，提升水解液的营养价值。由于不同蛋白酶的切割位点和专一性不同[20-21]，所以不同蛋白酶和米曲霉种曲协同作用的效果也会不同，因此，对蛋白酶的种类进行筛选。根据蛋白酶生产厂家提供的酶反应条件，将体系的温度和pH值调至各蛋白酶适宜条件，加酶量2 000 U/g，以氨基酸态氮含量和可溶性蛋白含量为指标，比较6种蛋白酶对玉米浆的水解效果，根据试验结果筛选出1种蛋白酶进行菌酶协同水解玉米浆试验，试验结果如图3。

由图3可知，玉米浆经过风味蛋白酶酶解后可溶性蛋白含量和氨基酸态氮含量增加，且风味蛋白酶作用效果高于碱性蛋白酶，风味好，苦味小。经过风味蛋白酶酶解的水解液与米曲霉种曲单独水解玉米浆相比氨基酸态氮含量增加了0.28 g/100 mL，可溶性蛋白含量增加了17.15 mg/100 mL。风味蛋白酶为中性蛋白酶，综合考虑选用风味蛋白酶作为后续试验用酶。

2.2.2 加酶量对玉米浆水解效果的影响

加酶量是影响酶解反应的因素之一，加酶量太少底物分解不充分，加酶量过多则阻碍反应进行[22]，并且成本较高。所以应对蛋白酶添加量进行优化。调节米曲霉水解液pH值7.0，50℃水解3 h，不同的加酶量对水解液氨基酸态氮含量和可溶性蛋白含量的影响，结果如图4所示。

由图4可知，米曲霉种曲水解液的氨基酸态氮含量和可溶性蛋白含量与加酶量基本成正比。加酶量超过2 000U/g时，氨基酸态氮含量增加幅度减小，可溶性蛋白含量略微递减，可能是反应初期底物浓度较高，水解反应快速进行，氨基酸态氮含量和可溶性蛋白含量增加较快；水解反应进行到一定程度后，底物浓度减少，酶和底物结合达到饱和[23]，氨基酸态氮含量增长缓慢。风味蛋白酶添加量2 000 U/g时，米曲霉种曲水解液的氨基酸态氮含量和可溶性蛋白含量与米曲霉种曲水解液相比分别增加0.26 g/100 mL和32.04 mg/mL，水解效果最好，因此，选择加酶量为2 000 U/g。

2.2.3 温度对玉米浆水解效果的影响

温度对发酵和酶反应的影响是多方面的，它会影响各种酶反应的速率，影响微生物的代谢调控机制，进而影响发酵的动力学特性和产物的生物合成。温度过低，微生物生长代谢缓慢，酶活力下降；温度越高玉米浆黏度越小，流动性增强反应速度加快，温度过高导致蛋白质过度变性，微生物失活，影响氨基酸的生成率；适合的温度可以促进微生物生长代谢和酶促反应的进行。因此，应对水解温度进行优化。

调节米曲霉水解液pH值7.0、加酶量2 000 U/g和水解3 h，不同的温度对水解液氨基酸态氮含量和可溶性蛋白含量的影响，结果见图5。

在工厂常用操作温度基础上，对温度条件进行优化，试验结果表明，55℃条件下水解液的氨基酸态氮含量为1.81 g/100 mL比50℃条件下的1.77 g/100 mL增加0.04 g/100 mL，可溶性蛋白含量增加2.57 mg/mL。温度上升，玉米浆黏度下降，流动性增强，可以更好地与风味蛋白酶反应，并且在55℃条件下，风味蛋白酶能更好地发挥作用，但由于提高5℃所用的能源和成本远远高于水解液氨基酸态氮含量增加0.04 g/100 mL的价值，基于节约能源和成本考虑，选择50℃为反应温度。

2.2.4 pH值对玉米浆水解效果的影响

加酶量2 000 U/g，50℃水解3 h，调节米曲霉种曲水解液的pH值，研究pH值对水解液氨基酸态氮含量和可溶性蛋白含量的影响，结果见图6。

酶可以将玉米浆中的大分子物质分解成小分子肽和氨基酸，促进蛋白质的吸收和有效利用，增加水解液氨基酸态氮含量和可溶性蛋白含量，同时改善风味。过高或过低的pH值对酶活性和微生物生长繁殖不利，影响微生物对营养的吸收。酶只能在一定限度的pH值范围内才有活力，酶在最适pH值时活力最强，微生物在最适pH值范围内生长繁殖最快。因此，优化菌酶协同作用的pH值。由图6可知，不同pH值条件下，水解液中氨基酸态氮含量和可溶性蛋白含量不同，随着pH值的增加，氨基酸态氮含量和可溶性蛋白含量整体上呈现先上升后下降趋势，pH值7.0时氨基酸态氮含量最高为（1.80±0.01）g/100 mL，可溶性蛋白含量为（139.48±5.89）mg/mL。故选择最适pH7.0。

