紫皮石斛（Dendrobium devonianum Paxt.）又名齿瓣石斛、紫皮兰[1]，具有益胃生津、润肺止咳、滋阴清热等功效[2]。云南龙陵是紫皮石斛的主要产地[3]，已成功申报注册了“龙陵紫皮石斛”地理标志、农产品地理标志和国家地理标志保护产品[4]。目前，已报道的紫皮石斛化学成分有多糖、生物碱、酚酸类、黄酮类等物质[5-6]。其中，石斛多糖在体外抗氧化方面显示出很大的潜力[7]。硒在治疗克山病、大骨节病，提高视力和防治肝坏死等方面具有特殊功效[8]，自然界中存在无机硒和有机硒两种形式，无机硒有蓄积性毒副作用和致突变毒性，有机硒则有显著的生物活性、吸收率高和毒性小，因此有机硒是较理想的补硒剂。其中，硒多糖具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、调节免疫力等多种生理活性，易吸收、副作用小，兼有硒和多糖[9-10]的生物活性，具有重要的研究意义。从紫皮石斛中提取多糖并进行硒化修饰，探索其生物活性，有望推动滇西地区紫皮石斛资源价值的充分开发。因此，本研究通过微波辅助法提取多糖，以亚硒酸钠为硒化剂，冰醋酸为催化剂对多糖进行硒化，并采用单因素和正交试验优化硒化工艺，同时比较了紫皮石斛多糖及硒多糖的抗氧化活性，为进一步研究紫皮石斛多糖及硒多糖作为药物和功能性食品的开发提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
紫皮石斛：云南省保山市龙陵县林源石斛开发有限公司；硒标准品（GNM-M261141-2013）：国家有色金属及电子材料分析测试中心；浓盐酸：重庆川东化工集团有限公司；浓硝酸：四川西陇科学有限公司；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）：美国阿拉丁工业公司；无水乙醇、冰醋酸、硫酸亚铁、水杨酸：天津市风船化学试剂科技有限公司；亚硒酸钠：山东西亚化学工业有限公司；没食子酸、抗坏血酸、间羟联苯、邻苯三酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：国药集团化学试剂有限公司。以上所用试剂均为分析纯。透析袋（MD44-5M，截留分子量：8 000 Da～14 000 Da）：美国联合碳化有限公司。
ICAP7400电感耦合等离子体发射光谱仪、Nicolet iS5傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared，FTIR）仪：赛默飞世尔科技有限公司；MARS6微波消解仪：美国CEM公司；UV-1800PC型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；G80F23CN3L-C2（C6）微波炉：广东格兰仕微波生活电器制造有限公司；DZF 602电热真空干燥箱：上海一恒科学仪器厂。
1.2 方法
1.2.1 紫皮石斛多糖的提取
紫皮石斛鲜条于真空干燥箱内60℃干燥72 h，粉碎过100目筛，称取5.00 g石斛粉末于500 mL烧杯中，按料液比1∶60（g/mL）加入300 mL纯水，置于微波炉内间歇加热2 min（350 W，每次加热30 s），然后60℃恒温水浴提取2 h。提取液趁热离心过滤（3 000 r/min，30 min），用温水洗涤残渣2次，取上层清液，于旋转蒸发仪（60℃）中浓缩至原体积的1/3，冷却至室温。再加入5倍体积的无水乙醇沉析，抽滤，滤渣用无水乙醇洗涤3次后60℃真空干燥48 h，得到紫皮石斛多糖提取物，命名为 DDP（Dendrobium devonianum Paxt.polysaccharide）。
1.2.2 紫皮石斛多糖的硒化
准确称取DDP粉末0.30g于50mL锥形瓶中，加入15mL 纯水溶解，按 1∶1.5（g/mL）加入冰乙酸，1∶1.5（g/g）加入亚硒酸钠，混合均匀后，于60℃水浴中反应24 h。反应结束后，将反应液装于透析袋中，纯水流动透析8 h，透析至加入抗坏血酸5 min透析液不呈现红色为止[11]。透析结束后，加入6倍无水乙醇于2℃下醇析12 h，真空干燥箱60℃干燥24 h，制备得到硒化紫皮石斛多糖[12-13]，命名为 Se-DDP（selenium Dendrobium devonianum Paxt.polysaccharide）。
1.2.3 单因素试验
