沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌，种类繁多，目前已检测出2 500多种沙门氏菌血清型[1-2]。沙门氏菌归于肠杆菌科沙门氏菌属，分为6个亚属[3]，是革兰氏阴性短小杆菌，无荚膜，无芽胞，多数有鞭毛，有动力。引起食物中毒最常见的沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌等[4-5]，可导致肠热症、慢性肠炎、食物中毒等。沙门氏菌的传播媒介多为肉、蛋、乳类食品。根据欧洲食品安全局（European Food Safety Agency，EFSA）统计，欧洲每年有超过10万例的人类沙门氏菌病[6-7]。沙门氏菌是细菌性食物中毒中最常见的致病菌[8-9]。因此沙门氏菌检测具有重要的卫生安全意义。
速冻调制食品是指以谷物或豆类或薯类及其制品、畜禽肉及其制品、水产品及其制品、植物蛋白及其制品、果蔬及其制品、蛋及其制品、食用菌及其制品等为主要原料，配以辅料（含食品添加剂），经调味制作加工，采用速冻工艺（产品热中心温度≤-18℃），在低温状态下贮存、运输和销售的预包装食品，可分为花色面米制品、裹面制品、调味水产品、肉糜类制品、菜肴制品、汤料制品等[10]。速冻调制食品品种繁多，基质复杂，尤其是生制速冻调制食品，未经高温或其他杀菌处理，存在大量非沙门氏菌属杂菌，对沙门氏菌分离和鉴定造成一定难度。传统检验方法操作繁琐，受到检测人员自身影响很大，倘若检测人员经验不足，容易造成假阴性结果[11-12]。因此，选择性平板分离和初筛试验对目标菌和干扰菌的准确判断，是整个检测过程中的关键环节。为提高速冻调制食品中沙门氏菌的检验能力和准确度，本文对速冻调制食品中沙门氏菌及其干扰菌进行分离和鉴定，有助于分析其污染情况，为企业生产加工过程食源性致病菌的来源与控制、日常检测提供参考和借鉴。
1 材料与方法
1.1 标准菌株
甲型副伤寒沙门氏菌CMCC（B）50093：广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心。
1.2 培养基和试剂
氯化钠（分析纯）：西陇科学股份有限公司；缓冲蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）、四硫磺酸钠煌绿增菌液（tetrathionate broth base，TTB）、亚硒酸盐胱氨酸增菌液（selenite cystine broth，SC）、亚硫酸铋琼脂（bismuth sulfite agar，BS）、沙门氏菌显色培养基、三糖铁琼脂（triple sugar iron agar，TSI）、赖氨酸脱羧酶生化鉴定试剂盒、氨基酸脱羧酶对照生化鉴定试剂盒、营养琼脂培养基（nutrient agar，NA）：广东环凯微生物科技有限公司；革兰氏阴性杆菌鉴定（gram-negative identification card，GN）卡：生物梅里埃公司。
1.3 仪器和设备
HVA-85高压灭菌锅：日本HIRAYAMA公司；GHP-9160隔水式恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；Bagmixer 400SW拍打式均质器、DiluFlow全自动电子稀释仪：法国Interscience公司；1300 SERIES A2生物安全柜：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；VITEK 2 COMPACT全自动微生物鉴定系统：法国生物梅里埃股份有限公司。
1.4 样品
速冻调制食品样品共307批次，分为6类，由广东产品质量监督检验研究院提供，其分类和数量情况见表1。
表1 样品分类和数量
Table 1 Categories and number of samples
花色面米制品裹面制品调味水产制品肉糜类制品菜肴制品汤料制品 合计81 96 37 35 41 17 307
1.5 试验方法
参照GB 4789.4—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》[13]对307批次速冻调制食品进行沙门氏菌检测。检验过程以甲型副伤寒沙门氏菌CMCC（B）50093作为阳性对照菌株。
1.5.1 预增菌
称取25 g样品置于无菌均质袋，使用全自动电子稀释仪加入225 mL BPW，用拍打式均质器拍打2 min，于36℃培养18 h。
1.5.2 增菌
轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL，转种于10 mL SC内，于36℃培养24 h。同时，另取1 mL，转种于10 mL TTB内，于42℃培养24 h。
1.5.3 分离
使用接种环分别从SC和TTB中取增菌液1环，划线接种于BS琼脂平板和沙门氏菌显色培养基平板，于36℃分别培养48 h（BS琼脂平板）和24 h（沙门氏菌显色培养基），观察各个平板上生长的菌落。
