番茄红素（lycopene）是目前自然界抗氧化能力极强的一种天然红色开链烃类胡萝卜素，其抗氧化活性是维生素E的100倍[1]，具有预防癌症、保护心脑血管、提高免疫力等生理功能[2-4]。由于人类和动物都不能产生天然番茄红素，所以食物是其唯一的获取源。天然番茄红素广泛分布于番茄、西瓜、芒果、葡萄、番石榴、柑橘等果实中[4-6]。番茄又称西红柿，是重要的保健和功能性蔬菜食品，能补充人体所需要的大量元素，作为食用性蔬果在食品和保健品方面被广泛利用，最主要的保健功能成分是类胡萝卜素[7]。红葡萄柚是一种重要的柑橘品种，果汁酸甜适度，营养成分全面而丰富，加工而成的饮品在国内外有较大的市场竞争力[8]。番石榴果味清甜，营养成分丰富，含有多种矿物质及微量元素，广泛用于食品加工业，主要是为了增加食品中维生素C的含量，它也是一种新型的抗氧化膳食纤维[9-10]。西瓜甘甜多汁，清爽解渴，食用安全，含有多种生理活性物质，其中番茄红素的含量最高，不需要其他工艺就可以直接被人体吸收[11-12]。
复合果蔬酒以日常生活中常食用的果蔬为原料通过微生物发酵制备而成，含有多种营养物质、抗氧化物质及有机酸，能够调节人体的新陈代谢，以其特有的风味和品质在激烈的酒类市场中有一定竞争力[13-14]。复合果蔬酒是利用两种或多种水果及蔬菜通过微生物酿造而成的低酒精度饮品，经过酿造工艺优化后能够综合几种原料的香味、风味物质及营养成分，使产品的口感、香气及滋味更加丰富[15-17]。基于此，本试验运用模糊数学感官评价法，以番茄、红葡萄柚、番石榴和西瓜为原料，进行响应面优化试验设计，探索复合果蔬酒感官评分和番茄红素含量最高时的最优配比，为番茄、红葡萄柚、番石榴和西瓜资源的开发利用提供一定的参考，为新型复合果蔬酒的研发、酿造提供数据支撑和指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜番茄、红葡萄柚、番石榴、西瓜、白砂糖：市售；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CICC31482：宜宾职业技术学院菌种保藏中心；亚硫酸钠、D-异抗坏血酸钠（食品级）：桂林宝钻食品有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
BS210S型电子分析天平：北京赛多利斯天平有限公司；DHP-9162型电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；W-CJ-2FD型超净工作台：苏州净化设备有限公司；SPHs-3c型精密pH计：上海理达仪器厂；723型紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；LXJ-IIB低速大容量多管离心机：郑州长城工贸有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 复合果蔬酒的酿造工艺流程
新鲜水果→分选→清洗→去皮（去籽）→榨汁→4种果汁混合→添加白砂糖、亚硫酸钠、D-异抗坏血酸钠→调整pH值→接种酿酒酵母→主发酵→分离→贮存→过滤→成品。
操作要点按照刘琨毅等[16]优化后的复合果酒酿造工艺进行。
1.3.2 响应面试验
以番茄汁、红葡萄柚汁、番石榴汁和西瓜汁的添加量为自变量，设定番茄汁添加量（A）、红葡萄柚汁添加量（B）、番石榴汁添加量（C）和西瓜汁添加量（D）为4个参数，其中，A+B+C+D=100%，以番茄红素的含量和感官评分为响应值进行D-最优混料设计试验，番茄汁、红葡萄柚汁、番石榴汁和西瓜汁选定范围如表1所示。
表1 复合果蔬酒设计因素及目标范围
Table 1 Design factors and target range of compound fruit and vegetable wine
因素 低值/% 高值/%A 10 70 B 10 70 C 10 70 D 10 70
1.3.3 番茄红素的提取工艺
