猕猴桃含有丰富的氨基酸、VC、钙等物质，具有很高的营养及保健价值[1-2]。猕猴桃果酒以猕猴桃果实为原料，经酵母等微生物发酵而成，风味独特，深受人们的喜爱[3-4]。但由于目前使用的酵母基本是针对葡萄酒的生产工艺特点而开发出来的酿酒活性干酵母或葡萄酒酵母[5]，具有明显针对性，在其他果酒的生产中效果并不显著[6]，猕猴桃果酒的特有风味不突出，因此亟待选育出适于猕猴桃果酒发酵的专用酵母。常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）诱变以安全高效、操作简便，并且正突变率较高、突变株遗传稳定性好等诸多优势在菌种选育等领域得到广泛应用[7-9]。
本研究以从多年野生猕猴桃树下土壤中分离得到了一株生香酵母X-5作为出发菌株，对其进行反复多次ARTP诱变，筛选发酵性能优良且遗传稳定的酵母菌株，并通过控制酵母接种量、发酵温度和初始pH值进行猕猴桃果酒的工艺条件优化，以期为生产优质猕猴桃果酒提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
徐香猕猴桃选自内乡县猕猴桃合作社；白砂糖、柠檬酸、酒石酸钾：市售；偏重亚硫酸钾、果胶酶：法国莱蒙特集团；出发菌株为实验室筛选的葡萄园有孢汉逊酵母X-5[10]。
1.2 仪器与设备
紫外分光光度计（TU-1810）：北京普析通用仪器有限责任公司；手持糖度计（PAL-1）：日本ATAGO（爱拓）中国分公司；单人双面净化台（SW-CJ-1F）：江苏苏中净化设备有限公司；立式实验室高压压力灭菌器（LDZM-40KCS）：上海申安医疗器械厂；pH计（PHSJ-3F）：上海雷磁仪器有限公司；ARTP-2诱变育种仪：北京艾德豪克国际技术有限公司。
1.3 方法
1.3.1 培养基配制
酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）、猕猴桃果汁培养基、沃勒斯坦实验室（wallerstein laboratory，WL）琼脂培养基、斜面培养基依据文献[11]配制。
1.3.2 ARTP诱变
将菌种接种到YPD液体培养基中，28℃培养13h，菌液用无菌水洗涤2次～3次，稀释至OD600nm为0.6～0.8，取菌液分别诱变 0、30、60、90、120 s，用无菌水适当稀释后涂布于YPD平板，28℃培养24 h后菌落计数，参考文献[12]所述方法，依据下式计算出每个处理的致死率，绘制致死率曲线。根据菌种致死率确定最适诱变时间。
根据致死率曲线，挑取致死率80%以上的诱变时间的单菌落平板划线培养（28℃）；挑选WL培养基上生长良好的菌株，菌株经斜面培养活化后接入YPD液体培养基中，28℃培养24h后，将菌液接入装有猕猴桃汁的三角瓶中，接种量为8%，28℃培养发酵8d，每天称重一次，测定菌株发酵力、酒液的残糖含量、VC含量、酒精度和香味等。以野生型酵母（X-5）为对照，综合评定筛选出发酵性能、产香能力等较好的猕猴桃酿酒酵母。
1.3.3 遗传稳定性试验
将复筛得到的突变株Y-5在初筛斜面培养基中28℃连续传代8次，液态发酵测定传代后菌株CO2失重量、酒液的残糖、VC含量、酒精度和香气强弱。
1.3.4 猕猴桃果酒发酵工艺优化
1.3.4.1 单因素试验
参考相关文献[13]，固定初始糖度为240 g/kg，分别考察不同菌株Y-5接种量（6%、8%、10%、12%、14%）、不同初始 pH 值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）、不同发酵温度（10、20、25、30、35℃）条件下，发酵时间 7 d后所制备猕猴桃果酒的VC含量和酒精度。
1.3.4.2 正交试验
正交试验因素及水平见表1。发酵结束后测定各发酵瓶中发酵液酒精度、VC含量作为正交试验指标。
表1 正交试验因素及水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
水平 因素A菌株Y-5接种量/% B发酵温度/℃ C初始pH值1 6 20 3.0 2 8 25 3.5 3 10 30 4.0
1.3.5 分析检测方法
以天平称量CO2失重量来测定菌株发酵力，通过CO2失重法比较各菌株的发酵能力[14]。
采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的规定方法测定糖含量（以还原糖计）、VC含量；采用GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》规定方法检测酒精度；采用嗅闻法判断产香情况[15]。
1.4 数据处理
试验数据采用平均值±标准差表示，使用SPSS21.0软件进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 ARTP诱变
2.1.1 ARTP诱变时间
按1.3.2方法对X-5菌株进行ARTP法诱变，结果见图1。
图1 菌株X-5诱变致死曲线
