纤细裸藻（Euglena gracilis）是一类介于动物和植物之间的单细胞真核生物，属裸藻门裸藻属，无细胞壁[1]，广泛存在于自然界中。纤细裸藻中富含蛋白质、多种不饱和脂肪酸以及生育酚等59种人体所需的营养物质，是良好的天然膳食营养补充剂[2-4]。纤细裸藻多糖（Euglena gracilis polysaccharide，EGP）又称副淀粉，是纤细裸藻中特有的非淀粉黏性多糖，其含量可达50%～70%。纤细裸藻多糖在天然状态下呈现高度结晶，表面构造类似海绵，有无数细小的孔，且具有不消化性，可吸附体内有害物质并将其排出体外，因而具有清除重金属[5]、平衡肠道微环境[6]、调节血脂[7]、护肝[8]和抗氧化[9]等生理活性功能，另外还具有抗炎[10]、抗病毒[11]的功效。对于纤细裸藻多糖的研究，无论是国内还是国外都主要集中在对其活性功能及其机理的探究上，特别是关于提高免疫力、抗氧化、抗病毒等方面，但是对于纤细裸藻多糖的吸湿性、保湿性等理化性质的研究鲜有报道。
目前，多糖的提取方法主要有热水提取法[12]、酸碱提取法[13]、酶催化法[14]以及超声波辅助提取法[15]等，每种提取方法都有其自身的优越性和局限性，且不同的提取方式会在一定程度上改变多糖的分子结构和理化特性。十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）不但能够使纤细裸藻中的蛋白质发生变性，而且可以加速纤细裸藻多糖从细胞膜内释放。本试验以SDS为提取剂，利用超声波辅助法对纤细裸藻多糖进行提取，通过单因素试验分析和响应面试验优化设计，确定纤细裸藻多糖的最佳提取工艺条件，并对纤细裸藻多糖进行了吸湿性、保湿性分析，以期为纤细裸藻多糖在食品等相关行业中的开发和应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
纤细裸藻粉：上海光语生物科技有限公司；石油醚（分析纯）：天津北方天医化学试剂厂；浓硫酸（优级纯）：烟台远东精细化工有限公司；苯酚、氢氧化钠、葡萄糖、十二烷基硫酸钠（均为分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；丙三醇（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
UV-5100紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司；KQ-100DE数控超声波仪：昆山市超声仪器有限公司；TG16-WS台式高速离心机：湖南湘仪试验室仪器开发有限公司；Rapid N型快速定氮仪：艾力蒙塔贸易（上海）有限公司；LG-0.2真空冷冻干燥机：沈阳航天新阳速冻设备制造有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 纤细裸藻多糖的提取
根据文献[16]的方法对纤细裸藻多糖进行提取，并作如下修改：利用索氏提取法对纤细裸藻粉进行脱脂预处理。称取一定质量的脱脂纤细裸藻粉，将之悬浮在一定浓度和适当料液比的SDS溶液中，混合均匀，然后在一定的超声功率下处理一段时间，于6 000 r/min下离心10 min，去除上清液，再加入1.5 g/L的SDS溶液，在相同的转速下离心10 min，倒掉上清液，重复该操作2次，最后用蒸馏水反复洗涤，冷冻干燥得到纤细裸藻多糖。
1.3.2 纤细裸藻多糖含量测定
1.3.2.1 最大吸收波长的确定
移取100 μg/mL的葡萄糖标准溶液1 mL于10 mL离心管中，以1 mL蒸馏水作空白，室温下加入5%苯酚溶液1 mL、浓硫酸5 mL，迅速摇匀后，置于60℃水浴反应8 min。用紫外分光光度计在400 nm～600 nm波长范围内进行扫描，以确定最大波长。通过扫描结果可知其最大吸收峰值在490 nm处。
1.3.2.2 葡萄糖标准曲线的绘制
以1 mL蒸馏水为空白，分别移取浓度为0、20、40、60、80、100 μg/mL 的葡萄糖标准品溶液各 1 mL 加入10 mL离心管中，在每支离心管中依次加入5%苯酚溶液1 mL、浓硫酸5 mL后，迅速摇匀，置于60℃恒温水浴8 min，以冷水浴5 min终止反应，利用紫外分光光度计测定490 nm处的吸光度，以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度（A490）为纵坐标，绘制标准曲线。
1.3.2.3 纤细裸藻多糖得率的计算
参照1.3.2.2的步骤，利用苯酚-硫酸法[17]进行纤细裸藻多糖含量的测定。按以下公式计算纤细裸藻多糖得率。