番茄红素的提取工艺参照徐媛等[18]提取红葡萄柚番茄红素的工艺略作修改：准确吸取10 mL复合果蔬酒于100 mL三角瓶中，加入15 mL 95%乙醇，预处理30 min，12 000 r/min离心 10 min（4℃），所得沉淀物用石油醚于恒温振荡器中30℃、180r/min避光浸提3.8h；浸提后避光静置10 min，有机相即为番茄红素提取液。
1.3.4 番茄红素的测定方法
复合果蔬酒番茄红素的测定方法参照张连富等[19]建立的番茄红素简便测定方法进行。
1.3.5 感官评价方法
复合果蔬酒的感官评价方法，参照刘琨毅等[16]对柑橘枸杞复合果酒感官评价的方法及GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[20]中规定果酒的感官评价方法。复合果蔬酒的感官评价方法分为4个部分，满分100分。试验邀请10名具有高级品酒师职业资格证书的专业人士进行感官评价。复合果蔬酒感官评分标准见表2。
表2 复合果蔬酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standard of compound fruit and vegetable wine
指标评定标准优良中差色泽浑浊，无光泽，有明显悬浮物（0～5分）香气（25分） 果香与酒香浓郁协调，无异味（19分～25分）形态色泽（20分）色泽亮红有光泽，澄清透明，悦目协调（16分～20分）色泽呈红色，较为澄清，无悬浮物，光泽度一般（11分～15分）色泽暗红，较浑浊，光泽度较差（6分～10分）酒质寡淡，不爽口，异杂味明显（0～9分）典型性（20分） 风格优雅独特（16分～20分） 风格良好（11分～15分） 风格普通（6分～10分） 风格无典型性（0～5分）果香与酒香不足且香气不协调（0～6分）滋味（35分） 酒体丰满，醇厚，爽口，无异杂味（28分～35分）果香与酒香浓郁，较为协调，无异味（13分～18分）果香与酒香不足，稍有异味（7分～12分）酒质较为柔顺，爽口，无异杂味（19分～27分）酒质较为柔顺，欠爽口，有异味（10分～18分）
1.3.6 理化指标分析
总糖采用直接滴定法[21]测定；总酸采用电位滴定法[22]测定；酒精度采用密度瓶法[23]测定；干浸出物采用密度瓶法[20]测定。
1.4 模糊数学评价模型的建立
模糊数学评价模型建立参考文献[24-25]。
1.4.1 评价因素集U的确定
设复合果蔬酒评价因素集 U={U1，U2，U3，U4}，U1代表形态色泽、U2代表香气、U3代表滋味、U4代表典型性。
1.4.2 评价等级集V的确定
设评价等级集V={V1，V2，V3，V4}，V1代表优、V2代表良、V3代表中，V4代表差，对应分数为 100、75、50、25，即V={100，75，50，25}。
1.4.3 评价权重集X的确定
形态色泽、香气、滋味、典型性是构成感官评价复合果蔬酒的因素。根据“主观赋权法”和复合果蔬酒感官评分标准 （表 2） 得到权重 X={X1，X2，X3，X4}={0.20，0.25，0.35，0.20}。
1.4.4 模糊评定矩阵的建立
10名感官评定员对复合果蔬酒按形态色泽、香气、滋味、典型性4个因素逐一评价，统计各质量因素在每个等级中的票数，进行归一化，得到复合果蔬酒的感官评价模糊关系矩阵R；对各组指标数据结果建立隶属度矩阵，根据模糊变换原理Y=XR，获取各个试验组的结果[26]。
1.4.5 评定结果
对各个模糊矩阵的结果进行赋值。将模糊向量单值化排序与赋值结果相乘后求和，最终得到每个试验组的得分[24-25]。
1.5 数据处理
通过SPSS（20.0）软件分析数据，得出结果，用平均值±标准差表示，显著性差异比较通过单因素方差分析得出，P＜0.05为差异显著；采用Design Expert（8.0.6）绘图。所有试验重复3次。
2 结果与分析
2.1 模糊数学综合评判结果
10位感官评定专家分别对复合果蔬酒形态色泽、香气、滋味和典型性4个考察指标进行感官评定，试验号为1的复合果蔬酒的感官评定结果（各等级评定人数）见表3。
表3 试验号为1的复合果蔬酒感官评定结果
Table 3 Sensory evaluation results of compound fruit and vegetable wine with test No.1