2.2.5 水解时间对玉米浆水解效果的影响

时间影响水解产物的含量，水解时间过短，玉米浆中的营养物质不能被充分利用，水解时间越长，微生物发酵和酶解作用越充分，但达到一定时间后增长较慢，时间过长，有害物质大量积累，影响水解液质量[4]。为了确定菌酶协同发酵玉米浆制备高含量营养物质的水解时间，在米曲霉种曲水解液pH值7.0，加酶量2 000 U/g，50 ℃条件下，设定水解时间梯度为 1、2、3、4、5 h。

水解时间对水解液氨基酸态氮含量和可溶性蛋白含量的影响，结果见图7。

经过菌酶协同作用的水解液可溶性蛋白含量和氨基酸态氮含量均有增加，两者水解5 h达到最大值，分别为（1.84±0.01）g/100 mL 和（144.19±1.39）mg/mL。氨基酸态氮含量是评价水解液的重要指标，水解3 h时，水解液的氨态氮含量为（1.76±0.02）g/100 mL，时间超过3 h后水解液的氨基酸态氮含量增加幅度减小，水解5 h相比水解3 h增加0.08 g/100 mL，综合考虑到节约时间和能源，选择3 h为最适反应时间。

2.2.6 正交分析

在单因素试验结果基础上，以可溶性蛋白含量和氨基酸态氮含量为指标，固定温度，利用正交试验对pH值、加酶量和水解时间进行参数优化，从而确定最佳水解条件。

2.2.6.1 正交试验设计

菌酶协同水解玉米浆蛋白工艺优化正交试验因素水平见表2。

2.2.6.2 正交试验结果

菌酶协同水解玉米浆蛋白工艺优化正交试验结果见表3。

2.2.6.3 指标权重系数的确定

参考文献[24]中层次分析法法确定权重系数，指标成对比较的判断优先矩阵见表4。

2.2.6.4 最佳水解工艺的确定

菌酶协同水解玉米浆蛋白正交试验直观分析结果见表5，方差结果分析见表6。

根据表5评分结果，用Yaahp软件计算，得到氨基酸态氮含量可溶性蛋白含量的权重系数分别为0.777 8和0.222 2；组合一致性比例因子=0.021 4＜0.10，说明指标成对比较的判断优先矩阵具有一致性，权重系数有效。由表5、表6可知，各因素对菌酶协同水解玉米浆工艺作用的影响程度为A＞B＞C。方差分析结果表明，pH值对试验结果的影响显著（p<0.05）。根据极差分析确定的最佳工艺为A2B3C3，与正交试验中最优组合一致，说明正交试验结果可信。依据氨基酸态氮含量分析，A2B3C3工艺组合下达到1.82 g/100 mL，A2B2C1工艺组合下达到1.80 g/100 mL，结合成本因素，选择A2B2C1为最佳工艺组合，即pH值7.0、水解时间3 h、加酶量1000U/g、温度50℃。

2.3 植物蛋白调味液的呈味氨基酸组成

天然蛋白质中的氨基酸及其盐大多具有甜味或苦味，其中天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸和酪氨酸这6种氨基酸呈现出特殊鲜味[25]，是植物蛋白调味液风味的重要组成部分。因此，对水解液的呈味氨基酸组成进行分析，结果见表7。

由表7可知，玉米浆原浆、米曲霉种曲水解液和菌酶协同水解液的呈味氨基酸含量分别为8.02%、8.99%和10.10%，玉米浆蛋白经过顺次水解，释放更多的游离氨基酸，米曲霉种曲水解液和菌酶协同水解液的呈味氨基酸总量在氨基酸总量中的占比分别为48.30%和47.49%，其中天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸和甘氨酸含量增加量最大，酪氨酸和苯丙氨酸略有增加，它们可能是玉米浆水解物鲜味和甜味的主要来源。

