睡眠是人类正常的生理活动，除了可以消除疲劳，使人产生新的活力外，还与提高免疫力、抵抗疾病的能力有着密切的关系。睡眠障碍通常与身心疾病相关，会造成疲劳、精神疾病，如抑郁症等，甚至引起认知功能障碍，导致生活质量下降[1]，睡眠障碍还可能会对心脏功能、免疫功能和血糖调节产生负面影响[2]。研究发现，睡眠障碍会对生殖系统造成一定的影响，可能会造成月经不调、不孕等[3-4]。西医主要依靠化学类药物进行治疗，如抗抑郁药、巴比妥类药物等[5]，虽然有一定疗效，但成瘾性高，依赖性强，长期服用还会产生一定的耐药性或不良反应。
蜂王浆是由蜂群中的哺育工蜂的上颚腺等腺体分泌的乳白色或淡黄色乳状液体，是蜂王幼虫整个发育期和雄蜂幼虫前期的唯一食物。蜂王浆略带甜、酸、涩、辛辣味，并具有特殊香气[6]，其成分非常复杂，且与蜂种、蜜源、产地、季节等因素相关[7-8]。许多研究表明，蜂王浆具有包括促进睡眠[9-10]、增强免疫力[11-12]、延缓衰老[13]、修复细胞和组织损伤[14-16]、抗氧化[17]、调节心血管系统[18]等在内的多种功能活性。有研究推测[9，19]，蜂王浆中的主要活性成分可能包括脂类物质如10-羟基-2-癸烯酸、蛋白类物质如蜂王浆主蛋白（major royal jelly proteins，MRJPs）以及小分子类物质，如维生素、氨基酸等。在MRJPs中，已发现有9种不同的组分，命名为MRJP1～MRJP9，其中分子量为55 kDa左右的MRJP1，含量最高且被认为具有良好的功能活性[20-22]。
对氯苯丙氨酸，又称芬克洛宁，是色氨酸羟化酶（tryptophan-hydroxylase，TDH）的选择性和不可逆抑制剂[23]，而 TDH 是 5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）合成的限速酶。因此，对氯苯丙氨酸通过抑制色氨酸羟基化而阻断5-HT的合成，可显著降低脑内和血液中的5-HT浓度，从而引发失眠。对氯苯丙氨酸多用于动物失眠模型的建立，并被广泛用于5-HT及其与其他神经递质之间关系的研究[24]。本文以蜂王浆为原料，通过超滤透析、真空冷冻干燥、甲醇-二氯甲烷提取法等方法提取蜂王浆粗蛋白、蛋白类功能因子和脂类功能因子，并通过对氯苯丙氨酸构建失眠小鼠模型，结合睡眠实验及脑组织和血液中神经递质变化，探究蜂王浆及其功能组分提取物对小鼠睡眠质量的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 实验动物
SPF级KM小鼠（4周龄，雄性，156只，体质量16 g～20 g）：湖南斯莱克景达有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（湘）2020-0006。
1.1.2 原料与试剂
蜂王浆原浆、江西汪氏蜜蜂园有限公司；褪黑素：汤臣倍健股份有限公司；苯巴比妥钠：上海上药新亚药业有限公司；对氯苯丙氨酸（4-chloro-DL-phenylalanine，PCPA）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；10-羟基-2-癸烯酸标准品、对羟基苯甲酸甲酯标准品、透析膜（8 000 Da～14 000 Da）：上海源叶生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）片剂：生工生物工程（上海）股份有限公司；甲醇（色谱纯）：德国Merck公司；无水乙醇（优级纯）：西陇科学股份有限公司；超滤管（截留分子量30 kDa）：美国Millipore公司；酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）测定试剂盒：武汉Elabscience生物科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
