莲子心（Plumula nelumbinis）又名莲薏、薏，是睡莲科水生草本植物莲的成熟种子的胚根，长约1.0 cm～1.5 cm，直径约2 mm，呈绿褐色，质脆，易折断，横截面为小孔状，是一种中草药[1]。莲子心在亚热带和温带地区均有产出，在我国黑龙江、海南等地均有种植。
莲子心气微，味苦、微寒，归心、肾经，是我国的传统中药之一，据《本草纲目》记载，莲子心具有清心安神、交通心肾和涩精止血的功效[2]。现代研究表明，莲子心含有生物碱、黄酮、甾醇、挥发油和微量元素等化学成分；植物甾醇的生物学活性和功能颇多，具有抗氧化[3]、降血脂[4]、消炎退热[5-6]、抗肿瘤[7-8]和类激素[9]等多种生理功效。对甾醇的提取主要通过索氏提取法、超声辅助提取法[10]、微波辅助提取法[11]、超临界流体萃取法[12]等，其中索氏提取法具有能耗低、操作简便、得率高等优点[13]。因此，为了促进莲子心资源的开发利用和深入研究，本文以莲子心为原料，采用响应面法优化索氏提取甾醇工艺。
1 材料与方法
1.1 材料试剂
莲子心：湖南莲美食品股份有限公司；β-谷甾醇、N，O-双三甲基硅基三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷（99%+1%）、脂肪酸甲酯混标：上海安谱实验科技股份有限公司；丙酮、石油醚、乙醚、乙酸乙酯、无水乙醇、浓硫酸、乙酸酐、正庚烷（均为分析纯）：上海国药试剂集团。
1.2 试验仪器
LHS-160CL电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技仪器有限公司；UV3000PC紫外分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅：江苏金坛金城国胜实验仪器厂；RE-2000A旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；8890 GC-5977B MS气相色谱-质谱联用仪、7820A GC气相色谱仪：美国Agilent公司。
1.3 试验方法
1.3.1 莲子心粉的制备
原料预处理：采用电热恒温鼓风干燥箱在65℃下将莲子心烘干至恒重，将风干后的莲子心倒入高速粉碎机中打磨成粉状，将莲子心粉末分别过20、40、60、80目筛，备用。
1.3.2 莲子心粉中甾醇的提取
精密称取10.00 g莲子心粉，以丙酮为溶剂，用索氏提取器提取一定时间，得到溶剂提取液，70℃下旋蒸除尽溶剂，置于105℃烘箱中干燥至恒重，得莲子心油脂浸膏。
1.3.3 Liebermann-Burchard法测定甾醇含量
精密称取β-谷甾醇标准品10 mg，用乙酸酐溶解，定容至10 mL，使其浓度为1.0 mg/mL。依次吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于 10 mL 容量瓶，乙酸酐补足至刻度线，定容，摇匀。然后依次滴加50 μL浓硫酸反应10 min后，在660 nm测定吸光度，以β-谷甾醇标准浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。得到回归方程：y=10.831x-0.002 6，相关系数R2=0.999 1。根据方程可知β-谷甾醇标准曲线的回归性较好，可进行定量分析。
取莲子心油脂浸膏5 mg，用乙酸酐溶解并定容至10 mL，在50℃恒温水浴中超声波振荡30 min，取出冷却至常温（30℃），滴加50 μL浓硫酸，振荡摇匀，放置约10 min后，于660 nm处测定吸光度。根据线性回归方程计算甾醇浓度C，再通过公式（1）计算得出莲子心的甾醇得率Y[14]。
式中：Y为莲子心的甾醇得率，mg/g；C为提取浸膏的甾醇浓度，mg/mL；V 为定容体积，mL；m1为莲子心提取出的浸膏总质量，g；m2为称取的浸膏质量，mg；M为莲子心粉总质量，g。
1.3.4 气相色谱-联用质谱分析莲子心中的单体甾醇
参考王多娇等[15]的方法并加以改进：称取50 mg莲子心浸膏于离心管中，加入2 mol/L氢氧化钾-乙醇溶液5 mL，室温（30℃）下超声混匀5 min；于60℃烘箱中皂化60 min。冷却至室温（30℃）后，加入4 mL水和5 mL正己烷，涡旋混合振荡提取2 min，4 500 r/min离心3 min，转移上层有机相至15 mL离心管中；向上述50 mL离心管中加入5 mL正己烷，再次提取，合并两次提取液，加入1.5 g无水硫酸钠，静置至澄清透明。转移1 mL上清液至反应瓶中，用氮气吹干溶剂后加入100 μL N，O-双三甲基硅基三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷，密封后于105℃烘箱中反应15 min，冷却至室温（30℃）供分析。甾醇定量采用面积归一化法，按公式（2）计算甾醇相对含量。