Fig.1 Mutagenic lethal curve of strain X-5
由图1可知，诱变处理60 s时，菌株X-5致死率为86.13%，能产生足够突变，且有一定数量的存活菌体，从而实现ARTP法高效诱变，故确定ARTP诱变时间为60 s。
2.1.2 酵母菌的筛选
选择6株生长较好的诱变后菌株和野生型酵母X-5做发酵力测试，结果如图2所示。
图2 不同菌株发酵时CO2失重变化曲线
Fig.2 Variation curve of weight loss of CO2during fermentation by different strains
由图2可见，6株诱变后菌株均于第2天达到最高的发酵速率，第4天后Y-5菌株发酵速率高于其他菌株水平；野生型菌株X-5发酵速率明显低于其他菌株发酵速率，Y-5菌株在第2天发酵速率稍低，但在后期的发酵过程中其发酵速率较高，优于大多数的菌株。8 d后测定菌种发酵力（CO2总失重量）、发酵液残糖含量、酒精度、VC含量及香气强弱，结果如表2所示。
表2 不同菌株的发酵指标
Table 2 Fermentation indexes of different strains
注：+++表示香气较强；++表示香气一般；+表示香气较弱。
菌株 CO2总失重量/g残糖/Brix酒精度/%vol VC含量/（g/L）香气强弱Y-1 12.650±0.049 10.029±0.042 10.170±0.042 0.349±0.004 +Y-2 12.851±0.060 9.970±0.042 10.298±0.040 0.352±0.004 ++Y-3 12.542±0.047 9.831±0.050 10.369±0.061 0.343±0.003 ++Y-4 12.660±0.087 10.070±0.068 10.272±0.046 0.357±0.005 ++Y-5 13.090±0.046 9.771±0.061 10.671±0.055 0.386±0.005 +++Y-6 11.871±0.068 10.030±0.046 10.130±0.045 0.369±0.003 ++X-5 8.670±0.059 14.789±0.079 9.601±0.046 0.328±0.006 ++
由表2可知，6株突变菌株CO2总失重量、残糖和酒精度等指标均优于野生型菌株X-5，其中突变菌株Y-5综合评定最佳，产香力强，性能优于野生型，发酵力比野生型X-5高50.98%，可用于后继试验。
2.1.3 遗传稳定性分析
将复筛得到的突变株在初筛斜面培养基中于28℃连续传代8次，发酵猕猴桃汁测定传代后菌株发酵性能及产香能力如表3所示。
表3 菌株Y-5的发酵指标
Table 3 Fermentation indexes of strain Y-5
注：+++表示香气较强。
传代次数香气强弱1 13.079±0.056 9.770±0.063 10.671±0.038 0.386±0.002 +++2 13.088±0.053 9.762±0.062 10.653±0.041 0.382±0.002 +++3 13.097±0.052 9.771±0.063 10.668±0.053 0.383±0.003 +++4 13.072±0.057 9.750±0.063 10.670±0.042 0.387±0.002 +++5 13.091±0.053 9.760±0.065 10.651±0.039 0.386±0.002 +++总失重量/g 残糖/Brix 酒精度/%vol VC含量/（g/L）CO2 6 13.070±0.053 9.751±0.063 10.634±0.052 0.389±0.003 +++7 13.063±0.052 9.768±0.063 10.660±0.052 0.388±0.003 +++8 13.069±0.053 9.760±0.062 10.667±0.045 0.385±0.002 +++
菌株经过8次传代并进行液态发酵，其发酵性能和产香能力差别不大，结果表明突变株Y-5具有较好的遗传稳定性，发酵性能好，产香能力强，可以用于猕猴桃果酒发酵。
2.2 发酵工艺优化
2.2.1 单因素试验
酵母接种量对猕猴桃果酒的VC含量及酒精度的影响如图3所示。
图3 酵母接种量对猕猴桃果酒VC含量及酒精度的影响
Fig.3 Effect of yeast inoculation amount on VClevel and alcohol content of kiwifruit wine
从图3可以看出，随着酵母接种量的增加，猕猴桃果酒VC含量呈现先上升后下降的趋势，这和周元等[13]研究结果一致，当酵母接种量大于8%时，果酒VC含量和酒精度逐渐下降，原因可能在于随着酒精度的升高抑制了酵母的繁殖和活性[16]，另外过高的酵母浓度加速了酵母衰老死亡，为此，本研究选定8%为最佳酵母接种量。
发酵温度对猕猴桃果酒VC含量及酒精度的影响见图4所示。
图4 发酵温度对猕猴桃果酒VC含量和酒精度的影响