ME204TE/02电子天平：瑞士Mettler Toledo公司；LYNX4000高速离心机、ST16R高速离心机：美国Thermo Fisher Scientific公司；SHB-Ⅲ循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；PowerPac基础电泳仪：美国Bio-Rad公司；e2695高效液相色谱仪：美国Waters科技有限公司；1260高效液相色谱仪：美国Agilent科技有限公司；FreeZone真空冷冻干燥机：美国Labconco公司；N1300旋转蒸发仪：东京理化器械株式会社；spectraMAX190全自动酶标仪：美国Molecular Devices公司。
1.3 方法
1.3.1 蜂王浆中粗蛋白的提取
将蜂王浆原液按料液比1∶9（g/mL）溶于PBS中，在4℃条件下搅拌24 h后于12 000 r/min离心30 min，去除全部上清液，用截留分子量8 000 Da～14 000 Da的透析膜透析24 h后，通过真空冷冻干燥得粗蛋白提取物，使用BCA试剂盒测定提取物的蛋白质浓度，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法测定蛋白质组成及分子量范围。
1.3.2 蜂王浆中蛋白类功能因子的提取
试验方案参考文献[25]，通过超滤透析、冷冻干燥得蛋白类功能因子提取物。使用BCA试剂盒测定提取物的蛋白质浓度，并采用凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）法和SDS-PAGE法测定蛋白质组成及分子量范围。
1.3.3 蜂王浆中脂类功能因子的提取
参照文献[26]的方法，采用二氯甲烷-甲醇法制备得到脂类功能因子提取物。参照国家标准GB 9697—2008《蜂王浆》，通过高效液相色谱法测定提取物中10-羟基-2-癸烯酸（10-hydroxy-2-decenoic acid，10-HDA）含量。
1.3.4 动物实验设计
动物实验参照已有研究[27-29]进行优化，所有雄性昆明小鼠在标准条件下（温度20°C～26°C，相对湿度40%～70%，白天与黑夜每12 h为一个循环）适应1周后，开始正式实验。所有的小鼠随机分为13组，每组12只，即空白组（B）、PCPA模型组（M）、褪黑素对照组（ME）、蜂王浆组（RJ）、粗蛋白提取物的低/中/高剂量组（CL/CM/CH）、蛋白类功能因子提取物的低/中/高剂量组（PL/PM/PH）及脂类功能因子提取物的低/中/高剂量组（AL/AM/AH），动物实验设计如图1所示。
图1 动物实验设计
Fig.1 Animal experiment design
实验期间小鼠可自由饮水摄食，第1天～2天，除空白组外所有小鼠每天腹腔注射300 mg/kg用弱碱性（pH8.0）生理盐水配制的PCPA溶液[27]，连续注射2 d，建立失眠小鼠模型；然后对除空白组外所有小鼠继续腹腔注射100 mg/kg PCPA溶液，连续2 d，巩固失眠小鼠造模效果，空白组腹腔注射等体积弱碱性生理盐水。
实验第3天～7天，对除空白组和PCPA模型组外所有小鼠进行灌胃干预，每天1次。褪黑素对照组和蜂王浆组参照70 kg体质量的成年人每日最佳摄入量换算，褪黑素对照组（ME）小鼠灌胃0.39 mg/kg的褪黑素，蜂王浆组（RJ）小鼠灌胃637 mg/kg的蜂王浆原浆（相当于体质量70 kg成年人每日摄取4.9 g蜂王浆）；粗蛋白提取物的低/中/高剂量组（CL/CM/CH）小鼠分别灌胃60、120、240 mg/kg的粗蛋白提取物，蛋白类功能因子的低/中/高剂量3组（PL/PM/PH）小鼠分别灌胃44、88、176 mg/kg的蛋白类功能因子，脂类功能因子的低/中/高剂量组（AL/AM/AH）小鼠分别灌胃 13.1、26.2、52.4 mg/kg的脂类功能因子，灌胃体积为每10 g小鼠体质量灌胃100 μL，空白组与PCPA模型组小鼠则每天灌胃等体积的蒸馏水。全程监控记录小鼠的体质量及精神状态变化。实验结束后，收集所有小鼠血清、脑组织及肝组织，于-80℃保存备用。同时，称取小鼠脑及肝组织质量，通过其与小鼠体质量的比值计算器官指数。
1.3.5 检测指标
1.3.5.1 改善睡眠实验