式中：C为浓度，μg/mL；N为稀释倍数；V为样品溶液总体积，mL；M为原料质量，g。
1.3.3 单因素试验设计
1）SDS浓度：在超声功率100 W、超声时间20 min、料液比 1∶20（g/mL）的条件下，考察 SDS 浓度（5、10、15、20、25、30 g/L）对纤细裸藻多糖得率的影响。
2）料液比：在超声功率100 W、超声时间20 min、SDS 浓度为 10 g/L 的条件下，考察料液比[1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）]对纤细裸藻多糖得率的影响。
3）超声时间：在超声功率100W、SDS浓度为10g/L、料液比 1∶20（g/mL）的条件下，考察超声时间（5、10、15、20、25、30 min）对纤细裸藻多糖得率的影响。
4）超声功率：在超声时间20 min、SDS浓度10 g/L、料液比 1∶20（g/mL）的条件下，考察超声功率（60、80、100、120、140、160 W）对纤细裸藻多糖得率的影响。
1.3.4 响应面试验设计
在单因素试验的基础上，选取SDS浓度（A）、超声时间（B）、料液比（C）为自变量，以纤细裸藻多糖得率为响应值，根据Box-Behnken中心组合原理进行三因素三水平响应面优化试验设计，其因素水平见表1。
表1 Box-Behnken试验因素与水平
Table1 Factors and levels of Box-Behnken test
水平 因素A S D S浓度/（g/L）B超声时间/m i n C料液比/（g/m L）-1 1 0 1 0 1∶2 0 0 1 5 2 0 1∶2 5 1 2 0 3 0 1∶3 0
1.3.5 纤细裸藻多糖吸湿性及保湿性测定
1.3.5.1 吸湿性的测定
根据文献[18]的方法修改如下：将超声波辅助提取法得到的纤细裸藻多糖粉碎分散，干燥至质量恒定，以甘油为对照。分别称取上述多糖样品和甘油各0.300 0 g于培养皿中（敞口），（25±2）℃条件下，放置于装有硫酸铵饱和溶液（相对湿度81%）的干燥器中。分别在 4、8、12、16、24、32、36 h 时，称量样品质量，并根据下列公式计算吸湿性。
式中：Mn为不同时间段样品的质量，g；M0为样品的初始质量，g。
1.3.5.2 保湿性的测定
根据文献[19]的方法修改如下：准确称取0.300 0 g的多糖样品和甘油，分别加入0.2 g去离子水，混合均匀后置于2个洁净干燥的培养皿中，（25±2）℃条件下，放入装有微粉硅胶的干燥器，在放置时间为4、8、12、16、24、32、36 h 时，分别称量样品质量，并根据以下公式计算保湿性。
式中：Mx为不同时间段样品的质量，g；M1为含水样品的初始质量，g。
1.4 数据处理
每次试验做3个平行，利用Origin 2017、IBM SPSS以及Design-Expert 11进行作图和数据处理分析。
2 结果与分析
2.1 葡萄糖标准曲线
以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制得到的标准曲线见图1。
图1 葡萄糖的标准曲线及回归方程
Fig.1 Standard curve and regression equation of glucose
由图1可知，得到的线性回归方程为y=0.010 1x+0.0096，R2=0.9978，表明在质量浓度为0～100μg/mL时，葡萄糖标准溶液的质量浓度与吸光度线性关系良好。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 SDS浓度对纤细裸藻多糖得率的影响
SDS浓度对纤细裸藻多糖得率的影响见图2。
图2 SDS浓度对纤细裸藻多糖得率的影响
Fig.2 The effect of SDS concentration on the yield of Euglena gracilis polysaccharide
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图2可知，SDS浓度在5 g/L～15 g/L时，SDS浓度的增加会显著影响多糖得率，当SDS浓度大于15 g/L时，多糖得率趋于平稳。SDS浓度为15 g/L时，多糖得率最大，为32.56%。因此，选择SDS浓度为10、15、20 g/L进行后续试验。
2.2.2 料液比对纤细裸藻多糖得率的影响
料液比对纤细裸藻多糖得率的影响见图3。
图3 料液比对纤细裸藻多糖得率的影响
Fig.3 The effect of solid-liquid ratio on the yield of Euglena gracilis polysaccharide