感官指标 评定等级优良中差形态色泽 4 3 2 1香气 5 3 2 0滋味 6 2 1 1典型性 6 2 2 0
由表3试验结果可知，10位感官评定小组中有4位专家认为试验号为1的复合果蔬酒形态色泽等级为优，3位认为良，2位认为中，1位认为差。所以R形态色泽={0.4，0.3，0.2，0.1}，同理可得 R香气={0.5，0.3，0.2，0}，R滋味={0.6，0.2，0.1，0.1}，R典型性={0.6，0.2，0.2，0}。将上述指标转化为矩阵，即：
根据模糊变化原理Y=XR，即试验号1的评价结果为：Y1=XR1={0.20，0.25，0.35，0.20}×
将试验号为1的数据模糊向量单值化及赋值得到其得分为81.50，以该方法对20个试验小组进行综合模糊评判。
2.2 响应面试验优化结果
2.2.1 响应面试验设计与结果
以复合果蔬酒的番茄红素含量和感官评分为响应值，根据D-最优混料设计原理，通过Design Expert 8.0.6软件设计响应面法试验，考察番茄汁（A）、红葡萄柚汁（B）、番石榴汁（C）、西瓜汁（D）4个因素对复合果蔬酒番茄红素含量和感官评分的影响，响应面试验结果如表4所示。
表4 复合果蔬酒原料配比条件优化响应面试验设计及结果
Table 4 Design and results of response surface methodology for optimization of raw material ratio of compound fruit and vegetable wine
试验号 A番茄汁/%感官评分1 17.50 47.50 17.50 17.50 14.98 81.50 2 10.00 10.00 40.00 40.00 16.38 89.00 3 17.50 17.50 17.50 47.50 16.44 88.80 4 10.00 10.00 70.00 10.00 14.88 80.80 5 40.00 40.00 10.00 10.00 15.39 83.60 6 10.00 40.00 10.00 40.00 16.27 88.40 7 40.00 40.00 10.00 10.00 15.47 84.00 8 10.00 10.00 40.00 40.00 16.24 88.20 9 70.00 10.00 10.00 10.00 15.67 85.10 10 10.00 40.00 40.00 10.00 14.51 78.80 11 10.00 10.00 10.00 70.00 16.41 92.40 12 47.50 17.50 17.50 17.50 16.14 87.60 13 17.50 17.50 47.50 17.50 15.06 81.80 14 40.00 10.00 10.00 40.00 16.08 87.30 15 40.00 10.00 40.00 10.00 15.85 86.10 16 10.00 70.00 10.00 10.00 14.37 78.10 17 40.00 10.00 10.00 40.00 15.87 86.20 18 10.00 40.00 40.00 10.00 14.55 79.00 19 30.00 30.00 30.00 10.00 15.18 82.50 20 10.00 40.00 10.00 40.00 16.04 87.10 B红葡萄柚汁/%C番石榴汁/%D西瓜汁/%番茄红素含量/（μg/mL）
2.2.2 响应面模型的建立与方差分析
利用Design Expert 8.0.6软件对表4中的数据进行多元回归拟合，得到复合果蔬酒番茄红素含量（Y1）和感官评分（Y2）的回归方程：Y1=15.65A+14.35B+14.86C+16.45D+1.67AB+2.30AC-0.28AD-0.35BC+3.04BD+2.64CD-5.98ABC+37.99ABD+13.75ACD-56.89BCD，Y2=85.10A+78.10B+80.80C+92.39D+8.80AB+12.60AC-8.00AD-2.20BC+10.00BD+8.00CD-25.98ABC+198.72ABD+62.69ACD-308.48BCD。