按照1.2.2的方法，准确称取DDP 0.30 g于5只50 mL锥形瓶中，加入15 mL纯水溶解。固定DDP∶亚硒酸钠=1∶1.5（g/g），硒化温度 60 ℃，反应时间为 24 h，DDP∶冰乙酸=1∶1.5（g/mL），分别考察 DDP∶亚硒酸钠[1∶0.5、1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5（g/g）]，反应时间（6、12、24、36、48 h），反应温度 （40、50、60、70、80、90 ℃），DDP∶冰乙酸[1∶0.5、1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0、1∶3.5、1∶4.0（g/mL）]对多糖硒化的影响，每组试验重复 3次。
1.2.4 正交试验
以单因素试验结果为基础，进行铁皮石斛多糖硒化工艺的正交优化试验。以DDP∶亚硒酸钠（A）、反应温度（B）、DDP∶冰乙酸（C）进行L9（34）的正交试验，试验因素及水平见表1。
表1 正交因素水平
Table 1 Level of orthogonal factors
水平 因素A DDP∶亚硒酸钠/（g/g）B反应温度/℃C DDP∶冰乙酸/（g/mL）1 1∶1.0 70 1∶3.0 2 1∶1.5 80 1∶3.5 3 1∶2.0 90 1∶4.0
1.2.5 硒含量测定
1.2.5.1 Se-DDP的硝化
准确称取Se-DDP0.10g于干燥的聚四氟乙烯消解罐中，再加入5.0mL浓硝酸于100℃下预消解60 min。待无烟后取出置于通风橱内准确加入15.00 mL浓盐酸，按照表2中的条件进行消解，待微波消解仪上的温度降为80℃以下时，将消解罐取出置于通风橱内，冷却至室温后打开，此时溶液澄清，无沉淀，消解完全。将消解液过滤于50 mL容量瓶中，用少量纯水洗涤消解罐3次～4次，洗涤液全部转移入容量瓶中，纯水定容至刻度线，振荡摇匀，静置即为待测样溶液，以不加样品的消解液为空白对照。
表2 微波消解程序
Table 2 Microwave digestion program
温度/℃ 升温时间/min 保留时间/min 功率/W 130 15 10 750 150 15 10 750 180 15 10 750
1.2.5.2 电感耦合原子发射光谱 （inductively coupled plasma atomic emission spectrometer，ICP-AES）法测定条件
参照程庆龙等[14]的方法稍作修改，ICP-AES测定条件：输出功率为1 150 W，泵速50 r/min，辅助气流量0.5 L/min，雾化器气体流量0.5 L/min，样品冲洗时间20 s，短波范围 7 s。
1.2.5.3 硒标准曲线的绘制
分别移取 0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mL 100 μg/mL的硒标准溶液于 100 mL容量瓶中，用0.02%的稀硝酸稀释至刻度，摇匀。根据1.2.5.2的测定条件，用ICP-AES仪于196.026 nm下测定光强度。以硒浓度（X）为横坐标，光强度（Y）为纵坐标绘制标准曲线，方程为 Y=29.353X+0.981 8，r＝0.999 98。
1.2.5.4 样品硒含量的测定
取1.2.5.1中待测样溶液，按照1.2.5.3中方法测定光强度，依据硒标准曲线计算待测样溶液硒浓度。按式（1）计算样品硒含量。
式中：C为Se-DDP待测样溶液的硒浓度，μg/mL；V为Se-DDP待测样溶液体积，mL；m为Se-DDP的质量，g。
1.2.6 抗氧化活性测定
1.2.6.1 Se-DDP对DPPH自由基的清除能力测定
DPPH自由基是一种较稳定的以氮为中心的有机自由基，在517 nm处有最大吸收，且醇溶液呈紫色，当有抗氧化剂存在时，其与抗氧化剂进行反应导致颜色变浅，吸光度降低。并且吸光度的变化程度与清除DPPH自由基的程度呈定量关系，因此，可反映出样品的抗氧化活性[15]。
分别取 2 mL 浓度为 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL Se-DDP样品溶液（纯水配制）于5支比色管中，分别加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液（95%乙醇配制），振荡摇匀后，避光反应30 min，在517 nm波长下测其吸光度，并以纯水进行调零，每个浓度平行3次。并以相同浓度的抗坏血酸溶液和DDP溶液作对照。按式（2）计算DPPH自由基清除率。
