蒲桃（Syzygium jambos）为桃金娘科蒲桃属常绿乔木，又名香果、响鼓，原产于马来西亚、中印半岛，在我国福建、广东、广西、贵州、云南、海南等地区有少量栽培[1]。蒲桃作为一种可食用的热带果树，药用历史悠久，其中蒲桃叶具有清热解毒、消疮之功效，主治口舌生疮、疮疡、痘疮等病症[2-4]。目前，对蒲桃的研究应用以海南蒲桃、水蒲桃、滇南蒲桃等少数蒲桃属植物的果实、茎的化学成分为主，对蒲桃叶化学成分的研究较少[5-11]。蒲桃叶中含有的黄酮类成分具有一定的抗氧化作用[12-14]。
目前，黄酮类化合物较为常见的提取方法有乙醇回流提取法、酶提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法等。乙醇加热回流法所需温度太高导致有效成分的结构容易遭到破坏，酶提取法中酶的价格较高导致提取成本偏高，超声波辅助提取法虽耗时短，但产热效应不强，很难达到所需的提取温度，而微波辅助提取技术具有耗时短、加热效率高、溶剂消耗量少、不产生噪音、适合于热不稳定物质的提取等优点[15-16]。
本研究以蒲桃叶为原料，通过单因素试验研究乙醇体积分数、液料比、微波功率、微波时间对微波辅助法提取蒲桃叶总黄酮工艺的影响，在此基础上，以蒲桃叶中总黄酮提取率为评价指标，利用响应面法进一步优化提取工艺，并验证其抗氧化活性，为今后蒲桃叶的综合利用以及蒲桃叶提取物作为天然食品抗氧化剂的研究提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
蒲桃叶：2020年10月采摘于广西来宾市城区绿化树木，干燥粉碎后过80目筛；无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、30%过氧化氢、水杨酸、七水合硫酸亚铁（均为分析纯）：四川西陇科学股份有限公司；芦丁标准品（纯度＞98%）：山东西亚化学服务有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：凯玛生化有限公司；L-抗坏血酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
GZX-GF101-3BS型电热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械有限公司；LFP-800T型多功能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；FA2004型电子分析天平：上海舜宇横平科学仪器有限公司；UV-9600型紫外可见分光光度计：北京瑞利分析仪器有限公司；XH-MC-1型微波合成仪：北京祥鹄科技发展有限公司；H-1850型台式高速离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；SHZ-D（Ш）型循环水多用真空泵：巩义市科瑞仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 标准曲线的绘制
准确移取 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 的芦丁标准溶液（0.2 mg/mL）分别置于10 mL具塞比色管中，加入70%乙醇溶液使溶液总体积为3.0 mL。摇匀后依次加入5% NaNO2溶液0.7mL，10% Al（NO3）3溶液0.7mL，10% NaOH溶液5.0 mL，最后以70%乙醇定容至刻度并摇匀静置15 min。以空白试剂为参比溶液，测定510 nm波长处的吸光度。以芦丁浓度C（mg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程A=11.414C+0.000 7，R2=0.999 8。表明在 0.01 mg/mL～0.06 mg/mL浓度范围内，芦丁标准样品与吸光度呈现良好线性关系。
1.3.2 蒲桃叶总黄酮的测定
准确称取经60℃恒温干燥、粉碎、过80目筛处理过的蒲桃叶粉末1.00 g，经微波处理后，抽滤，将滤液转移至100 mL容量瓶用无水乙醇定容后作为待测液备用。准确移取一定体积待测液至10 mL比色管中，按方法1.3.1步骤显色后测定其吸光度，平行测定3次，并按下列公式计算总黄酮提取率。
式中：C为测试液总黄酮浓度，mg/mL；V为定容体积，mL；M为蒲桃叶粉末质量，g；N为稀释倍数。
1.3.3 单因素试验
分别对乙醇体积分数（40%、50%、60%、70%、80%）、液料比[20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）]、微波功率（300、400、500、600、700 W）、微波时间（2、4、6、8、10 min）进行单因素试验，研究各因素对蒲桃叶总黄酮提取率的影响。
