中国是大豆的发源地，亦是大豆的主要消耗大国。随着经济的发展，粮食和饲料行业对大豆的需求不断加大，国内的大豆产量已满足不了我国对大豆需求量，因而需要依靠进口大豆来满足市场的需求。我国应用的大豆约80%以上依靠进口[1]，据统计，2017年的大豆进口量达9.554×107t[2]，2018年的大豆进口量达8.803×107t。随着对大豆需求量的增大，大豆进口量随之升高，达到了全球大豆贸易量的60%，我国已跃升成为全球第一大豆进口国[3]。进口的大豆多以转基因大豆为主，产地来源于巴西、美国、阿根廷等国家。目前，转基因大豆是种植范围最广、产量最大的转基因作物品种，其中以抗草甘膦转基因大豆为主[4]。该大豆1996年获准进行商业化种植[4]，随后得到广泛的推广与利用。迄今，抗草甘膦转基因大豆的商业化种植已有20余年的历史，其种植面积亦一直在增长。据统计，到2016年全球转基因大豆的种植面积超过8.600×107km2[5]，2018 年达到了 9.590×107km2，相比 1996 年，其种植面积增长了100多倍[6]。超过26个国家/地区在种植转基因作物，44个国家/地区在进口转基因作物[7]。据报道，2002年美国约有70%的抗草甘膦转基因大豆被应用于动物饲料[8]。可见，抗草甘膦转基因大豆在全球范围内得到了广泛的种植和利用。
然而，抗草甘膦转基因大豆的安全性亦一直备受人们的关注。其中，转基因大豆的营养学评价是评估其安全性的前提和基础，常常采取“实质等同性”原则与传统大豆进行营养学评价，若符合该原则，即认为是同等的，也被认为是安全的。最早，“实质等同性”这一概念由世界经济与合作发展组织提出，是转基因作物安全性的评价原则，其目的在于评估转基因食品与传统食品的营养成分的区别，若无区别则表示该转基因食品符合这一原则，与传统食品具有实质等同性[9]。本试验以抗草甘膦转基因大豆为研究对象，以非转基因大豆做对照，分析比较两者的营养及抗营养因子组分，以评估其是否具有实质等同性，旨在为转基因大豆的应用及安全性评价提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大豆（抗草甘膦转基因大豆为美国进口，非转基因大豆为中国吉林省产）：山东省饲料工业有限公司，两种大豆均使用荧光检测仪确定大豆的品种。
大豆球蛋白酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒：上海沪鼎生物科技有限公司。盐酸、冰乙酸、氢氧化钠、浓硫酸、石油醚（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
氨基酸自动分析仪（LA8080）：天美（中国）科学仪器有限公司；气相色谱仪（7980A）、反相高效液相色谱（1260）：安捷伦科技（中国）有限公司；可见分光光度计（TU-1901）：上海元析仪器有限公司；凯氏定氮仪（ALVA）：济南阿尔瓦仪器有限公司；荧光检测仪（FD-600）：上海飞测生物科技有限公司。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 常规营养成分
两种大豆的水分、灰分（灼烧法）、粗蛋白（凯氏定氮法）、粗脂肪含量分别参照GB/T 6435—2014《饲料中水分的测定》、GB/T 6438—2007《饲料中粗灰分的测定》、GB/T 6432—2018《饲料中粗蛋白的测定》、GB/T 6433—2006《饲料中粗脂肪的测定》检测。
1.3.2 氨基酸
氨基酸组成及含量参照GB/T 28246—2000《饲料中氨基酸的测定》测定，其中，17种氨基酸含量采用常规水解法进行检测；色氨酸含量的检测采用碱水解法处理，采用反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法测定。