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图3可知，随着溶剂体积的不断增大，纤细裸藻多糖得率逐渐上升，并在1∶25（g/mL）时达到最大值，为34.63%，当溶剂体积继续增大时多糖得率略有下降。因此，选择料液比为 1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）进行后续试验。
2.2.3 超声时间对纤细裸藻多糖得率的影响
超声时间对纤细裸藻多糖得率的影响见图4。
图4 超声时间对纤细裸藻多糖得率的影响
Fig.4 The effect of ultrasonic time on the yield of Euglena gracilis polysaccharide
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图4可知，在5 min～20 min内，随着超声时间的延长多糖得率逐渐提高，超声时间为20 min时多糖得率达到最大值，为29.39%，当超声时间大于20 min时，纤细裸藻多糖的得率逐渐下降。这可能是因为随着超声时间的延长反应体系的温度升高，温度过高会引起多糖分解。因此，选择超声时间为15、20、25 min进行后续试验。
2.2.4 超声功率对纤细裸藻多糖得率的影响
超声功率对纤细裸藻多糖得率的影响见图5。
图5 超声功率对纤细裸藻多糖得率的影响
Fig.5 The effect of ultrasonic power on the yield of Euglena gracilis polysaccharide
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图5可知，当超声功率为60 W～100 W时，纤细裸藻多糖得率随超声功率的增大逐渐升高，在超声功率为100 W时多糖得率达到最大值，为31.21%。但是当超声功率大于100 W时，得率整体开始下降并趋于平稳，这可能是超声功率达到一定程度后会破坏多糖结构，从而引起多糖得率下降。因此，超声功率选择100 W为佳。
2.3 响应面法优化提取工艺
2.3.1 响应面试验结果
响应面试验设计与结果见表2。
表2 响应面试验设计与结果
Table 2 Design and results of response surface methodology
试验号 A SDS浓度 B超声时间 C料液比 多糖得率/%1 0 1-1 31.67 2-1 -1 32.51 3 -1 0 -1 29.39 4 -1 -1 0 29.58 5 1-1 0 33.54 6 1 0-1 35.34 0 7 33.74 8 1 0 1 31.16 0 0 0 9 -1 1 0 30.68 10 0 -1 1 31.22 11 0 0 0 33.85 12 1 1 0 31.62 13 0 1 1 30.79 14 0 0 0 33.79 15 -1 0 1 31.64 16 0 0 0 34.42 17 0 0 0 34.51
利用Design-Expert 11软件对试验数据进行多元回归拟合，得到二次多项回归方程：Y=34.06+1.3A-0.2612B-0.5125C-0.7550AB-0.16AC+0.1025BC-1.19A2-1.52B2-0.993 5C2。
2.3.2 回归方程方差分析
回归方程方差分析结果见表3。
表3 回归方程方差分析
Table 3 Analysis of variance of regression equation
注：*表示差异显著（P＜0.05）；**表示差异极显著（P＜0.01）。
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值模型 50.80 9 5.64 63.26 ＜0.000 1**A 13.44 1 13.44 150.65 ＜0.000 1**B 0.546 0 1 0.546 0 6.12 0.042 6*C 2.10 1 2.10 23.55 0.001 9**AB 2.28 1 2.28 25.55 0.001 5**AC 10.34 1 10.34 115.84 ＜0.000 1**BC 0.042 0 1 0.042 0 0.4710 0.514 6 A2 5.92 1 5.92 66.37 ＜0.000 1**B2 9.74 1 9.74 109.17 ＜0.000 1**C2 4.16 1 4.16 46.58 0.000 2**残差 0.624 6 7 0.089 2失拟项 0.073 1 3 0.024 4 0.1768 0.906 9净误差 0.551 5 4 0.137 9总和 52.42 16