1.3.4 响应面优化试验
在单因素试验结果基础上，按照Box-Benhnken中心组合试验设计原理，采用Design-Expert 8.0.6软件设计响应面试验，响应面试验因素和水平见表1。
表1 响应面试验因素和水平
Table 1 Factors and levels of response surface methodology
水平D微波时间/min-1 50 40∶1 300 2 0 60 50∶1 400 4 1 70 60∶1 500 6因素A乙醇体积分数/%B液料比/（mL/g）C微波功率/W
1.3.5 蒲桃叶总黄酮体外抗氧化活性研究
以VC为阳性对照，用最优提取条件下得到的总黄酮提取液来测定羟基自由基、DPPH自由基的清除率，清除率越大表明其抗氧化能力越强。
1.3.5.1 羟基自由基清除率的测定
参考李雪玲等[17]的方法，并在此基础上稍作改动。准确移取不同质量浓度的蒲桃叶总黄酮溶液各1 mL于10 mL具塞比色管中，依次加入6 mmol/L硫酸亚铁溶液、10mmol/L水杨酸-乙醇溶液、6mmol/L过氧化氢溶液各1mL，将其置于37℃水浴反应30min，于510nm波长处测定其吸光值A1；按上述方法，将过氧化氢溶液替换成等体积蒸馏水，测定其吸光值A2，作为提取液的本底吸光度；另取一支比色管，以不加蒲桃叶总黄酮溶液作为空白试验对照，测定其吸光值A0。配制一系列相同浓度梯度的VC溶液作为对照，计算半数抑制浓度（IC50）。羟基自由基清除率计算公式如下。
1.3.5.2 DPPH自由基清除率的测定
参考秦晶晶等[18]的方法并加以修改。准确移取不同质量浓度的蒲桃叶总黄酮溶液各2 mL于10 mL具塞比色管中，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，定容摇匀，测定其吸光值A1；按上述方法，不加DPPH溶液，测定提取液的本底吸光值A2；另取一支比色管加入0.2 mmol/L DPPH、无水乙醇溶液各2 mL，定容摇匀后测定其吸光值A0，作为空白试验对照。配制一系列相同浓度梯度的VC溶液作为对照试验，计算半数抑制浓度（IC50）。DPPH自由基清除率计算公式如下。
1.4 数据处理
所有试验均重复3次；采用Excel2010、Origin2018、Design-Expert 8.0.6进行试验数据处理、分析及绘图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 不同乙醇体积分数对蒲桃叶总黄酮提取率的影响
乙醇体积分数对蒲桃叶总黄酮提取率的影响见图1。
图1 乙醇体积分数对蒲桃叶总黄酮提取率的影响
Fig.1 The effects of ethanol volume fraction on the extraction rate of total flavonoids from Syzygium jambos leaves
由图1可知，乙醇体积分数为40%～60%时，蒲桃叶中总黄酮的提取率随着乙醇体积分数增加而增大。当乙醇体积分数为60%时，总黄酮的提取率达到最大值，为4.76%。随着乙醇体积分数的进一步升高，总黄酮提取率出现下降趋势。原因主要是在乙醇体积分数较低时蒲桃叶中总黄酮未能完全溶解，随着乙醇体积分数的逐渐增大，总黄酮的溶出更加完全，但是当乙醇体积分数超过60%时，由于溶剂极性的下降导致蒲桃叶中其他醇溶性非极性物质溶出量增加，降低了总黄酮的溶解效果[19]。故选择乙醇体积分数50%、60%、70%进行下一步的响应面试验优化。
2.1.2 不同液料比对蒲桃叶总黄酮提取率的影响
液料比对蒲桃叶总黄酮提取率的影响见图2。
图2 液料比对蒲桃叶总黄酮提取率的影响
Fig.2 The effects of liquid-material ratio on the extraction rate of total flavonoids from Syzygium jambos leaves
由图 2 可知，液料比为 20∶1（mL/g）～50∶1（mL/g）时，蒲桃叶中总黄酮的提取率随着液料比的增大而逐步增大，当液料比达到50∶1（mL/g）时，总黄酮的提取率达到最大值，提取率为4.83%，继续增大液料比，提取率稍有下降。这主要是由于当液料比较低时，蒲桃叶与溶剂接触不充分从而影响总黄酮的溶出，随着液料比增加总黄酮溶出增大导致提取率升高。之后随着液料比的继续增大，样品中的一些其它醇溶性物质的溶解性也随之增大，从而抑制了总黄酮的溶出[20]。故选择液料比为 40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）进行下一步的响应面试验优化。
2.1.3 微波功率对总黄酮提取率的影响
微波功率对蒲桃叶总黄酮提取率的影响见图3。
图3 微波功率对蒲桃叶总黄酮提取率的影响