1.3.3 脂肪酸
脂肪酸组成参照GB/T 21514—2008《饲料中脂肪酸含量的测定》测定，样品前处理完成后进行检测，计算出各种脂肪酸的占比。
1.3.4 大豆抗营养因子
大豆球蛋白采用大豆球蛋白ELISA试剂盒（酶联免疫法）测定；胰蛋白酶抑制因子采用国标GB 5009.224—2016《大豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性的测定》测定，用可见分光光度计测定吸光度，据此计算胰蛋白酶抑制剂的活性。
1.4 数据统计分析
所有的试验数据为测定3次数据的平均值，采用EXCEL进行处理。
2 结果与分析
2.1 常规营养成分
抗草甘膦转基因大豆与非转基因大豆的常规成分见表1。
表1 抗草甘膦转基因大豆与非转基因大豆的营养组分
Table 1 Nutritional components of glyphosate-resistant genetically modified soybeans and non-transgenic soybeans %
样品 水分 粗灰分 粗蛋白 粗脂肪非转基因大豆 10.72±0.15 5.06±0.14 41.76±0.11 18.09±0.06转基因大豆 9.90±0.72 4.82±0.13 41.47±0.87 19.61±0.54
由表1结果可以看出，抗草甘膦转基因大豆水分含量为9.90%，稍低于非转基因大豆的10.72%，但差异不大；转基因大豆的粗灰分含量为4.82%，也稍低于非转基因大豆的5.06%，两者亦差异不大；转基因大豆的粗蛋白含量为41.47%，非转基因大豆为41.76%，两者基本相同；然而，转基因大豆粗脂肪含量为19.61%高于非转基因大豆的18.09%，转基因大豆比非转基因大豆高出1.52%。
2.2 氨基酸组成
转基因大豆和非转基因大豆氨基酸组成和含量的测定结果见表2。
由表2可知，两种大豆分别检测出18种氨基酸。其中，转基因大豆中酪氨酸含量为1.14%，高于非转基因大豆的0.95%，其他17种氨基酸含量均低于非转基因大豆；且转基因大豆中天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸含量分别为3.53%、5.67%和2.09%，而非转基因大豆分别为4.03%、6.53%和2.63%，分别比非转基因大豆低0.50%、0.86%和0.54%。
表2 抗草甘膦转基因大豆与非转基因大豆的氨基酸组成
Table 2 Amino acid composition of glyphosate-resistant genetically modified soybeans and non-transgenic soybeans %
指标 非转基因大豆 转基因大豆天冬氨酸Asp 4.03 3.53苏氨酸Thr 1.43 1.31丝氨酸Ser 1.81 1.64谷氨酸Glu 6.53 5.67甘氨酸Gly 1.47 1.29丙氨酸Ala 1.52 1.44胱氨酸Cys 0.45 0.39缬氨酸Val 1.65 1.41蛋氨酸Met 0.34 0.12异亮氨酸Ile 1.58 1.25亮氨酸Leu 2.81 2.46酪氨酸Tyr 0.95 1.14苯丙氨酸Phe 1.87 1.54赖氨酸Lys 2.33 2.09组氨酸His 0.90 0.75精氨酸Arg 2.63 2.09脯氨酸Pro 1.80 1.64色氨酸Trp 0.44 0.35
2.3 脂肪酸组成
采用气相色谱法测定了抗草甘膦转基因大豆和非转基因大豆中脂肪酸含量和组成，结果见表3。
表3 抗草甘膦转基因大豆与非转基因大豆的脂肪酸组成