上述回归方程对应的方差分析见表5和表6所示。
表5 番茄红素回归模型的方差分析
Table 5 Analysis of variance of lycopene regression model
注：*表示差异显著（P＜0.05）；**表示差异极显著（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 8.820 13 0.680 42.56 ＜0.000 1 **AB 0.170 1 0.170 10.96 0.016 2 *AC 0.220 1 0.220 13.83 0.009 9 **AD 0.005 1 0.005 0.30 0.605 5 BC 0.008 1 0.008 0.48 0.514 2 BD 0.580 1 0.580 36.36 0.000 9 **CD 0.440 1 0.440 27.43 0.001 9 **ABC 0.035 1 0.035 2.19 0.189 0 ABD 0.110 1 0.110 6.99 0.038 4 *ACD 0.014 1 0.014 0.90 0.380 5 BCD 0.250 1 0.250 15.68 0.007 5 **残差 0.096 6 0.016失拟项 0.033 1 0.033 2.68 0.162 7纯误差 0.062 5 0.012总离差 8.920 19
表6 感官评分的回归模型方差分析
Table 6 Regression model analysis of variance of sensory score
注：*表示差异显著（P＜0.05）；**表示差异极显著（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 295.63 13 22.74 72.94 ＜0.000 1 **AB 4.84 1 4.84 15.54 0.007 6 **AC 6.62 1 6.62 21.22 0.003 7 **AD 4.00 1 4.00 12.83 0.011 6 BC 0.30 1 0.30 0.98 0.361 4 BD 6.26 1 6.26 20.06 0.004 2 **CD 4.00 1 4.00 12.84 0.011 6 *ABC 0.66 1 0.66 2.12 0.195 6 ABD 3.05 1 3.05 9.78 0.020 4 *ACD 0.30 1 0.30 0.95 0.366 8 BCD 7.35 1 7.35 23.57 0.002 8 **残差 1.87 6 0.31失拟项 ＜0.01 1 ＜0.01 ＜0.01 0.968 1纯误差 1.87 5 0.37总离差 297.50 19
根据方差分析（表5），番茄红素含量的响应面模型具有极显著的差异性（P＜0.01），失拟项不显著（P=0.162 7＞0.05），表明模型拟合程度较好、误差较小，可以利用该响应面模型优化复合果蔬酒具有较高番茄红素含量时的主料配比。该模型的复相关系数（R2=0.989 3＞0.9）和校正决定系数（R2adj=0.966 0＞0.9）表明此模型能够较合理分析响应值的变化，试验重复性好。从方差分析的显著性可知，交互项AD、BC、ABC和ACD对复合果蔬酒番茄红素含量的影响不显著（P＞0.05）；交互项AB、ABD对复合果蔬酒番茄红素含量的影响为显著（P＜0.05），交互项AC、BD、CD和BCD 对番茄红素含量的影响达到了极显著水平（P＜0.01）。
各原料配比的交互作用对番茄红素含量所形成的等高线如图1所示。等高线越趋近于椭圆形，表明因素之间的交互作用对番茄红素含量的影响越显著，反之趋近于圆形则不显著[18]。
图1 各原料配比的交互作用对番茄红素含量影响的等高线图
Fig.1 Contour map of the interaction of raw material ratio on the content of lycopene