由表3可知，模型P＜0.01，说明模型极显著，失拟项P=0.906 9，不显著，说明模型拟合程度好[20]；相关系数R2=0.987 9，校正决定系数R2=0.972 2，说明模型可靠，可以用此模型对超声波辅助提取纤细裸藻多糖得率的工艺参数进行分析和预测。通过显著性检验可知，一次项B影响显著，交互项BC影响不显著，其他项均存在极显著性差异。各试验因素对指标的影响程度可由F值的大小体现，F值越大表明对试验指标影响越大[21]，因此各因素的影响大小顺序为A＞C＞B，即SDS浓度＞料液比＞超声时间。
通过回归模型分析可知，纤细裸藻多糖的最优提取条件为 SDS 浓度 19.71 g/L，料液比 1∶20.11（g/mL），超声时间17.07 min；在此工艺下纤细裸藻多糖的得率为35.45%。结合实际的试验操作条件，将最优工艺参数调整为 SDS 浓度 20 g/L，料液比 1∶20（g/mL），超声时间17 min，进行试验验证，所得多糖的得率为35.28%，与预测值的相对误差为0.17%，说明通过响应面法可以对纤细裸藻多糖的提取工艺进行回归分析和优化，具有一定的参考价值。
2.3.3 各因素之间交互作用
SDS浓度、超声时间、料液比的两两交互作用对多糖得率的影响见图6～图8。
图6 SDS浓度和超声时间交互作用对纤细裸藻多糖得率的影响
Fig.6 Effect of the interaction of SDS concentration and ultrasound time on the yield of Euglena gracilis polysaccharides
图7 SDS浓度和料液比交互作用对纤细裸藻多糖得率的影响
Fig.7 Effect of the interaction of SDS concentration and solidliquid ratio on the yield of Euglena gracilis polysaccharides
图8 超声时间和料液比交互作用对纤细裸藻多糖得率的影响
Fig.8 Effect of the interaction of ultrasound time and solidliquid ratio on the yield of Euglena gracilis polysaccharides
由图6～图7可知，SDS浓度（A）和超声时间（B）两个因素交互作用的等高线接近椭圆，响应面坡度较陡峭，因此对纤细裸藻多糖得率影响显著；SDS浓度（A）和料液比（C）交互作用的响应面坡度较陡峭，等高线呈椭圆形，表明这两种因素的交互作用影响显著，与方差分析结果一致。
2.4 吸湿性及保湿性分析
2.4.1 吸湿性
纤细裸藻多糖样品和甘油的吸湿性结果见图9。
图9 纤细裸藻多糖样品和甘油的吸湿性
Fig.9 Moisture absorption capacities of Euglena gracilis polysaccharide samples and glycerine
同一时间下不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图9可知，纤细裸藻多糖样品的吸湿性在0～12h随时间延长迅速上升，之后逐渐趋于平稳，并在24 h时达到饱和状态。EGP在饱和状态下的吸湿性为19.07%，可达到甘油饱和状态下吸湿性的70.32%。
2.4.2 保湿性
纤细裸藻多糖样品和甘油的保湿性结果见图10。
图10 纤细裸藻多糖样品和甘油的保湿性
Fig.10 Moisture retention capacities of Euglena gracilis polysaccharide samples and glycerine
同一时间下不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图10可知，在微粉硅胶环境中，纤细裸藻多糖样品和甘油在0～24 h的保湿性均持续下降，之后下降的趋势逐渐趋于平稳。在32 h达到平衡状态，此时纤细裸藻多糖的保湿性为46.16%，甘油的保湿性为68.45%，说明纤细裸藻多糖具有良好的保湿性。
3 结论
本试验采用超声波辅助提取法对纤细裸藻中的多糖进行提取，首先通过单因素试验确定关键的影响因素，再进一步通过响应面法优化纤细裸藻多糖的提取工艺条件。结果表明，各因素对纤细裸藻多糖得率的影响大小为SDS浓度＞料液比＞超声时间。纤细裸藻多糖的最佳提取工艺条件为SDS浓度20 g/L，料液比1∶20（g/mL），超声时间 17 min，在此条件下多糖得率为35.28%。另外，通过该方法提取得到的纤细裸藻多糖具有良好的吸湿性、保湿性，本试验为进一步深入研究提取纤细裸藻多糖提供了依据。