气相色谱（gas chromatography，GC）条件：色谱柱HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气氦气；流速0.7 mL/min；进样量1 μL；进样口温度320℃；程序升温为起始温度180℃，以4℃/min升至300℃，保持 25 min；分流比 60∶1。
质谱（mass spectrum，MS）条件为 Agilent 5977B 质谱检测器，传输线温度250℃；离子源温度230℃；电子电离模式；溶剂延迟时间10 min；全扫描模式（full scan）；分子离子碎片扫描范围m/z 50～650。
1.3.5 气相色谱分析莲子心中的单体脂肪酸
参考李玲芳等[16]方法并加以改进：称取10 mg莲子心浸膏于离心管中，加入2 mL正庚烷，4 mol/L KOH-甲醇溶液，室温（30℃）涡旋3 min，静置分层，取1 mL正庚烷溶液层稀释至10 mL，取1 mL稀释液过0.22 μm孔有机相滤膜，进气相色谱分析。根据样品色谱峰保留时间与标准品保留时间比较判定单体脂肪酸种类，脂肪酸定量采用面积归一化法，按公式（3）计算脂肪酸相对含量。
GC分析条件：Agilent 7820A气相色谱仪；色谱柱为TR-FAME（100 m×0.25 mm×0.2 μm）；进样口温度260℃；进样量1 μL；分流比 10∶1；载气氮气（99.999%）；流量1 mL/min；检测器温度：260℃；升温程序为起始温度60℃，保持1 min，以20℃/min升至160℃，再以4℃/min升至200℃，保持10 min，再以2℃/min升至240℃，保持10 min。
1.3.6 莲子心油脂浸膏提取单因素试验设计
以甾醇得率为指标，通过单因素试验对影响得率的各因素进行考察。单因素试验选定料液比[1∶13、1∶15、1∶17、1∶19、1∶21（g/mL）]、提取时间（2、4、6、8、10 h）、提取温度（66、70、74、78、82 ℃）、物料粒径（0、20、40、60、80目）4个因素。
1.3.7 响应面试验设计
在1.3.6的单因素试验基础上，采用Box-Behnken中心组和设计，以莲子心的粗甾醇得率为响应值（Y），选取料液比、提取时间、提取温度和物料粒径为自变量，采用四因素三水平的响应曲面分析方法，因素与水平见表1。
表1 响应面设计因素水平
Table 1 Factors and levels of response surface design
编码值 A提取温度/℃D料液比/（g/mL）-1 70 4 20 1∶13 0 74 6 40 1∶15 1 78 8 60 1∶17 B提取时间/h C物料粒径/目
2 结果与分析
2.1 莲子心索氏提取甾醇单因素结果分析
2.1.1 料液比的选择
料液比对莲子心中甾醇得率的影响如图1所示。
图1 不同料液比对甾醇得率的影响
Fig.1 The effect of different material-liquid ratio on sterol yield
由图1可知，随着溶剂比例的增加，浸提溶液中的甾醇得率降低，固液两相甾醇浓度梯度增加，使得甾醇溶出速度提升，得率增大。当料液比为1∶15（g/mL）时，甾醇得率高达18.682（mg/mL），而后随着溶剂用量增大而减少，则应选择料液比为1∶15（g/mL）进行后续试验。
2.1.2 提取时间的选择
提取时间对莲子心中甾醇得率的影响如图2所示。
图2 不同提取时间对甾醇得率的影响
Fig.2 Effect of different extraction time on sterol yield
由图2可知，提取时间小于6 h时，莲子心甾醇得率随着提取时间延长而提高，这是由于提取时间过短，甾醇溶解不充分，溶剂对甾醇的溶解能力未达到饱和，提取不完全。但当提取时间大于6 h时，莲子心甾醇得率随着提取时间延长而降低，原因是随提取时间增长可能提取出其他成分，造成莲子心甾醇得率降低，则应选择提取时间6 h进行后续试验。
2.1.3 提取温度的选择
提取温度对莲子心中甾醇得率的影响如图3所示。
图3 不同提取温度对甾醇得率的影响
Fig.3 The effect of different extraction temperature on sterol yield