式中：A空白为2 mL纯水+2 mL DPPH溶液的吸光度；A 样品为 2 mL Se-DDP（或 VC、DDP）+2 mL DPPH 溶液的吸光度；A 对照为 2 mL Se-DDP（或 VC、DDP）+2 mL 95%乙醇溶液的吸光度。
1.2.6.2 Se-DDP对OH自由基的清除能力测定
根据文献[16-17]方法，分别取2mL浓度为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL Se-DDP样品溶液（纯水配制）于5支比色管中，然后先加入2 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液，再加入6mmol/LH2O2溶液2mL，混匀后静置10min，然后加入2 mL新配制的6 mmol/L水杨酸乙醇溶液，在37℃下反应30 min后于510 nm波长处测其吸光度（纯水进行调零）。以抗坏血酸和DDP作为阳性对照组，平行3次，按照式（3）计算对OH自由基的清除率。
式中：A空白为2.0 mL纯水代替样品溶液的吸光度；A样品为样品组、阳性对照组的吸光度；A对照为2.0mL95%乙醇溶液代替6 mmoL/L水杨酸乙醇溶液的吸光度。
1.2.6.3 Se-DDP对O2-自由基的清除能力测定
采用邻苯三酚法[18-19]测定Se-DDP对超氧阴离子自由基的清除能力。分别取2 mL浓度为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL Se-DDP样品溶液（纯水配制）于5支比色管中，加入 4.2 mL Tris-HCl溶液（50 mmol/L，pH8.2），于30℃下预热20 min后，加入3 mL 7 mmol/L邻苯三酚溶液，反应5 min后迅速加入1 mL 10 mol/L的HCl溶液终止反应。以纯水进行仪器调零，反应液于320 nm处测吸光度。抗坏血酸和DDP作为阳性对照组，平行3次，按照式（4）计算清除率。
式中：A空白为2.0 mL纯水代替样品溶液的吸光度；A样品为样品组、阳性对照组的吸光度；A对照为2 mL纯水代替邻苯三酚的吸光度。
1.3 数据处理
采用SSPS22.0对单因素水平进行多重比较、正交试验设计和正交结果方差分析；采用Origin 2019进行绘图；试验均重复3次。
2 结果与分析
2.1 Se-DDP的红外光谱分析
DDP和Se-DDP的FTIR图谱见图1。
图1 DDP和Se-DDP的FTIR图谱
Fig.1 FTIR spectrogram of DDP and Se-DDP
由图1可知，硒化前后，DDP和Se-DDP的FTIR图谱有所变化，但变化不大，表明铁皮石斛多糖在硒化前后结构上没有较大的改变。其中Se-DDP的FTIR图谱中，3367.59cm-1为—OH的伸缩振动峰，2925.97cm-1～2 875.34 cm-1为糖类 CH3、CH2、CH 等 C—H 的伸缩振动峰，1 726.46 cm-1和1 646.91 cm-1为C=O的伸缩振动峰，1 371.14 cm-1和1 249.16 cm-1为C—H的变角振动峰，1 024.98 cm-1处是糖残基 C—O—C、C—O—H和O—Se—O键的伸缩振动峰[20]，在941.09cm-1和867.33cm-1为吡喃葡萄糖的特征吸收峰[16]，在1 054.87、808.03、768.01 cm-1处，Se-DDP 比 DDP 多出的峰为亚硒酸酯的特征吸收峰，因此可判断：DDP分子上发生了硒化反应，且硒以亚硒酸酯的形式存在[21]。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 亚硒酸钠用量对硒含量的影响
在反应温度60℃、反应时间24 h、DDP∶冰乙酸为1∶1.5（g/mL）的条件下，不同亚硒酸钠用量对紫皮石斛多糖硒化修饰的影响如图2所示。
图2 亚硒酸钠用量对硒含量的影响
Fig.2 Effect of sodium selenite on selenium content