[1]彭文琴.不同碳源和光照周期对三种微藻生长及油脂积累的影响[D].南昌:南昌大学,2012.PENG Wenqin.Effects of different carbon sources and photoperiod on the growth and the lipid accumulation of three kinds of microal-gae[D].Nanchang:Nanchang University,2012.
[2]SCHWARZHANS J P,CHOLEWA D,GRIMM P,et al.Dependency of the fatty acid composition of Euglena gracilis on growth phase and culture conditions[J].Journal of Applied Phycology,2015,27(4):1389-1399.
[3]HAQUE F,BANAYAN S,YEE J,et al.Extraction and applications of cyanotoxins and other cyanobacterial secondary metabolites[J].Chemosphere,2017,183:164-175.
[4]GRIMM P,RISSE J M,CHOLEWA D,et al.Applicability of Euglena gracilis for biorefineries demonstrated by the production of α-tocopherol and paramylon followed by anaerobic digestion[J].Journal of Biotechnology,2015,215:72-79.
[5]张彦慧,张文慧,姜智飞,等.5种抗生素对纤细裸藻蛋白含量的影响[J].河北渔业,2017(8):13-17.ZHANG Yanhui,ZHANG Wenhui,JIANG Zhifei,et al.Response of protein levels of Euglena gracilis to five kinds of antibiotic stress[J].Hebei Fisheries,2017(8):13-17.
[6]SIMON R R,VO T D,LEVINE R.Genotoxicity and subchronic toxicity evaluation of dried Euglena gracilis ATCC PTA-123017[J].Regulatory Toxicology and Pharmacology,2016,80:71-81.
[7]KUDA T,ENOMOTO T,YANO T.Effects of two storage β-1,3-glucans,laminaran from Eicenia bicyclis and paramylon from Euglena gracili,on cecal environment and plasma lipid levels in rats[J].Journal of Functional Foods,2009,1(4):399-404.
[8]KUSMIC C,BARSANTI L,DI LASCIO N,et al.Anti-fibrotic effect of paramylon nanofibers from the WZSL mutant of Euglena gracilis on liver damage induced by CCl4in mice[J].Journal of Functional Foods,2018,46:538-545.
[9]葛智超,李燕,施文正,等.裸藻多糖提取工艺优化及抗氧化活性研究[J].食品与机械,2020,36(1):186-191.GE Zhichao,LI Yan,SHI Wenzheng,et al.Optimization of the extraction process of polysaccharides from Euglena and its antioxidant activity[J].Food&Machinery,2020,36(1):186-191.