Fig.4 Effect of fermentation temperature on VClevel and alcohol content of kiwifruit wine
从图4可以看出，随着发酵温度的上升，果酒发酵速度加快，酒精度快速增加，但是较高的温度会导致VC的损失，酒精度升高也会抑制酵母繁殖[16]，因此，当发酵温度高于25℃后，VC含量和酒精度逐渐下降。另外，过低、过高的温度均不利于果酒香气及口感[17]。为此综合考虑选定最佳发酵温度为25℃。
发酵初始pH值对猕猴桃果酒VC含量及酒精度的影响如图5所示。
图5 发酵初始pH值对猕猴桃果酒VC含量和酒精度的影响
Fig.5 Effect of initial pH on VClevel and alcohol content of kiwifruit wine
从图5可以看出，VC含量及酒精度随着pH值变大呈现先缓慢上升后下降的趋势，当pH值为3.5时，VC含量和酒精度最高。宋淑红[18]研究发现较低的初调pH值更有利于苹果酒到达发酵终点，何晨等[19]认为过低或过高pH值会影响发酵速率，刘沁源等[20]研究发现初始pH值过低或过高均会影响果酒的风味与品质，为此本研究选定最佳初始pH值为3.5。
2.2.2 正交试验
根据单因素试验结果，以菌株Y-5接种量、发酵温度、初始pH值为影响因素，以酒精度和VC含量为评价指标，采用L9（34）正交试验设计对猕猴桃果酒发酵工艺条件进行优化。正交试验的结果及分析分别见表4和表5，指标为酒精度和VC含量的正交试验设计结果方差分析分别见表6和表7。
表4 正交试验设计方案
Table 4 The design scheme of orthogonal experimental
试验号A菌株Y-5接种量pH值 酒精度/%volVC含量/（g/L）1 1 1 1 1 9.62 0.392 2 2 1 2 2 2 10.67 0.386 8 3 1 3 3 3 9.86 0.325 8 4 2 1 2 3 10.68 0.392 6 5 2 2 3 1 11.08 0.381 6 6 2 3 1 2 10.86 0.358 6 7 3 1 3 2 9.73 0.398 7 8 3 2 1 3 9.91 0.345 1 9 3 3 2 1 9.28 0.323 3 B发酵温度 空列 C初始
表5 正交试验设计结果分析
Table 5 Analysis of the results of orthogonal experimental design
指标 项目 A B 空列 C酒精度 k1 30.15 30.03 30.39 29.98 k2 32.62 31.66 30.63 31.26 k3 28.92 30.00 30.67 30.45极差R 3.70 1.66 0.28 1.28最优方案 A2B2C2 VC含量 k1 1.104 8 1.183 5 1.095 9 1.097 1 k2 1.132 8 1.113 5 1.102 7 1.144 1 k3 1.067 1 1.007 7 1.106 1 1.063 5极差R 0.065 7 0.175 8 0.010 2 0.080 6最优方案 B1C2A2
表6 指标为酒精度的正交试验设计结果方差分析
Table 6 Analysis of variance of results of orthogonal experimental design with alcohol content as index
源 III型平方和 df 均方 F Sig.校正模型 0.007a 6 0.001 130.490 0.008截距 1.213 1 1.213 134 960.975 0.000酵母接种量 0.001 2 0.000 40.298 0.024发酵温度 0.005 2 0.003 290.406 0.003初始pH值 0.001 2 0.001 60.766 0.016误差 1.798×10-5 2 8.991×10-6
表7 指标为VC含量的正交试验设计结果方差分析
Table 7 Analysis of variance of results of orthogonal experimental design with VCcontent as index
源 III型平方和 df 均方 F Sig.校正模型 0.003a 6 0.000 54.528 0.018截距 1.254 1 1.254 147 031.185 0.000酵母接种量 0.002 2 0.001 88.158 0.011发酵温度 0.001 2 0.001 74.002 0.013初始 pH 值 2.426×10-5 2 1.213×10-5 1.422 0.413误差 1.706×10-5 2 8.530×10-6