1.5.4 初筛试验
自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种TSI，先在斜面划线，再于底层穿刺；同时接种赖氨酸脱羧酶生化鉴定管和氨基酸脱羧酶对照生化鉴定管，并加灭菌液体石蜡5滴覆盖培养基表面。于36℃培养24 h，必要时可延长至48 h。根据表2进行初步判定。
表2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的反应结果
Table 2 The reaction results of Salmonella in TSI and lysine decarboxylase test medium
注：K 表示产碱，A 表示产酸；+.阳性；-.阴性；+（-）.多数阳性，少数阴性；+/-.阳性或阴性。
三糖铁琼脂 赖氨酸脱羧酶试验 初步判断斜面 底层 产气 H2S K A +（-） +（-） + 可疑沙门氏菌K A +（-） +（-） - 可疑沙门氏菌A A +（-） +（-） + 可疑沙门氏菌A A +/- +/- - 非沙门氏菌K K +/- +/- +/- 非沙门氏菌
1.5.5 纯化与革兰氏染色
初步判断为可疑沙门氏菌的样品，划线接种于NA，于36℃培养24 h后，进行革兰氏染色。
1.5.6 生化鉴定
革兰氏染色结果为阴性的样品，从NA上挑取可疑菌落，使用VITEK 2 COMPACT进行鉴定。用0.45%盐水制备麦氏比浊度为0.5～0.63的菌悬液，填充到GN卡内，放入孵育仓，仪器每隔15 min自动阅读孵育仓内所有卡片，并将数据传入电脑，4 h～12 h后自动打印结果[14]。VITEK 2 COMPACT以现有的生化鉴定方法为基础，同时开发了新的底物用来检测碳源利用的同化试验，可以使用更多类型的底物，也就是可以利用更多的鉴定反应。其检测原理是仪器透过光学原件检测光穿过64个含有菌液的孔后相应的光强度变化值，对多种颜色变化进行检测（430、568、660 nm 3种波长）。
2 结果与分析
2.1 分离结果
沙门氏菌属在BS琼脂平板上菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。在沙门氏菌显色培养基平板上菌落为品红色。选择性琼脂平板上可疑或典型沙门氏菌分布情况如表3所示。
表3 选择性琼脂平板上可疑或典型沙门氏菌分布情况
Table 3 Distribution of suspicious or typical Salmonella in selective agar plate
分类数量/批次花色面米制品28裹面制品调味水产制品肉糜类制品菜肴制品汤料制品 合计33 19 21 18 9 128
表3显示，有可疑或典型菌落生长的样品共128批次，可疑率为41.69%。
2.2 初筛试验结果
对上述128批次可疑样品进行三糖铁和赖氨酸脱羧酶初筛试验，分布情况见表4。
表4 初筛试验结果分布情况
Table 4 Distribution of preliminary screening test results
分类数量/批次裹面制品花色面米制品12调味水产制品肉糜类制品菜肴制品汤料制品 合计10 7 13 5 3 50
由表4可知，初步判定为可疑沙门氏菌属的样品共50批次，可疑率为16.29%。
2.3 生化鉴定结果
对50批次可疑样品进行生化鉴定，结果如表5所示。
表5 生化鉴定结果
Table 5 Results of physiological and biochemical identification
批次 检出率/% 三糖铁琼脂 赖氨酸脱羧酶试验斜面 底层 产气 H2S Aeromonas hydrophila/caviae（嗜水气单胞菌/豚鼠气单胞菌） 1 0.33 K A + - +Aeromonas sobria（温和气单胞菌） 1 0.33 A A + - +Escherichia coli（大肠埃希菌）10.33KA-++Escherichia fergusonii（弗格森埃希菌）10.33AA--+Klebsiella pneumoniae ozaenae（肺炎克雷伯菌臭鼻亚种） 1 0.33 A A + - +Providencia rettgeri（雷氏普罗威登斯菌）10.33KA---Pseudomonas aeruginosa（铜绿假单胞菌） 1 0.33 A A + - +Pseudomonas luteola（浅黄假单胞菌） 1 0.33 A A + - +Raoultella ornithinolytica（解鸟氨酸拉乌尔菌） 1 0.33 A A - - +Serratia liquefaciens group（液化沙雷菌群） 1 0.33 A A - - +Citrobacter amalonaticus（无丙二酸柠檬酸杆菌） 1 0.33 K A + - -1 0.33 A A + - +Cronobacter sakazakii group（克罗诺杆菌属） 2 0.65 A A + - +Enterobacter cloacae complex（阴沟肠杆菌群） 2 0.65 A A + - +Klebsiella oxytoca（产酸克雷伯菌） 2 0.65 A A + - +Pantoea spp（泛菌属） 1 0.33 K A - - +1 0.33 K A - - -菌株 检出数量/