2.4 植物蛋白调味液的卫生指标

食品安全是关乎人体健康的重要问题，食品安全问题多种多样，其中致病菌会造成食品污染，重金属危害人体健康，3-氯-1，2-丙二醇等产物会引发癌症。所以基于食品安全角度出发，按照我国农业行业规定的绿色食品标准NY/T1886—2010《绿色食品复合调味料》对植物蛋白调味液进行检测，卫生指标检测结果见表8。

由表8可知，菌酶协同水解玉米浆制备的植物蛋白调味液中未检出3-氯-1，2-丙二醇、多氯联苯、黄曲霉毒素等致癌物质，不含有沙门氏菌等病原微生物，卫生指标符合食品安全标准，无毒、无害。

3 结论

本文以粗蛋白含量为44.17%的玉米浆为研究对象，采用单因素法和正交试验对菌酶协同水解玉米浆制备水解液的工艺进行优化，综合经济成本，得到最合适的工艺参数为pH值 7.0、水解时间3 h、加酶量1 000 U/g和温度50℃。在此条件下，可溶性蛋白为（138.57±1.28）mg/mL，氨基酸态氮含量为（1.80±0.01）g/100 mL，菌酶协同水解工艺能够显著提高玉米浆的营养价值。植物蛋白调味液呈味氨基酸含量占氨基酸总量的47.49%，风味良好，符合食品安全标准，为充分利用玉米浆蛋白提供新思路。

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Preparation Optimization of Hydrolyzed Vegetable Protein from Corn Steep Liquor by Aspergillus oryzae and Flavourzyme

WANG Xiao-yan1，2，LIU Xiao-lan1，2*，LIU Jing-quan2，ZHENG Xi-qun2，3
（1.College of Food and Biological Engineering，Qiqihar University，Qiqihar 161006，Heilongjiang，China；2.Key Laboratory of Corn Deep Processing Theory and Technology，Qiqihar 161006，Heilongjiang，China；3.Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163000，Heilongjiang，China）

Abstract：The preparation process of hydrolyzed vegetable protein (HVP)from high-concentration corn steep liquor by Aspergillus oryzae and flavourzyme was investigated and the content of amino nitrogen，the soluble protein concentration，and the composition of flavoring amino acids were analyzed to detect the food safety.A.oryzae was used to hydrolyze corn steep liquor alone to obtain the primary hydrolysate under the optimum conditions of pH5.5-6.0，hydrolysis time of 3 h，A.oryzae addition amount of 1.86%，and temperature of 50 ℃.The primary hydrolysate was further hydrolyzed by flavourzyme under the optimum conditions of pH7.0，hydrolysis time of 3 h，flavourzyme addition amount of 1 000 U/g，and temperature of 50 ℃.The results showed that the amino nitrogen content of the original corn steep liquor，the primary hydrolysate，and the final hydrolysate was 1.44 g/100 mL，1.55 g/100 mL，and 1.80 g/100 mL，respectively；the soluble protein concentrations were 102.94 mg/mL，108.94 mg/mL，and 138.57 mg/mL，respectively；the content of flavoring amino acids was 3.74%，4.34%，and 4.80%，respectively.The prepared HVP met food safety standards.

Key words：corn steep liquor；amino nitrogen；Aspergillus oryzae；flavourzyme；hydrolyzed vegetable protein

DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2022.20.020

基金项目：黑龙江省省属本科高校中央支持地方高校改革发展资金项目（2020GSP08）；黑龙江省“百千万”工程科技重大专项项目（2019ZX06B01）；齐齐哈尔市科技计划市校合作项目（SXSP-2019001）；2018年度黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目（YSTSXK201802）；齐齐哈尔大学2020年研究生创新科研项目（YJSCX2020023）

作者简介：王晓燕（1996—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品科学。

*通信作者：刘晓兰（1962—），女（汉），教授，博士，研究方向：食品科学与工程。

引文格式：

王晓燕，刘晓兰，刘井权，等.菌酶协同水解玉米浆制备植物蛋白调味液工艺优化[J].食品研究与开发，2022，43（20）：156-163.

WANG Xiaoyan，LIU Xiaolan，LIU Jingquan，et al.Preparation Optimization of Hydrolyzed Vegetable Protein from Corn Steep Liquor by Aspergillus oryzae and Flavourzyme[J].Food Research and Development，2022，43（20）：156-163.

加工编辑：孟琬星

收稿日期：2021-08-05