采用综合平衡法确定猕猴桃果酒工艺条件最优方案。从表5极差分析可以看出，空列极差在两个指标分析里均为最小，说明可以不考虑因素间的交互作用；以酒精度为指标，因素主次顺序为A（菌株Y-5接种量）＞B（发酵温度）＞C（初始pH值），最优方案为A2B2C2；以VC含量为指标，因素主次顺序为B（发酵温度）＞C（初始pH值）＞A（酵母接种量），最优方案为B1C2A2；从表6和表7方差分析来看，初始pH值对VC含量影响不显著，从表5可见，以VC含量为指标，B因素1水平和2水平差别不大，另外B因素选择1水平（20℃）更有力于节约经济成本和能源消耗。因此，综合上述分析，确定正交试验的最优组合为A2B1C2，即最佳猕猴桃果酒生产工艺条件是菌株Y-5接种量8%，发酵温度20℃，初始pH值为3.5。采用该工艺条件发酵后的猕猴桃果酒呈微黄带绿色，果香、酒香浓郁优雅，酒精度为11.23%vol，VC含量为0.411 g/L，综合评价优于正交试验表中方案，因此确定猕猴桃百香果果酒工艺条件为A2B1C2。
3 结论
试验采用自然发酵法，将野生型菌株X-5诱变后，筛选出诱变菌株Y-5，性能优于野生型，发酵力、酒精度和VC含量分别比野生型高50.98%、11.15%和17.68%。以Y-5为发酵菌株，以VC含量和酒精度为指标，采用正交试验优化其发酵条件，并经过方差分析，得到最佳工艺条件为菌株Y-5接种量8%，发酵温度20℃，发酵初始pH值为3.5。试验诱变后的菌株Y-5发酵力高于野生型酵母，发酵后果酒的典型性强，具有一定的经济前景和推广价值。
[1]连政,黄圆博,贾佳林,等.不同采收期对软枣猕猴桃采后品质和细胞壁降解的影响[J].中国果树,2019(4):69-71.LIAN Zheng,HUANG Yuanbo,JIA Jialin,et al.Effects of different harvest time on postharvest quality and cell wall degradation of Actinidia argute[J].China Fruits,2019(4):69-71.
[2]张龙飞,陈梦颖,高雅,等.红心猕猴桃果肉饮料的生产工艺研究[J].美食研究,2019,36(2):67-71.ZHANG Longfei,CHEN Mengying,GAO Ya,et al.A study on pulp beverage technology of red heart kiwi fruit[J].Journal of Researches on Dietetic Science and Culture,2019,36(2):67-71.
[3]陈娟,唐俊妮,王文娟.三种猕猴桃酒发酵过程中挥发性香气成分的变化[J].食品工业科技,2019,40(3):242-248.CHEN Juan,TANG Junni,WANG Wenjuan.Changes of volatile aroma components of three cultivars of kiwifruit wines during fermentation process[J].Science and Technology of Food Industry,2019,40(3):242-248.
[4]张鑫,郭雨婷,孙时光,等.猕猴桃果酒发酵过程中色泽变化因素的相关性研究[J].食品研究与开发,2019,40(6):99-104.ZHANG Xin,GUO Yuting,SUN Shiguang,et al.Study on the correlationg of color change factors in kiwi wine fermentation production[J].Food Research and Development,2019,40(6):99-104.
[5]王圣开,董全.国内外果酒生产工艺的研究进展[J].中国食物与营养,2008,14(1):37-39.WANG Shengkai,DONG Quan.Research progress of fruit wine production technology at home and abroad[J].Food and Nutrition in China,2008,14(1):37-39.
[6]HEARD G M.Novel yeasts in winemaking-looking to the future[J].Food Australia,1999,51(7):347-352.
[7]李小坤,王旺,林影,等.常压室温等离子体(ARTP)诱变选育高核酸酿酒酵母[J].现代食品科技,2018,34(12):137-144,238.LI Xiaokun,WANG Wang,LIN Ying,et al.Screening of high-yield nucleic acid Saccharomyces cerevisiae strain by atmospheric and room-temperature plasma(ARTP)technique[J].Modern Food Science and Technology,2018,34(12):137-144,238.