由图1可知，因素B（红葡萄柚汁）、C（番石榴汁）和D（西瓜汁）之间的交互作用对番茄红素含量所形成的等高线与其他因素的交互作用所形成的等高线相比更趋向于椭圆形，表明因素B、因素C与因素D的交互作用对复合果蔬酒番茄红素含量的影响最大。该结果与表5方差分析所得结果一致，交互项BCD对复合果蔬酒番茄红素含量的影响为极显著（P＜0.01）。
由感官评分（Y2）回归方程的方差分析（表6）知，复合果蔬酒感官评分的响应面模型具有极显著的差异性（P＜0.01），失拟项不显著（P=0.968 1＞0.05），表明模型拟合程度较好、误差较小，可以利用该模型优化复合果蔬酒的感官评分。回归方程多项式中的交互项AD、BC、ABC和ACD对复合果蔬酒感官评分的影响不显著（P＞0.05）；交互项 CD、ABD 对复合果蔬酒感官评分的影响为显著（P＜0.05），交互项 AB、AC、BD 和BCD对感官评分的影响为极显著（P＜0.01）。此外，该模型的复相关系数（R2=0.993 7＞0.9）和校正决定系数（R2adj=0.980 1＞0.9）表明此模型能够较合理分析复合果蔬酒感官评分的变化，试验重复性好。
各原料配比的交互作用对感官评分所形成的等高线如图2所示。
由图2可知，因素B（红葡萄柚汁）、C（番石榴汁）和D（西瓜汁）之间的交互作用对复合果蔬酒感官评分所形成的等高线与其他因素的交互作用所形成的等高线相比更趋向于椭圆形，表明因素B、因素C与因素D的交互作用对复合果蔬酒感官评分的影响最大。该结果与方差分析（表6）中只有交互项BCD对复合果蔬酒感官评分的影响到达了极显著水平（P＜0.01）的结论相一致。
图2 各原料配比的交互作用对感官评分影响的等高线图
Fig.2 Contour map of the interaction of raw material ratio on sensory score
2.3 原料配比验证试验
根据响应面分析，复合果蔬酒在番茄汁26.718%、红葡萄柚汁27.220%、番石榴汁10.000%、西瓜汁36.062%条件下，感官评分可获得最高的理论值94.146；在番茄汁27.775%、红葡萄柚汁27.919%、番石榴汁10.000%、西瓜汁34.305%的条件下，番茄红素含量可达到最高的理论值17.432 μg/mL。考虑到实际操作条件，将4种果汁的添加量略作修正，后续分别对番茄汁26.7%、红葡萄柚汁27.2%、番石榴汁10.0%、西瓜汁36.1%（验证试验1），以及番茄汁27.8%、红葡萄柚汁27.9%、番石榴汁10.0%、西瓜汁34.3%（验证试验2）进行3组平行试验。复合果蔬酒在验证试验1的条件下，其感官评分与番茄红素含量分别为94.1±1.3与（17.45±0.86）μg/mL；在验证试验 2的条件下，复合果蔬酒的感官评分与番茄红素含量分别为92.8±1.0与（17.31±0.52）μg/mL。因此，通过比较两组验证试验的结果，复合果蔬酒在验证试验1的条件下可获得最高的感官评分与番茄红素含量。
2.4 复合果蔬酒理化指标
在最优条件下得到的复合果蔬酒总糖为（9.71±0.23）g/L，总酸为（0.51±0.06）g/100 mL，酒精度为（7.93±0.31）%vol，干浸出物为（26.14±1.59）g/L。上述4项指标均符合QB/T 5476—2020《果酒通用技术》要求[27]。
3 结论
经过模糊数学评价法和响应面试验，得到由番茄汁、红葡萄柚汁、番石榴汁、西瓜汁4种果汁原料酿造复合果蔬酒的最优配比（26.7%番茄汁、27.2%红葡萄柚汁、10.0%番石榴汁和36.1%西瓜汁）。将4种果蔬汁按照最优配比混合后，调整初始pH值为6.0与糖度为28%，加入0.02%亚硫酸钠与0.1%D-异抗坏血酸钠，于发酵瓶中巴氏灭菌30 min；按5%接种量接入扩大培养的酿酒酵母悬液，23℃静置发酵，观察无气泡产生则主发酵完成，分桶后进行低温贮藏。经澄清处理后，复合果蔬酒色泽红亮透明、果香与酒香浓郁、滋味醇和，感官评分与番茄红素含量分别为94.1±1.3与（17.45±0.86）μg/mL，各项理化指标符合QB/T 5476—2020《果酒通用技术》。该结果可为同类复合果蔬酒产品标准化、工业化生产提供参考。
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