续表5 生化鉴定结果
Continue table 5 Results of physiological and biochemical identification
批次 检出率/% 三糖铁琼脂 赖氨酸脱羧酶试验斜面 底层 产气 H2S Morganella morganii ssp morganii（摩氏摩根菌摩根亚种）30.98KA+--Salmonella group（沙门菌群） 1 0.33 K A + + +2 0.65 K A - - -Serratia marcescens（粘质沙雷菌） 3 0.98 A A - - +Proteus miralbilis（奇异变形杆菌） 1 0.33 K A + - -3 0.98 K A + + -Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae（肺炎克雷伯菌肺炎亚种） 13 4.23 A A + - +1 0.33 K A + + +1 0.33 A A + + +2 0.65 K A + - +菌株 检出数量/
由表5可知，检出沙门氏菌3批次，检出率为0.98%。检出干扰菌47批次，其中Aeromonas hydrophila/caviae（嗜水气单胞菌/豚鼠气单胞菌）、Aeromonas sobria（温和气单胞菌）、Escherichia coli（大肠埃希菌）、Escherichia fergusonii（弗格森埃希菌）、Klebsiella pneumoniae ozaenae（肺炎克雷伯菌臭鼻亚种）、Providencia rettgeri（雷氏普罗威登斯菌）、Pseudomonas aeruginosa（铜绿假单胞菌）、Pseudomonas luteola（浅黄假单胞菌）、Raoultella ornithinolytica（解鸟氨酸拉乌尔菌）、Serratia liquefaciens group（液化沙雷菌群）各检出1批次，检出率为0.33%。Citrobacter amalonaticus（无丙二酸柠檬酸杆菌）、Cronobacter sakazakii group（克罗诺杆菌属）、Enterobacter cloacae complex（阴沟肠杆菌群）、Klebsiella oxytoca（产酸克雷伯菌）、Pantoea spp（泛菌属）检出2批次，检出率为0.65%。Morganella morganii ssp morganii（摩氏摩根菌摩根亚种）、Serratia marcescens（粘质沙雷菌）检出3批次，检出率为0.98%。Proteus miralbilis（奇异变形杆菌）检出4批次，检出率为1.31%。Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae（肺炎克雷伯菌肺炎亚种）检出17批次，检出率为5.54%。
3 讨论与结论
BPW是非选择性培养基，能使处于濒死状态的细菌恢复活力，用于修复受损伤的沙门氏菌，但由于其不具有选择性，因此增菌时间过长会导致杂菌生长过多，干扰鉴定结果，故建议最好控制在8 h～18 h。
SC和TTB是选择性增菌液，能使沙门氏菌优势繁殖，其它细菌受到抑制[15]。SC中的亚硒酸氢钠抑制革兰氏阳性菌和非沙门氏菌的大多数革兰氏阴性肠道菌，胱氨酸能促进沙门氏菌属生长，适合伤寒沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌生长，最适培养温度为36℃。TTB中硫代硫酸钠和四硫磺酸钠结合可抑制肠道共生菌，而具有四硫磺酸钠还原酶的细菌能在此培养基中繁殖；胆盐和煌绿可抑制大肠群菌和其它革兰氏阳性细菌，适合其他沙门氏菌生长，最适培养温度为42℃。为防漏检宜同时采用SC和TTB进行选择性增菌。
BS中的亚硫酸铋指示剂抑制革兰氏阳性菌和大肠菌群，硫酸亚铁用于产生硫化氢，并与铁产生沉淀，使阳性培养物为具有金属光泽的棕色到黑色菌落，可延长培养时间以免沙门氏菌生长被抑制，适合沙门氏菌特别是伤寒沙门氏菌的选择性分离培养。沙门氏菌显色培养基中的胆盐抑制革兰氏阳性菌，混合色素分别与沙门氏菌和大肠菌群所对应的酶发生特异性反应，水解底物，释放出显色基团，在淡黄色平板上沙门氏菌产生品红色的菌落，大肠菌群产生蓝绿色的菌落。沙门氏菌显色培养基灵敏度高，选择性强，可排除多数干扰菌，减少大量的鉴定工作，提高检测效率，BS选择性较差，但可提高检测准确度，减少误判。采用BS搭配沙门氏菌属显色培养基进行分离，互补防漏检。