[8]董弦弦,吴晓江,张钰龙,等.常压室温等离子体诱变选育产单宁酶炭黑曲霉及发酵参数优化[J].食品与发酵工业,2021,47(15):15-21.DONG Xianxian,WU Xiaojiang,ZHANG Yulong,et al.Breeding of tannase-producing Aspergillus carbonarius using ARTP mutagenesis and fermentation optimization[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(15):15-21.
[9]ZHANG K P,MOHSIN A,DAI Y C,et al.Combinatorial effect of ARTP mutagenesis and ribosome engineering on an industrial strain of Streptomyces albus S12 for enhanced biosynthesis of salinomycin[J].Frontiers in Bioengineering and Biotechnology,2019,7:212.
[10]鲁云风,刘智兴,张四普,等.猕猴桃生香酵母筛选鉴定及其发酵特性[J].河南农业科学,2021,50(8):166-173.LU Yunfeng,LIU Zhixing,ZHANG Sipu,et al.Screening,identification and fermentation properties of aroma producing yeast for kiwi fruit[J].Journal of Henan Agricultural Sciences,2021,50(8):166-173.
[11]郝瑶,王陶,李文,等.富硒猕猴桃果酒酵母的筛选及鉴定[J].食品科学,2014,35(21):175-179.HAO Yao,WANG Tao,LI Wen,et al.Screening and identification of yeast for production of wine from selenium-enriched kiwifruits[J].Food Science,2014,35(21):175-179.
[12]秦海彬,牛坤,王远山.产S-腺苷蛋氨酸酵母菌的诱变选育[J].食品与发酵工业,2020,46(21):23-27.QIN Haibin,NIU Kun,WANG Yuanshan.Breeding of S-adenosylmethionine-producing yeast by mutagenesis[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(21):23-27.
[13]周元,张强,傅虹飞,等.猕猴桃果酒酵母的筛选及发酵工艺优化[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2014,42(12):151-160.ZHOU Yuan,ZHANG Qiang,FU Hongfei,et al.Yeast screening and fermentation process optimization of kiwifruit wine[J].Journal of Northwest A&F University (Natural Science Edition),2014,42(12):151-160.
[14]刘阳,邓静,吴华昌,等.柑橘果皮中生香酵母的筛选及挥发性香气成分分析[J].食品安全质量检测学报,2014,5(12):4050-4055.LIU Yang,DENG Jing,WU Huachang,et al.Screening of yeast in Citrus peels and their volatile aromatic components analysis[J].Journal of Food Safety&Quality,2014,5(12):4050-4055.
[15]黄鑫,唐红梅,唐青莲,等.大头菜发酵过程中生香酵母的分离、筛选及鉴定[J].食品研究与开发,2019,40(18):198-203.HUANG Xin,TANG Hongmei,TANG Qinglian,et al.Isolation,screening and identification of key aroma-producing microorganisms in the process of kohrabi fermentation[J].Food Research and Development,2019,40(18):198-203.
[16]TANAKA K,KOYAMA M,PHAM P T,et al.Production of highconcentration bioethanol from cassava stem by repeated hydrolysis and intermittent yeast inoculation[J].International Biodeterioration&Biodegradation,2019,138:1-7.
[17]毕静莹,李华,王华.发酵温度对柑橘酒品质的影响[J].食品科学,2019,40(6):209-216.BI Jingying,LI Hua,WANG Hua.Effect of fermentation temperature on the sensory quality of Citrus wine[J].Food Science,2019,40(6):209-216.
[18]宋淑红.苹果酒酿造工艺的研究[J].食品安全导刊,2020(19):67-71.SONG Shuhong.Study on the brewing technology of apple wine[J].China Food Safety Magazine,2020(19):67-71.
[19]何晨,吉姆·哈迪,曾令文.水蜜桃酒的酿造工艺研究[J].食品科技,2017,42(8):109-114.HE Chen,Jim Hardie,ZENG Lingwen.The production of wine from peaches[J].Food Science and Technology,2017,42(8):109-114.
[20]刘沁源,吴祖芳,翁佩芳.水蜜桃酒速酿酵母菌的筛选、鉴定及发酵条件优化[J].核农学报,2020,34(7):1480-1490.LIU Qinyuan,WU Zufang,WENG Peifang.Screening,identification and optimization of fermentation conditions of yeast strains for rapid brewing of honey peach wines[J].Journal of Nuclear Agricultural Sciences,2020,34(7):1480-1490.