Table 3 Fatty acid composition of glyphosate-resistant genetically modified soybeans and non-transgenic soybeans %
指标 非转基因大豆 转基因大豆豆蔻酸 C14∶0 0.12 0.14十五烷酸C15∶0 0.02 0.04棕榈酸 C16∶0 13.29 18.46硬脂酸 C18∶0 3.87 6.15油酸 C18∶1n9c 15.67 23.86亚油酸 C18∶2n6c 55.88 43.13花生酸C20∶0 未检出 0.33花生一烯酸C20∶1 未检出 0.15花生二烯酸C20∶2 未检出 0.03亚麻酸 C18∶3n3 11.10 8.40二十二碳酸C22∶0 未检出 0.49二十三碳酸C23∶0 0.05 0.09二十四碳酸C24∶0 未检出 0.35饱和脂肪酸 17.16 24.61不饱和脂肪酸 82.65 75.39
从表3可以看出，两种大豆的脂肪酸种类存在一定的差异，在转基因大豆中检测出13种脂肪酸，而在非转基因大豆中检测出8种脂肪酸。转基因大豆中棕榈酸、硬脂酸和油酸占比分别为18.46%、6.15%、23.86%，分别高出非转基因大豆5.17%、2.28%、8.19%；而非转基因大豆中亚油酸和亚麻酸占比分别为55.88%、11.10%，远高出转基因大豆12.75%、2.70%。转基因大豆中饱和脂肪酸占比24.61%，非转基因大豆中饱和脂肪酸仅占比17.16%，比非转基因大豆高7.45%；而转基因大豆不饱和脂肪酸占比75.39%，比非转基因大豆低7.26%。另外，在转基因大豆中还检出了花生酸、花生一烯酸、花生二烯酸、二十二碳酸及二十四碳酸等5种脂肪酸。
2.4 抗营养因子含量
检测抗草甘膦转基因大豆与非转基因大豆的大豆球蛋白与胰蛋白酶抑制因子含量，具体结果见表4。
表4 抗草甘膦转基因大豆与非转基因大豆抗营养因子含量
Table 4 Anti-nutritional factor content of glyphosate-resistant genetically modified soybeans and non-transgenic soybeans
样品大豆球蛋白/（g/kg）胰蛋白酶抑制因子/（mg/g）非转基因大豆 68.91 9.52转基因大豆 79.92 7.74
从表4可知，转基因大豆中大豆球蛋白平均含量为79.92 g/kg，较非转基因大豆高出约15.98%。从胰蛋白酶抑制因子测定结果来看，非转基因大豆中的含量平均为9.52 mg/g，较转基因大豆高出约23.00%。
3 讨论
3.1 抗草甘膦转基因大豆中营养组分的实质等同性分析
大豆种植过程中常喷洒除草剂——草甘膦，一般是通过干扰杂草中莽草酸的代谢途径，影响其芳香族氨基酸的合成，从而达到去除杂草的目的[10]，而抗草甘膦转基因大豆可以在这种环境中健康生长。种植抗草甘膦转基因大豆可使产量提高，人力减少，经济效益可观[11]，然而，人为导入外源基因可能会导致蛋白质或氨基酸发生改变。为此，在转基因大豆的实质等同性研究中，研究人员检测分析转基因大豆的营养组分，同非转基因大豆作对比，若无明显差异即表示存在实质等同性，如 Padgette 等[12]、Taylor等[13]研究人员通过对比抗草甘膦转基因大豆与非转基因大豆的营养成分认为，两者的蛋白质、氨基酸、脂肪等营养水平相同；朱元招等[14]通过分析对比了抗草甘膦转基因大豆与非转基因大豆的多项营养指标，结果表明，两种大豆的常规营养成分、氨基酸、脂肪酸等指标均差异不大，具有营养学实质等同性；叶增民等[15]测定的抗草甘膦转基因大豆的蛋白质、脂肪等组分与非转基因大豆差异不大，基本相同。以上各研究结果均表示转基因大豆与非转基因大豆在营养成分上具有实质等同性。