三糖铁琼脂用于鉴别细菌发酵蔗糖、乳糖、葡萄糖及产生硫化氢的生化反应。乳糖、葡萄糖、蔗糖为可发酵糖类，其产酸时通过酚红指示剂测出，酸性呈黄色，碱性呈红色；硫代硫酸钠可被某些细菌还原为硫化氢，与硫酸亚铁铵中的铁盐生成黑色硫化铁。若细菌可发酵3种糖产酸，酚红指示剂变黄，则试管斜面和底层均变黄。若细菌只能发酵葡萄糖，则斜面少量的葡萄糖被分解完后，细菌继续利用蛋白胨产碱，且产碱量大于产酸量，最终由黄变为深红，底层无氧，细菌缓慢分解葡萄糖而产酸变黄。若细菌只能发酵葡萄糖和乳糖，或者只能发酵葡萄糖和蔗糖，由于乳糖或蔗糖量大，故斜面和底层均产酸变黄。若分解糖类产气则可见气泡或裂缝。沙门氏菌一般生化特性是利用葡萄糖产酸产气，产H2S，不发酵乳糖和蔗糖[16]。故选择性培养基就是加入乳糖、酸碱指示剂两个指针来判断可疑菌落。但这些一般生化特性并不是沙门氏菌的特异性生化特性，如本次试验中粘质沙雷菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌肺炎亚种等干扰菌在三糖铁琼脂和选择性培养基上生化结果与菌落形态与沙门氏菌相似。
速冻调制食品基质多样复杂，存在大量营养要求和生化反应相似的非沙门氏菌干扰菌，而沙门氏菌血清型高达2 500多个，不同血清型的沙门氏菌其营养要求和生化反应差异较大，增菌和分离既要考虑选择性，又要兼顾特异性，因此对检验人员的操作水平和经验有着较高的要求。本次试验在选择性琼脂平板上的可疑率为41.69%。初筛试验后可疑率为16.29%。沙门氏菌检出率为0.98%。结果表明，速冻调制食品中存在大量非沙门氏菌干扰菌。使用VITEK 2 COMPACT对可疑菌落进行生化鉴定，共鉴定19种干扰菌。其中嗜水气单胞菌/豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌是多种水生动物的原发性致病菌[17-18]；铜绿假单胞菌[19]、克罗诺杆菌属[20]是食源性致病菌；其余均为条件致病菌，应引起重视并进行深入的致病性研究。
[1] 覃湘婕,孙宁与,李春尧,等.食品中沙门氏菌检测方法研究进展[J].中国酿造,2020,39(9):18-24.TAN Xiangjie,SUN Ningyu,LI Chunyao,et al.Research progress of Salmonella detection methods in food[J].China Brewing,2020,39(9):18-24.
[2]ALAKOMI H L,SAARELA M.Salmonella importance and current status of detection and surveillance methods[J].Quality Assurance and Safety of Crops&Foods,2009,1(3):142-152.
[3] 王凤军,叶素丹.TaqMan实时荧光PCR对沙门氏菌能力验证样品的快速检测与鉴定[J].现代食品科技,2020,36(12):300-306,83.WANG Fengjun,YE Sudan.Rapid detection and identification of Salmonella in proficiency testing samples by TaqMan real-time fluorescent PCR[J].Modern Food Science and Technology,2020,36(12):300-306,83.
[4]BELL R L,JARVIS K G,OTTESEN A R,et al.Recent and emerging innovations in Salmonella detection:A food and environmental perspective[J].Microbial Biotechnology,2016,9(3):279-292.
[5]LEE K M,RUNYON M,HERRMAN T J,et al.Review of Salmonella detection and identification methods:Aspects of rapid emergency response and food safety[J].Food Control,2015,47:264-276.
[6]MACHADO I,GARRIDO V,HERNANDEZ L I,et al.Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes[J].Analytica Chimica Acta,2019,1054:157-166.
[7]SEYS S A,SAMPEDRO F,HEDBERG C W.Assessment of meat and poultry product recalls due to Salmonella contamination:Product recovery and illness prevention[J].Journal of Food Protection,2017,80(8):1288-1292.