[10]RUSSO R,BARSANTI L,EVANGELISTA V,et al.Euglena gracilis paramylon activates human lymphocytes by upregulating pro-inflammatory factors[J].Food Science&Nutrition,2017,5(2):205-214.
[11]NAKASHIMA A,SUZUKI K,ASAYAMA Y,et al.Oral administration of Euglena gracilis Z and its carbohydrate storage substance provides survival protection against influenza virus infection in mice[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2017,494(1-2):379-383.
[12]WANG Y G,WANG X J,ZHANG K,et al.Extraction kinetics,thermodynamics,rheological properties and anti-BVDV activity of the hot water assisted extraction of Glycyrrhiza polysaccharide[J].Food&Function,2020,11(5):4067-4080.
[13]陆伊俏,池海波,厉桂宁,等.可口革囊星虫体腔液多糖碱提工艺优化及其抗氧化性研究[J].食品工业科技,2021,42(19):204-210.LU Yiqiao,CHI Haibo,LI Guining,et al.Study on alkaline extraction process optimization of polysaccharides from coelomic fluid of phasolosma esculenta and its antioxidant activity in vitro[J].Science and Technology of Food Industry,2021,42(19):204-210.
[14]周美,万科,马风伟,等.响应面法优化白及多糖酶解工艺及其抗氧化、免疫活性研究[J].食品研究与开发,2020,41(10):128-135.ZHOU Mei,WAN Ke,MA Fengwei,et al.Response surface methodology for optimization of enzymatic hydrolysis on Bletilla striata(Thunb.)Reiehb.f polysaccharides and antioxidant, in vitro immunostimulatory activities analysis[J].Food Research and Development,2020,41(10):128-135.
[15]曹丹,孙于寒,彭浩,等.均匀设计法优化灰树花多糖超声波辅助提取工艺及其抗氧化活性分析[J].食品研究与开发,2021,42(5):113-118.CAO Dan,SUN Yuhan,PENG Hao,et al.Optimization of ultrasonic-assisted extraction process of polysaccharides from Grifola frondosa by uniform design and its antioxidant activity analysis[J].Food Research and Development,2021,42(5):113-118.
[16]鞠海军.裸藻多糖分离提取、结构鉴定及生物活性研究[D].上海:华东理工大学,2020.JU Haijun.Separation,structure identification of paramylon and study on its bioactivities[D].Shanghai:East China University of Science and Technology,2020.
[17]王彦平,娄芳慧,陈月英,等.苯酚-硫酸法测定紫山药多糖含量的条件优化[J].食品研究与开发,2021,42(4):170-174.WANG Yanping,LOU Fanghui,CHEN Yueying,et al.Optimization of analytical conditions for the determination of polysaccharides contents in purple yam by phenol-sulfuric acid method[J].Food Research and Development,2021,42(4):170-174.
[18]LI J X,CHI Z,YU L J,et al.Sulfated modification,characterization,and antioxidant and moisture absorption/retention activities of a soluble neutral polysaccharide from Enteromorpha prolifera[J].International Journal of Biological Macromolecules,2017,105:1544-1553.
[19]LIN C,CUI H P,WANG X J,et al.Regulating water binding capacity and improving porous carbohydrate matrix's humectant and moisture proof functions by mixture of sucrose ester and Polygonatum sibiricum polysaccharide[J].International Journal of Biological Macromolecules,2020,147:667-674.
[20]马伟,尹莉芳,周建平,等.Box-Behnken中心组合设计优化甘草酸二铵缓释片的处方[J].中草药,2008,39(10):1486-1490.MA Wei,YIN Lifang,ZHOU Jianping,et al.Optimized formulation of diammonium glycyrrhizinate sustained-release tablet by Box-Behnken design[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs,2008,39(10):1486-1490.
[21]SUH M H,LEE K B,BAICK S C.Optimization of the spreadable modified butter manufacturing by response surface methodology[J].Korean Journal for Food Science of Animal Resources,2012,32(6):783-788.