实验根据已有研究[30]的方法，稍有改动，具体如下：所有实验均在温度适宜、安静环境下进行。小鼠末次灌胃30 min后给各组小鼠腹腔注射苯巴比妥钠，将苯巴比妥钠注射后至翻正反射消失的时间记为小鼠睡眠潜伏期，并以翻正反射消失至再次出现的时间记为小鼠睡眠时长，观察各组小鼠睡眠潜伏期及睡眠时长的差异。
1.3.5.2 生化指标检测
采用相应ELISA试剂盒，根据说明书，分别测定血清中5-HT、多巴胺（dopamine，DA）以及脑组织中去甲状腺肾上腺素（norepinephrine，NE）浓度。
1.4 数据分析
试验数据分析采用GraphPad Prism软件及双尾T检验方法，若p值小于0.05则认为数据差异具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 蜂王浆粗蛋白、蛋白类功能因子及脂类功能因子提取物含量及分子量
本试验获得的蜂王浆粗蛋白中蛋白质的相对含量约为79.42%，其中以分子量为50 kDa～60 kDa及35 kDa～45 kDa的蛋白质组分为主。蛋白类功能因子提取物中分子量为50 kDa～60 kDa组分的相对含量为93.08%。脂类功能因子提取物中10-HDA的相对含量为43.85%。
2.2 小鼠体质量增长率
实验过程中小鼠体质量变化见图2。
图2 小鼠实验中的体质量增长率
Fig.2 Body weight growth in mouse experiments
a.蜂王浆组及褪黑素对照组；b.低/中/高剂量的粗蛋白提取物组；c.低/中/高剂量的蛋白类功能因子组；d.低/中/高剂量的脂类功能因子组。
如图2所示，所有小鼠体质量在整个实验过程中均有不同程度的增加，其中PCPA模型组比空白组小鼠的体质量增长率低，粗蛋白提取物高剂量及脂类功能因子低剂量组小鼠的体质量增长率趋近于空白组。小鼠体质量增长率结果表明，PCPA给药造模后的小鼠出现了体质量增长减缓的趋势，但无显著性差异，说明本实验PCPA造模可以模拟中轻度的失眠体征。
2.3 小鼠器官指数
小鼠脑组织及肝脏的器官指数见图3。
图3 小鼠的脑器官指数和肝器官指数
Fig.3 Brain organ index and liver organ index in mice
如图3所示，与空白组比较，PCPA模型组小鼠的脑、肝脏器官指数均有所增加；脂类功能因子低剂量组小鼠脑、肝脏器官指数相比模型组均有所减少，趋近于空白组。小鼠器官指数结果表明，PCPA造模之后的小鼠出现了各器官指数上升的趋势，但无明显差异，说明本实验PCPA造模未造成小鼠明显器质性病变；蜂王浆及其各提取物组分对失眠小鼠器官指数上升表现出恢复的趋势，说明了蜂王浆及其各提取物组分的安全性。
2.4 改善睡眠实验
2.4.1 各组小鼠睡眠潜伏期时间
各组小鼠睡眠潜伏期时间见图4。
图4 各组小鼠的睡眠潜伏期时间
Fig.4 Sleep latency of mice in each group
与空白组相比，##表示差异极显著（p<0.01）；与模型组相比，*表示差异显著（p<0.05），**表示差异极显著（p<0.01），***表示差异高度显著（p<0.001）。
如图4所示，PCPA模型组小鼠睡眠潜伏期时间相较于空白组有极显著性差异（p<0.01），说明PCPA建立小鼠失眠模型成功。除蛋白类功能因子低剂量组外，其他组小鼠的睡眠潜伏期都显著短于PCPA模型组，其中蜂王浆组、粗蛋白低剂量组和脂类高剂量组小鼠的睡眠潜伏期相比其它干预组更短，与模型组相比，差异高度显著（p<0.001）。蛋白类功能因子及脂类功能因子组小鼠的睡眠潜伏期随着干预剂量的增加表现出递减的趋势。
2.4.2 各组小鼠睡眠时间
各组小鼠睡眠时间见图5。
图5 各组小鼠睡眠时间
Fig.5 Sleep duration of mice in each group
如图5所示，与空白组比较，PCPA模型组小鼠的平均睡眠时间减少；蜂王浆组小鼠的平均睡眠时间得到恢复，并且脂类功能因子组小鼠的平均睡眠时间相比模型组和其他干预组更长，趋近于褪黑素的效果。
2.5 蜂王浆及其提取物对PCPA致失眠小鼠神经递质的影响
2.5.1 5-羟色胺（5-HT）
各组小鼠血清中5-HT的浓度见图6。