小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由图2可知，当 DDP∶亚硒酸钠在 1∶0.5（g/g）～1∶1.5（g/g）时，随着亚硒酸钠用量的增加，Se-DDP 的硒含量也随之增加；但当 DDP∶亚硒酸钠在 1∶1.5（g/g）～1∶2.5（g/g）时，Se-DDP 的硒含量则随着亚硒酸钠用量的增加呈下降趋势。这说明硒多糖在1∶1.5（g/g）时，可能硒与多糖的键合已达到饱和，再增加亚硒酸钠的用量可能导致其平衡被破坏，从而导致硒含量下降。因此，DDP∶亚硒酸钠在 1∶1.5（g/g）为宜。
2.2.2 反应时间对硒含量的影响
不同反应时间对紫皮石斛多糖的硒化影响如图3所示。
图3 反应时间对硒含量的影响
Fig.3 Effect of time on selenium content
小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由图3可知，在反应温度为60℃，DDP∶亚硒酸钠为1∶1.5（g/g），DDP∶冰乙酸为 1.5∶1（g/mL）时，Se-DDP 的硒含量随反应时间的增加而增加。在开始的6 h～12 h时，硒含量增加不明显（P＞0.05），可能是反应时间太短导致反应不完全；反应时间从12 h～48 h，随着反应时间的延长，硒含量增加较快；当反应时间大于48 h时，硒含量基本达到饱和（5.18 mg/g），继续延长反应时间，硒含量无显著增加（P＞0.05），这与高玉杰等[8]的研究结果相似。本研究以硒化反应时间为48 h进行正交试验。
2.2.3 反应温度对硒含量的影响
反应温度对Se-DDP硒化修饰的影响如图4所示。
图4 反应温度对硒含量的影响
Fig.4 Effect of temperature on selenium content
小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由图4可知，随着反应温度的升高，Se-DDP的硒含量先增加后减小，反应温度为70℃～80℃时，硒含量增加不显著，基本达到饱和；当反应温度大于80℃，硒含量开始降低。这可能是由于紫皮石斛多糖在高温的酸性条件下发生了降解，影响硒化反应的进行[13]。因此，硒化反应温度在70℃～80℃为宜。
2.2.4 冰乙酸用量对硒含量的影响
冰乙酸的用量对Se-DDP硒化修饰的影响如图5所示。
图5 冰乙酸用量对硒含量的影响
Fig.5 Effect of iced acetic acid dosage on selenium content
小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由图5可知，当 DDP∶冰乙酸在 1∶0.5（g/mL）～1∶3.5（g/mL）时，随着冰乙酸用量的增加，Se-DDP 的硒含量不断增加，DDP∶冰乙酸为 1∶3.5（g/mL）时，硒含量达到最大值，为7.57 mg/g。但当继续增加冰乙酸用量时，Se-DDP的硒含量开始下降，这是因为反应体系的酸度过高，DDP会被降解，不利于硒化反应的进行，而冰乙酸用量过小又起不到最佳的催化作用，因此DDP∶冰乙酸在 1∶3.5（g/mL）为宜。
2.3 正交试验结果
正交试验结果及方差分析如表3、表4所示。
表3 正交试验结果
Table 3 Results of orthogonal test
试验号 A DDP∶亚硒酸钠 B反应温度 C DDP∶冰乙酸 硒含量/（mg/g）1 2 1 2 3.04 2 3 11.08 3 1 3 2 9.89 2 3 4 1 3.37 5 3 1 3 3.17 1 1 6 3 6.14 7 2 2 1 4.76 1 2 8 1 12.10 9 3 2 2 4.48 3 3 k1 6.47 3.19 6.74 k2 6.29 5.13 5.80 k3 6.58 11.02 6.80 R 0.87 23.49 2.98
表4 方差分析结果
Table 4 Results of variance analysis
注：* 表示差异显著，0.05＞P＞0.01，** 表示差异极显著，P＜0.01。
误差来源 平方和 df 均方 F P 显著性修正模型 101.818 6 16.970 16.312 0.059截距 374.165 1 374.165 359.654 0.003 **A 0.128 2 0.064 0.061 0.942 B 99.817 2 49.909 47.973 0.020 *C 1.873 2 0.937 0.900 0.526误差 2.081 2 1.040总计 478.064 9