由图3可知，提取温度小于74℃时，甾醇得率随着提取温度的升高而迅速增加，这是由于一定温度范围内，溶剂在莲子心粉末中扩散速度加快，分子间碰撞几率增加，甾醇得率增加。提取温度大于74℃时，温度接近丙酮沸程顶端，丙酮回流速度过快，其在提取管中时间过短，难以充分提取甾醇，使甾醇得率降低，则应选择提取温度74℃进行后续试验。
2.1.4 物料粒径的选择
物料粒径对莲子心中甾醇得率的影响如图4所示。
图4 不同物料粒径对甾醇得率影响
Fig.4 The effect of different raw material meshes on sterol yield
由图4可知当物料粒径低于40目时，莲子心甾醇得率随目数增大而提高，莲子心粉末与溶剂接触面增大，使甾醇得率增高。当物料粒径高于40目时，莲子心甾醇得率随着目数增加而平缓降低，应选择40目的物料粒径。
2.2 响应面分析法优化工艺
2.2.1 响应面试验设计及结果
在单因素试验的基础上，采用Design-Expert 11.0软件对响应曲面试验进行分析设计，以莲子心植物甾醇得率为指标（Y），提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）、物料粒径（D）4个响应因素，Box-Behnken试验设计与结果见表2。
表2 响应面设计及结果
Table 2 Arrangement and corresponding results of Box-Behnken experimental design
取温度B提取时间C物料粒径D料液比-1 -1 0 0 1 -1 0 0-1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 -1 -1 0 0 1 -1 0 0 -1 1 0 0 1 1-1 0 0 -1 1 0 0 -1-1 0 0 1 12 1 0 0 1 13 0 -1 -1 0 14 0 1 -1 0 15 0 -1 1 0 Y甾醇得率/(mg/g)11.515 0 15.229 3 16.060 8 14.418 9 5.368 3 14.402 6 4.625 2 16.188 6 16.131 1 14.949 5 15.866 6 15.411 1 3.813 9 4.561 1 13.444 6序号 A提取温度B提取时间C物料粒径D料液比Y甾醇得率/(mg/g)16 0 1 1 0 15.316 7 17 -1 0 -1 0 6.444 4 18 1 0 -1 0 5.131 9 19 -1 0 1 0 14.707 5 20 1 0 1 0 16.692 1 21 0 -1 0 -1 11.299 6 22 0 1 0 -1 16.094 1 23 0 -1 0 1 16.778 0 24 0 1 0 1 16.138 3 25 0 0 0 0 18.123 6 26 0 0 0 0 17.316 4 27 0 0 0 0 17.053 8 28 0 0 0 0 17.396 3 29 0 0 0 0 18.351 6
2.2.2 回归方程拟合及方差分析
用Design-Expert 11.0软件对试验结果进行回归分析，得到提取温度、提取时间、物料粒径和料液比对莲子心甾醇得率影响的二次多项式回归模型方程：Y=17.65+0.09A+0.88B+5.07C+0.56D-1.34AB+0.82AC+0.18AD+0.28BC-1.36BD+0.63CD-1.03A2-2.01B2-6.26C2-0.94D2。
方差分析结果如表3所示。
对模型进行方差分析，方程中各项系数绝对值的大小直接反映各因素对响应值的影响程度。由表3可知，模型的P＜0.000 1，说明回归方程极显著，失拟项P=0.181 8＞0.05（不显著），说明回归方程与实际情况有较好的吻合，试验误差小。由R2=0.984 5，R2adj=0.969 0，表明本试验拟合程度较高，能够较好地预测莲子心甾醇的优化条件。由F检验可知，影响莲子心甾醇得率的主次因素顺序为物料粒径（C）＞提取时间（B）＞料液比（D）＞提取温度（A）。
表3 方差分析
Table 3 Analysis of variance