图6 各组小鼠血清中5-HT含量
Fig.6 Content of 5-hydroxytryptamine(5-HT)in serum of mice in each group
与空白组相比，##表示差异极显著（p<0.01）；与模型组相比，*表示差异显著（p<0.05），**表示差异极显著（p<0.01），***表示差异高度显著（p<0.001）。
如图6所示，与空白组相比，PCPA模型组小鼠血清中5-HT浓度极显著下降（p<0.01）。5-HT是重要的脑内单胺类递质，与认知功能、机体的睡眠和疲劳密切相关[31-32]，随着睡眠剥夺时间延长，进入脑内的色氨酸增加，5-HT合成也增加，脑内5-HT浓度升高，机体会出现疲劳感和睡意[33]。本实验结果验证了PCPA作为色氨酸羟化酶抑制剂，能够阻断5-HT的合成，进而导致小鼠单胺类神经递质紊乱，引起失眠。
经过蜂王浆及不同剂量的不同蜂王浆组分干预后，5-HT浓度均有明显提高。其中，粗蛋白提取物的低、中剂量，蛋白类功能因子高剂量以及脂类功能因子组小鼠血清中5-HT浓度相对较高（p<0.001）；表明蜂王浆及其提取物可通过调节小鼠血清中5-HT浓度，从而达到改善睡眠的作用。
综上实验结果发现，脂类功能因子提取物相比于粗蛋白提取物和蛋白类功能因子提取物，对失眠小鼠的睡眠潜伏期时间、睡眠时间及血清中5-HT浓度的改善效果相对更好。除了5-HT，去甲肾上腺素（NE）和多巴胺（DA）也是与调节睡眠相关的重要神经递质，因而后续通过脑组织中NE和血清中DA的浓度变化，进一步探讨蜂王浆改善睡眠的物质基础。
2.5.2 去甲肾上腺素（NE）
各组小鼠脑组织中NE的浓度见图7。
图7 各组小鼠脑组织中NE浓度
Fig.7 Content of norepinephrine(NE)in brain tissue of mice in each group
与空白组相比，#表示差异显著（p<0.05）；与模型组相比，*表示差异显著（p<0.05）。
如图7所示，PCPA模型组小鼠脑组织NE浓度较空白组显著上升（p<0.05）。NE负责神经元之间的沟通，并在注意力、情绪、睡眠等方面扮演重要角色，NE增加可获得食物能量储存，并能提高大脑的醒觉度[34-35]。蜂王浆组及脂类功能因子提取物均可下调小鼠脑组织NE的平均浓度，趋近于空白组，特别是低剂量脂类功能因子的效果最为显著（p<0.05）。
2.5.3 多巴胺（DA）
各组小鼠血清中DA的浓度见图8。
图8 各组小鼠血清中DA含量
Fig.8 Content of dopamine(DA)in serum of mice in each group
与空白组相比，###表示差异高度显著（p<0.001）；与模型组相比，*表示差异显著（p<0.05），**表示差异极显著（p<0.01），***表示差异高度显著（p<0.001）。
如图8所示，PCPA模型组小鼠血清DA浓度较空白组高度显著降低（p<0.001），DA是第一个被验证在中枢疲劳中起作用的神经递质。研究证实，PCPA可能会导致血清中的DA显著降低[36]，并且血清DA缺乏可能与血清素缺乏有关的情绪问题发生率呈正相关[37]。经蜂王浆干预后小鼠血清DA浓度得到极显著恢复（p<0.01），脂类功能因子提取物低、中、高剂量均能显著提高小鼠血清DA浓度，并且呈现出剂量依赖的趋势。
3 结论
本研究采用腹腔注射PCPA构建睡眠剥夺小鼠模型，研究蜂王浆及其蛋白、脂质提取物对睡眠潜伏期、睡眠时间及神经递质水平的调节作用。结果显示，蜂王浆原浆、粗蛋白组分、蛋白类功能因子组分及脂类功能因子组分能够显著缩短失眠小鼠睡眠潜伏期，上调5-羟色胺浓度。同时，脂类功能因子干预对小鼠睡眠时间的延长效果最好，并且脂类功能因子干预还能明显改善DA及NE浓度异常，对小鼠失眠相关的神经递质紊乱具有更好的改善作用。
综上所述，蜂王浆中发挥促睡眠作用的主要功效成分可能为脂类提取物，蛋白类功能因子能够发挥一定的协同作用。该研究结果为蜂王浆及其提取物在改善睡眠的作用机制及其应用提供参考依据。
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