由表3中k值可知，DDP的最佳硒化工艺条件为A3B3C3，即 DDP∶亚硒酸钠为 1∶2.0（g/g），反应温度为90 ℃，DDP∶冰乙酸为 1∶4.0（g/mL），反应时间为 48 h。在该条件下进行5次重复试验，得Se-DDP的硒含量的平均值为12.37 mg/g。由表中R值可知，对Se-DDP硒含量的影响大小顺序为B＞C＞A，与表4中的方差分析结果一致。
2.4 Se-DDP的抗氧化活性
2.4.1 DDP、VC、Se-DDP对DPPH自由基的清除能力
DDP、VC、Se-DDP对DPPH自由基的清除能力见图6。
图6 DDP、VC、Se-DDP对DPPH自由基的清除能力
Fig.6 Scavenging ability of DDP，VCand Se-DDP to DPPH·
小写字母不同表示差异显著，P＜0.05。
由图6可见，DDP、VC、Se-DDP对DPPH自由基的清除率与样品的浓度呈正相关。当DDP和Se-DDP浓度小于4 mg/mL时，DDP对DPPH自由基的清除效果比Se-DDP的好，而当浓度大于4 mg/mL时，Se-DDP对DPPH自由基的清除率高于DDP低于VC；当浓度为8 mg/mL时，Se-DDP对DPPH自由基的清除率为91.13%，与 VC无显著差异（P＞0.05）。程爽等[20]发现，冬凌草多糖和冬凌草硒多糖对DPPH自由基的清除能力随浓度的不断增加而逐渐增加，且硒多糖明显高于多糖的DPPH自由基清除能力，与本试验结果较为一致。
2.4.2 DDP、VC、Se-DDP对OH自由基的清除能力
DDP、VC、Se-DDP对OH自由基的清除能力见图7。
图7 DDP、VC、Se-DDP对OH自由基的清除能力
Fig.7 Scavenging ability of DDP，VCand Se-DDP to·OH
小写字母不同表示差异显著，P＜0.05。
从图7可知，当浓度小于1 mg/mL时，DDP和Se-DDP对OH自由基的清除能力差异不显著（P＞0.05），且小于VC；当浓度大于1 mg/mL时，Se-DDP清除OH自由基的能力显著高于 DDP（P＜0.05），表明SeO32-的引入对OH自由基有更显著的清除作用；当浓度为4 mg/mL～8 mg/mL时，Se-DDP清除OH自由基的能力与VC无显著差异（P＞0.05），均高于92%，并与硒化牡丹籽粕多糖对OH自由基的清除能力接近[17]。
2.4.3 DDP、VC、Se-DDP 对 O2-自由基的清除能力
DDP、VC、Se-DDP 对 O2-自由基的清除能力见图8。
图8 DDP、VC、Se-DDP对O2-自由基的清除能力
Fig.8 Scavenging ability of DDP，VCand Se-DDP to O2-·
小写字母不同表示差异显著，P＜0.05。
由图8可知，随着浓度的增加，DDP和Se-DDP对O2-自由基清除率也随之增加。当浓度小于4 mg/mL时，DDP对 O2-自由基清除率显著（P＜0.05）高于 Se-DDP，但低于VC；当浓度大于4 mg/mL时，Se-DDP对O2-自由基清除率高于DDP；当浓度为8 mg/mL时，Se-DDP对O2-自由基清除率达到93.97%，略高于VC（92.07%）。由此可见，在一定浓度下，硒化修饰后的Se-DDP具有更好的抗氧化活性。
3 结论
本研究以龙陵紫皮石斛鲜条为原料提取DDP，以亚硒酸钠为硒化剂、冰醋酸为催化剂，通过单因素和正交试验优化得到Se-DDP的最佳硒化工艺：DDP∶亚硒酸钠1∶2.0（g/g），反应温度 90 ℃，DDP∶冰乙酸 1∶4.0（g/mL），反应时间48 h，得Se-DDP的硒含量为12.37 mg/g。由红外光谱分析发现Se-DDP在1 054.87、808.03 cm-1和768.01 cm-1处有新的吸收峰，证明硒化产物结构中含有O—Se—O、Se
O键。Se-DDP的抗氧化试验结果表明，Se-DDP的抗氧化能力与浓度呈正相关，当浓度高于4 mg/mL时，Se-DDP对DPPH自由基、OH自由基和O2-自由基的清除能力均强于DDP。当浓度为8 mg/mL时，Se-DDP清除DPPH自由基、OH自由基和O2-自由基的能力与VC相当，高于90%。本研究为紫皮石斛多糖的研究提供了一定的试验依据和技术参考。
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