然而，曹柏营[16]研究认为，抗草甘膦转基因大豆与非转基因大豆相比，前者脂肪酸含量较低，但种类无太大差异；Rui等[17]通过测定大豆油的脂肪酸，结果发现抗草甘膦转基因大豆中脂肪酸总量较高，高出了非转基因大豆12.6%；谭建庄[18]发现抗草甘膦转基因豆粕的蛋白含量高出非转基因豆粕2.58%，其中17种氨基酸中（除胱氨酸外），天冬氨酸和亮氨酸显著高于非转基因豆粕，其他氨基酸则稍高于非转基因豆粕；金红等[19]使用气相色谱法检测了大豆的脂肪酸，结果显示，抗草甘膦转基因大豆中棕榈酸与硬脂酸含量较高。本试验结果与上述结果类似，本试验中检测的转基因大豆与非转基因大豆结果表示，两者18种氨基酸种类相同，但含量具有一定的差异，同时转基因大豆中脂肪酸含量较高，其脂肪酸种类及占比与非转基因大豆存在一定的差异。由此可见，抗草甘膦转基因大豆与非转基因大豆营养组成还具有一定的差异，并不具有实质等同性。但仍需考虑各研究人员选取的转基因大豆与非转基因大豆的品种、生长环境以及在样品处理方法、测定方法对组分的影响。
3.2 抗草甘膦转基因大豆中抗营养因子的实质等同性分析
抗营养因子为主要存在于植物中的一类物质，由植物代谢产生，可对动物营养物质的消化、吸收产生抗营养作用。其中，大豆中存在的抗营养因子包括蛋白酶抑制因子、异黄酮、抗原蛋白等物质[20]。抗草甘膦转基因大豆中导入的外源基因，会影响大豆莽草酸的代谢途径，该靶途径芳香族氨基酸又是黄酮类物质的前体物质[21]，因此，抗草甘膦转基因大豆可能因为外源基因的转入导致相关抗营养因子发生改变。
国内外有关学者对抗草甘膦转基因大豆中抗营养因子实质等同性进行了研究报道，如，Padgette等[12]研究检测了大豆的植酸磷、胰蛋白酶抑制因子、脲酶活性和蛋白溶解度等抗营养因子指标，发现抗草甘膦转基因大豆与非转基因大豆的含量没有差异；Zhou等[22]检测的异黄酮、凝集素、胰蛋白酶抑制剂等指标亦与亲本大豆的接近；朱元招等[14]采用大豆胰蛋白酶抑制因子单克隆抗体试剂盒检测结果显示，抗草甘膦转基因大豆与非转基因大豆的胰蛋白酶抑制因子含量基本等同。
本试验结果与上述报道不同，本研究结果显示，非转基因大豆中胰蛋白酶抑制因子含量较高，比转基因大豆高出约23.00%；而且转基因大豆中大豆球蛋白含量高出非转基因大豆15.98%。可见，大豆球蛋白与胰蛋白酶抑制因子含量在两种大豆中存在较大差异。类似的研究，如叶增民等[15]发现抗草甘膦豆粕中异黄酮平均含量为1.865 6 mg/g，而本土豆粕中异黄酮平均含量为4.783 3 mg/g，两者差异明显；曹柏营等[16]发现抗草甘膦大豆的酚类物质的含量显著高于非转基因大豆；金红等[19]检测的抗草甘膦转基因大豆黄酮含量高出非转基因大豆20.27%～22.65%，总酚含量高出53.49%～105.81%，酚酸含量高出16.12%～29.36%。以上结果均表示，抗草甘膦转基因大豆的酚类物质、黄酮类等与非转基因大豆存在较大差异，但在本试验中未测定这两类物质。结合上述研究可见，抗草甘膦转基因大豆的黄酮类、酚类物质、大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子或许产生变化。因此，抗草甘膦转基因大豆与非转基因大豆在抗营养因子含量上亦不具有实质等同性。
4 结论
综上，抗草甘膦转基因大豆粗脂肪含量远高于非转基因大豆，两者的氨基酸组成、脂肪酸组成及占比、大豆球蛋白及胰蛋白酶抑制因子含量都存在一定的差异，因此，抗草甘膦转基因大豆与非转基因大豆在营养学上不具有实质等同性。
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