注：**为差异极显著（P＜0.01）；*为差异显著（P＜0.05）；-为差异不显著。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 600.88 14 42.92 63.52 ＜0.000 1 **A 0.102 2 1 0.102 2 0.1512 0.703 2 -B 9.2 1 9.2 13.62 0.002 4 **C 308.13 1 308.13 456.01 ＜0.000 1 **D 3.81 1 3.81 5.64 0.032 4 *AB 7.17 1 7.17 10.61 0.005 7 **AC 2.72 1 2.72 4.02 0.064 6 -AD 0.131 8 1 0.131 8 0.1951 0.665 5 -BC 0.316 4 1 0.316 4 0.4682 0.505 0 -BD 7.38 1 7.38 10.93 0.005 2 **CD 1.6 1 1.6 2.37 0.146 3 -A2 6.87 1 6.87 10.16 0.006 6 *B2 26.33 1 26.33 38.97 ＜0.000 1 **C2 254.32 1 254.32 376.38 ＜0.000 1 **D2 5.76 1 5.76 8.52 0.011 2残差 9.46 14 0.675 7失拟项 8.21 10 0.821 2 2.63 0.181 8误差 1.25 4 0.311 9总和 610.34 28
方差分析P值结果可知，D、A2的P＜0.05，说明这些因素对莲子心甾醇得率影响显著；B、C、AB、BD、B2、C2的P＜0.01，说明这些因素对莲子心甾醇得率影响极显著；其余因素均对莲子心甾醇得率不显著。
2.2.3 响应曲面分析
响应曲面图能直观地反映任意两因素对甾醇得率的影响，具体交互影响结果见图3。
由图5可知，提取温度和提取时间、提取时间与料液比交互作用等高线呈椭圆形，说明两因素间交互作用显著；提取温度与物料粒径、提取温度与料液比、提取时间与物料粒径、物料粒径与料液比两因素交互作用不显著。
图5 响应面因素交互作用3D曲面图和等高线图
Fig.5 Response surface factor interaction 3D surface map and contour map
（a）～（f）.提取温度与提取时间、提取温度与物料粒径、提取温度与料液比、提取时间与物料粒径、提取时间与料液比、物料粒径与料液比的交互作用。
2.2.4 最佳工艺的预测和验证
利用模型进行预测，所得莲子心甾醇的最佳提取工艺为提取温度75.056℃、提取时间6 h、物料粒径48.914 目、料液比 1∶15.946（g/mL），此时莲子心甾醇得率可达18.924 mg/g。结合上述分析与实际试验操作，将最优提取条件修正为提取温度75℃、提取时间6 h、物料粒径40目、料液比1∶16（g/mL）。修正后的试验进行3次平行试验，最终得到平均甾醇得率为（18.690±0.034）mg/g，与理论值相差0.234 mg/g，差距较小，证明该工艺稳定可靠，具有实际应用价值。陈佳丽等[17]通过溶剂搅拌法提取莲子心中甾醇，莲子心总甾醇得率为（1.67±0.11）%，本法与该研究相比甾醇得率略有提高但是时间耗费较多，在实际操作中操作简便且溶剂用量较小。Bukhanko等[18]研究也说明索氏提取法更便于从从云杉树皮中提取甾醇和萜烯、从云杉球果中分离提取物。Kozłowska等[19]研究发现Folch法相对于索氏提取法甾醇得率略高10%左右，但Folch法使用的溶剂是氯仿和甲醇，其危险性和费用相对较高。
2.3 甾醇相对含量分析
通过GC-MS对莲子心中甾醇成分进行分析，其总离子流图见图6。经NIST17.L标准质谱图检索并采用峰面积归一化法确定甾醇组成及相对含量见表4。
表4 甾醇组成及相对含量
Table 4 Sterol composition and relative content
序号保留时间/min 成分 相对含量/%1 28.889 豆甾-3，5-二烯 3.86 2 31.525 菜油甾醇 13.76 3 31.739 麦角甾-7，22-二烯-3β 醇 0.93 4 31.986 豆甾醇 1.15 5 32.341 26-或非-5-胆固醇-3β-醇-25-酮 1.18 6 32.713 5-豆甾烯，3β-醇 2.72 7 33.144 β-谷甾醇 48.32 8 33.389 岩藻甾醇 21.91 934.421三甲基硅烷[（3.β.）-豆甾烷-7，24（28）-二烯-3-氧基]-4.01 10 35.335 9，19-环羊毛甾烷-3-醇，24-亚甲基-，（3β）2.15
图6 莲子心甾醇总离子流图
Fig.6 Total ion current diagram of sterols from Plumula nelumbinis