Fig.3 The effects of microwave power on the extraction rate of total flavonoids from Syzygium jambos leaves
由图3可知，微波功率在300W～400 W时，蒲桃叶中总黄酮提取率随微波功率增大呈快速递增趋势；在400W～700W总黄酮提取率随微波功率增大呈缓慢递减趋势。这可能是因为随着微波功率的逐步增大，溶液温度升高导致蒲桃叶细胞中总黄酮的溶出加快、提取率升高。但温度过高会使总黄酮的分子结构遭到破坏，导致总黄酮的提取率下降[21]。因此，选择微波功率为300 W～500 W进行下一步的响应面试验优化。
2.1.4 微波时间对总黄酮提取率的影响
微波时间对蒲桃叶总黄酮提取率的影响见图4。
由图4可知，微波时间在2 min～4 min时总黄酮提取率随微波时间延长呈快速递增趋势；在4 min～10 min时总黄酮提取率随微波时间延长呈递减趋势，变化幅度趋缓。可能是由于在一定时间范围内，蒲桃叶细胞所吸收微波能增多，细胞温度随之增高，总黄酮提取率也增高，但微波时间过长，可能会破坏蒲桃叶总黄酮的分子结构，并且细胞中其他醇溶性物质溶出增大，导致总黄酮的提取率下降[22]。因此，选择微波时间为2、4、6 min进行下一步的响应面试验优化。
图4 微波时间对蒲桃叶总黄酮提取率的影响
Fig.4 The effects of microwave time on the extraction rate of total flavonoids from Syzygium jambos leaves
2.2 响应面优化
2.2.1 响应面试验结果与分析
基于单因素试验结果，建立四因素三水平响应面试验进一步优化总黄酮的提取工艺。试验设计与结果见表2。
表2 响应面试验设计与结果
Table 2 Design and results of response surface methodology
试验号 A B C D Y总黄酮提取率/%1 0 1 1 0 4.93 2 -1 0 -1 0 4.08 3 0 0 -1 -1 4.21 4 0 1 0 1 4.72 5 -1 1 0 0 4.68 6 -1 0 0 -1 4.43 7 1 1 0 0 4.46 8 0 -1 -1 0 4.46 9 0 0 0 0 5.14 10 -1 0 0 1 4.30 11 0 0 1 1 4.35 12 0 0 0 0 5.12 13 1 0 1 0 4.19 14 0 -1 0 -1 4.71 15 1 0 0 1 4.25 16 0 0 -1 1 4.05 17 0 0 0 0 5.12 18 1 0 0 -1 4.32 19 0 0 0 0 5.11 20 -1 -1 0 0 4.55 21 0 1 -1 0 4.10 22 0 0 1 -1 4.58 23 0 1 0 -1 4.61 24 -1 0 1 0 4.58 25 1 0 -1 0 4.05 26 1 -1 0 0 4.49 27 0 0 0 0 5.02 28 0 -1 1 0 4.50 29 0 -1 0 1 4.35
2.2.2 方差分析和二次多项回归方程拟合
利用Design-Expert 8.0.6软件对表2数据进行二次多元回归分析，得到响应值与各因素的回归方程Y=5.10-0.072A+0.037B+0.18C-0.070D-0.040AB-0.090AC+0.015AD+0.20BC+0.12BD-0.018CD-0.42A2-0.15B2-0.46C2-0.36D2，对二次多元回归方程进行方差分析，如表3所示。
由表3可知，模型的F值为87.99、P值＜0.000 1，说明模型极显著；失拟项P值为0.452 3，影响不显著，说明非试验因素对试验结果影响不大；A（乙醇体积分数）对蒲桃叶总黄酮提取率有极显著影响，B（液料比）对蒲桃叶总黄酮提取率有显著影响，C（微波功率）对蒲桃叶总黄酮提取率有极显著影响，D（微波时间）对蒲桃叶总黄酮提取率有极显著影响。二次项A2、B2、C2、D2均达到极显著水平（P＜0.001）。各因素的影响顺序依次为微波功率＞乙醇体积分数＞微波时间＞液料比。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：*表示有显著差异（0.01＜P＜0.05）；**表示有高度显著差异（0.001＜P＜0.01）；***表示有极显著差异（P＜0.001）；NS表示无显著差异（P＞0.05）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 3.200 14 0.230 87.99 ＜0.000 1 ***A乙醇体积分数 0.062 1 0.062 23.73 0.000 2 ***B液料比 0.016 1 0.016 6.21 0.025 8 *C微波功率 0.400 1 0.400 152.47 ＜0.000 