[8] 王霄晔,任婧寰,王哲,等.2017年全国食物中毒事件流行特征分析[J].疾病监测,2018,33(5):359-364.WANG Xiaoye,REN Jinghuan,WANG Zhe,et al.Epidemiological characteristics of food poisoning events in China,2017[J].Disease Surveillance,2018,33(5):359-364.
[9] 任婧寰,王霄晔,吴晓旻,等.2018年第三季度全国食物中毒事件流行特征分析[J].疾病监测,2019,34(8):741-745.REN Jinghuan,WANG Xiaoye,WU Xiaomin,et al.Epidemiological characteristics of food poisoning in China,July-September,2018[J].Disease Surveillance,2019,34(8):741-745.
[10]中华人民共和国商务部.速冻调制食品:SB/T 10379—2012[S].北京:中国标准出版社,2013.Ministry of Commerce of the People's Republic of China.Quickfrozen prepared food:SB/T10379—2012[S].Beijing:Standards Press of China,2013.
[11]王丽,石晓丽,杨桂娥.非预包装食品中沙门氏菌快速检测方法的建立[J].食品研究与开发,2020,41(23):179-184.WANG Li,SHI Xiaoli,YANG Guie.Establishment of rapid detection method for Salmonella in non-prepackaged foods[J].Food Research and Development,2020,41(23):179-184.
[12]PRIYA G B,AGRAWAL R K,PRINCE MILTON A A,et al.Rapid and visual detection of Salmonella in meat using invasin A(invA)gene-based loop-mediated isothermal amplification assay[J].LWTFood Science and Technology,2020,126:109262.
[13]国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验GB:4789.4—2016[S].北京:中国标准出版社,2017.National Health and Family Planning Commission,China Food and Drug Administration.National food Safety Standard-Microbiological examination of food microbilolgical analysis Salmonella examination:GB 4789.4—2016[S].Beijing:Standards Press of China,2017.
[14]黄宝莹,佘之蕴,林耀文,等.四种方法检测食品中沙门氏菌的比较[J].食品工业科技,2014,35(15):185-187,192.HUANG Baoying,SHE Zhiyun,LIN Yaowen,et al.Comparison of detection of Salmonella in food by four methods[J].Science and Technology of Food Industry,2014,35(15):185-187,192.
[15]张亓,李苨.不同增菌和培养条件下沙门氏菌检出效果的比较[J].工业微生物,2019,49(1):50-54.ZHANG Qi,LI Ni.Comparisons of Salmonella detection under different enrichment and culture conditions[J].Industrial Microbiology,2019,49(1):50-54.
[16]王萍,董贵军,乔勇升,等.显色培养基上沙门氏菌及干扰菌的分离鉴定[J].食品研究与开发,2017,38(12):158-161.WANG Ping,DONG Guijun,QIAO Yongsheng,et al.Isolation and identification of Salmonella and interference strains in chromogenic medium[J].Food Research and Development,2017,38(12):158-161.
[17]陈国权,吴征卓,姚碧琼,等.鸭源致病性嗜水气单胞菌的分离鉴定与生物学特性分析[J].中国家禽,2020,42(4):34-40.CHEN Guoquan,WU Zhengzhuo,YAO Biqiong,et al.Isolation,identification and biological characteristics analysis of pathogenic Aeromonas hydrophila from ducks[J].China Poultry,2020,42(4):34-40.
[18]李旭,丁楚楚,李雪,等.鱼源山梨醇发酵阳性温和气单胞菌的分离与鉴定[J].中国畜牧兽医,2014,41(4):241-244.LI Xu,DING Chuchu,LI Xue,et al.Isolation and identification of sorbitol-positive Aeromonas sobria from fish[J].China Animal Husbandry&Veterinary Medicine,2014,41(4):241-244.
[19]郦娟,董华夏,张珣,等.桶装饮用水中铜绿假单胞菌的污染调查及分型[J].食品研究与开发,2019,40(11):170-174.LI Juan,DONG Huaxia,ZHANG Xun,et al.Investigation on pollution and typing of Pseudomonas aeruginosa in barreled water[J].Food Research and Development,2019,40(11):170-174.
[20]李春霞,易佳琳,梁蕊蕊,等.克罗诺杆菌抑制剂的研究进展[J].食品研究与开发,2020,41(2):205-211.LI Chunxia,YI Jialin,LIANG Ruirui,et al.Research progress on inhibitors of Cronobacter spp[J].Food Research and Development,2020,41(2):205-211.