1～10.莲子心甾醇主要组成成分。
莲子心浸膏中鉴定的甾醇共有10种，其中含量最高的是β-谷甾醇，占甾醇含量的48.32%，其次是岩藻甾醇（21.91%）和菜油甾醇（13.76%），其它甾醇含量相对较低。Chanioti等[20]对橄榄渣油中的甾醇含量测定，其中主要的甾醇为β-谷甾醇、菜籽甾醇和豆甾醇。Dabrowski等[21]也在亚麻籽油中测得β谷甾醇和环羊毛甾醇-23-烯-3，25-二醇的含量较高，还发现菜油甾醇、豆甾醇，可见不同种子油中的甾醇种类和含量存在差异。明确莲子心中甾醇的组成，有助于莲子心活性成分的评价。
2.4 脂肪酸含量分析
脂肪酸混合标样与莲子心中脂肪酸检测结果见图7，脂肪酸组成及相对含量见表5。
如图7所示，各脂肪酸甲酯组分在混合标样中均有良好的分离度。结合表5看，莲子心中主要的脂肪酸单体是亚油酸（56.75%）和棕榈酸（19.85%）。Wang等[22]将文冠果、扁桃、翅果油树、牡丹4种种子和茶籽油中的脂肪酸种类鉴定为油酸、亚油酸、棕榈酸和硬脂酸。与莲子心中主要的脂肪酸种类相似。
表5 脂肪酸组成及相对含量
Table 5 Fatty acid composition and relative content
序号 保留时间/min 组分 相对含量/%1 11.01 乙酸 C6∶0 1.19 2 12.452 辛酸 C8∶0 0.78 3 14.092 葵酸 C10∶0 3.28 4 15.018 十一酸 C11∶0 0.79 5 16.038 月桂酸 C12∶0 0.61 6 17.164 十三酸 C13∶0 0.52 7 18.404 肉豆蔻酸C14∶0 0.77 11 21.356 棕榈酸 C16∶0 19.85 19 27.969 亚油酸 C18∶2n6c 56.75 20 29.242 花生酸 C20∶0 2.76 21 30.257 γ-亚麻酸 C18∶3n5 4.73 22 30.439 花生一烯酸C20∶1 2.39 23 31.695 α-亚麻酸 C18∶3n3 0.54 27 36.256 顺-11，14，17-二十碳三烯酸 C20∶3n3 4.42 32 42.353 顺-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸 C20∶5n3 0.62
图7 脂肪酸标准品总离子流图和莲子心脂肪酸总离子流图
Fig.7 Fatty acid standard total ion current chart and Plumula nelumbinis fatty acid total ion current chart
1.乙酸；2.辛酸；3.葵酸；4.十一碳酸；5.月桂酸；6.十三碳酸；7.肉豆蔻酸；8.肉豆蔻脑酸；9.十五碳酸；10.顺-10-十五碳一烯酸；11.棕榈酸；12.棕榈油酸；13.十七碳酸；14.顺-10-十七碳一烯酸；15.硬脂酸；16.反式油酸；17.油酸；18.反亚油酸；19.亚油酸；20.花生酸；21.γ-亚麻酸；22.花生一烯酸；23.α-亚麻酸；24.二十一碳酸；25.顺，顺-11，14-二十碳二烯酸；26.山嵛酸；27.顺-11，14，17-二十碳三烯酸；28.花生四烯酸；29.二十三碳酸；30.顺-13，16-二十二碳二烯酸；31.木蜡酸；32.顺-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸；33.神经酸；34.顺-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸。a.脂肪酸标准品总离子流图；b.莲子心脂肪酸总离子流图。
3 结论
在单因素试验基础上，采用响应面法进行优化，确定莲子心中甾醇最优提取工艺为提取温度75℃、提取时间 6 h、物料粒径 40 目、料液比 1∶16（g/mL），最终平均甾醇得率为（18.690±0.034）mg/g。采用气相色谱-质谱联用仪测定莲子心中主要单体甾醇为β-谷甾醇、岩藻甾醇和菜油甾醇；其相对含量分别为13.76%、48.32%和21.91%。采用气相色谱测定莲子心中主要的单体脂肪酸为亚油酸（56.75%）和棕榈酸（19.85%），本研究应用响应面法优化索氏提取莲子心中总甾醇的提取工艺，同时分析了莲子心中总甾醇的种类，并对莲子心中脂肪酸种类进行了初步鉴定，为莲子心资源充分利用的进一步研究提供参考。
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