1 ***D微波时间 0.059 1 0.059 22.64 0.000 3 ***AB 0.006 1 0.006 2.46 0.138 8 NS AC 0.032 1 0.032 12.47 0.003 3 **AD 0.001 1 0.001 0.35 0.565 5 NS BC 0.160 1 0.160 60.07 ＜0.000 1 ***BD 0.055 1 0.055 21.26 0.000 4 ***CD 0.001 1 0.001 0.47 0.503 5 NS A2 1.130 1 1.130 436.52 ＜0.000 1 ***B2 0.140 1 0.140 52.93 ＜0.000 1 ***C2 1.350 1 1.350 518.33 ＜0.000 1 ***D2 0.820 1 0.820 315.76 ＜0.000 1 ***残差 0.036 14 0.003失拟项 0.027 10 0.003 1.24 0.452 3 NS纯误差 0.009 4 0.002总离差 3.240 28
2.2.3 交互作用分析
各因素交互作用的响应面和等高线图如图5所示。
图5 各因素交互作用对总黄酮提取率的影响
Fig.5 Effects of interactions factors on extraction rate of total flavonoids
由图5可知，各响应面均开口向下，且曲面平滑，各响应面上均存在最大响应值。随着各因素水平在一定范围的增大，蒲桃叶总黄酮提取率均呈现先升后降的趋势。综合响应面和等高线图可知，微波功率方向等高线密度较其他方向密集，可见在设定的各因素水平范围内，微波功率的变化较其它因素对蒲桃叶总黄酮提取率影响更大。在交互作用的影响下，液料比和微波功率、液料比和微波时间、乙醇体积分数和微波功率交互作用影响显著，乙醇体积分数和液料比、乙醇体积分数和微波时间、微波功率和微波时间交互影响不显著，这与表3中交互项P值分析结果一致。
2.2.4 验证试验
根据响应面模型和结果分析，得到蒲桃叶总黄酮的最佳提取条件为乙醇体积分数58.89%、液料比53.11∶1（mL/g）、微波功率 428.14 W、微波时间 3.89 min，此条件下蒲桃叶总黄酮提取率为5.14%。根据实际可操作性，将试验条件调整为乙醇体积分数59%、液料比 53∶1（mL/g）、微波功率 400 W、微波时间 3.9 min，在此条件下进行3次验证试验，蒲桃叶中总黄酮的提取率均值为5.13%，该结果接近预测值，说明该模型可以用于拟合分析。
2.3 蒲桃叶总黄酮体外抗氧化能力
蒲桃叶总黄酮、VC对羟基自由基、DPPH自由基的清除率如图6、图7所示。
图6 不同浓度梯度蒲桃叶总黄酮和VC对羟基自由基的清除率
Fig.6 Scavenging rate of hydroxyl radicals by total flavonoids from Syzygium jambos leaves and VCat different concentration gradients
图7 不同浓度梯度蒲桃叶总黄酮和VC对DPPH自由基的清除率
Fig.7 Scavenging rate of DPPH free radicals by total flavonoids from Syzygium jambos leaves and VCat different concentration gradients
由图 6 可知，溶液浓度在 20 μg/mL～260 μg/mL 之间，蒲桃叶总黄酮、VC的抗氧化能力随浓度增大呈现递增趋势，并在该区间内呈现良好的线性关系，由此计算出蒲桃叶总黄酮对羟基自由基的半数抑制浓度（IC50值）为120 μg/mL，VC对羟基自由基的 IC50值为190 μg/mL，蒲桃叶总黄酮对羟基自由基的清除能力强于VC。
由图7可知，在2 μg/mL～16 μg/mL浓度范围内，蒲桃叶总黄酮、VC的抗氧化能力也逐渐增强，并在该区间内呈现良好的线性关系，由此计算出蒲桃叶总黄酮对 DPPH 自由基的 IC50值为 9.19 μg/mL，VC对DPPH自由基的IC50值为8.35 μg/mL，蒲桃叶总黄酮对DPPH自由基的清除能力稍弱于VC。
3 结论
本文采用微波辅助工艺提取蒲桃叶总黄酮，基于单因素试验，设计响应面试验，优化得到最佳提取工艺条件：乙醇体积分数 59%、液料比 53∶1（mL/g）、微波功率400 W、微波时间3.9 min。此条件下蒲桃叶总黄酮实际提取率为5.13%。提取的蒲桃叶总黄酮对羟基自由基、DPPH 自由基的 IC50值分别为 120、9.19 μg/mL，蒲桃叶总黄酮呈现良好的体外抗氧化性能，本研究为其今后作为天然抗氧化剂应用于食品等领域提供数据支撑。
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