核桃仁富含油脂、蛋白质、糖类和维生素等多种营养成分，具有极高的开发利用价值。核桃仁加工制成的核桃乳色泽乳白、香味浓郁，是一种新型的营养饮料[1]。核桃仁对于预防动脉粥样硬化等心血管疾病、美容、抗衰老等起着重要作用[2]。乳酸菌是一类能发酵糖产生乳酸的革兰氏阳性细菌的总称[3]，研究表明，乳酸菌及发酵产物能提高免疫力[4]，维持肠道菌群平衡[5]，降低胆固醇含量，并对胃病、糖尿病和心血管疾病等[6]有一定预防作用。乳酸菌能够降解核桃乳中的蛋白质，使制品的风味更加醇厚。发酵核桃乳中含有对人体有益的乳酸菌，具有肠道保健功能[7-8]，丰富了市场上植物蛋白饮料的品种[9]。近年来，有关乳酸菌[10-12]发酵植物蛋白饮料的研究成为热门，在现有发酵核桃乳[13-15]的研制工艺中，许多学者在发酵基料中加入了牛奶、乳清粉等动物蛋白以促进益生菌发酵[16]，或直接以脱脂核桃粕为原料[17-18]，对发酵过程中的工艺参数进行了探究，并对发酵核桃乳的营养价值进行了初步探究。本研究采用河北科技大学食品与生物学院饮料酒酿造研究室分离筛选出的乳酸菌（植物乳杆菌亚种KDLLL1-1和意大利肠球菌KDLLJ3-1）发酵核桃乳，以核桃乳饮料酸度为评价指标，研究乳酸菌发酵核桃乳饮料的最佳工艺条件，为发酵核桃乳饮料工业化生产奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 乳酸菌
植物乳杆菌亚种（Lactobacillus plantarum subsp.）KDLLL1-1、意大利肠球菌（Enterococcus italica）KDLLJ3-1：河北科技大学食品与生物学院饮料酒酿造研究室分别从羊羔美酒大曲和开菲尔粒中分离筛选得到，经过重复序列聚合酶链式反应技术和16S rDNA序列分析得到基因序列，在GeneBank数据库中登陆，经BLAST相似性比对确定属种，登录号分别为KC454277和KJ890357。
核桃乳：河北绿岭康维食品有限公司。
1.1.2 试剂
蛋白胨、酵母提取物、琼脂：北京奥博星生物技术有限公司；牛肉膏、MgSO4·7H2O：天津市光复精细化工研究所；葡萄糖：天津市科密欧化学试剂开发中心；CH3COONa·3H2O：天津市标准科技有限公司；K2HPO4·3H2O、H2MnO5S：天津市永大化学试剂厂；C6H8O7·3H3N：天津市百世化工有限公司；吐温80：天津市凯通化学试剂有限公司；NaOH：天津市大陆化学试剂厂；酚酞：天津市大茂化学试剂厂。所有化学试剂均为分析纯。
1.1.3 仪器与设备
DH300电热恒温培养箱、DK-98-11电子调温万用电炉：天津市泰斯特仪器有限公司；B1-220A麦克奥迪显微镜：Motic实业集团有限公司；PL203电子天平：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；Delta320 pH计：深圳市凯铭杰仪器设备有限公司；SW-CJ-1FDA超净工作台：北京华威中仪科技有限公司；DK-98-1电热恒温水浴锅：河南省巩义市英峪予华仪器厂；LC-20A高效液相色谱仪、RID-10A紫外检测器、LC-20ATA/B串联泵：日本岛津公司。
1.2 方法
1.2.1 发酵核桃乳酸度的测定
采用酚酞指示剂法进行酸度测定，具体参照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》。
1.2.2 发酵核桃乳饮料单因素试验
1.2.2.1 碳源种类的选择
以发酵核桃乳酸度为指标，将乳清粉、蔗糖分别按20 g/L的添加量加入到核桃乳中，按照植物乳杆菌亚种：意大利肠球菌=2∶1（菌悬液体积比），接种量9%，34℃发酵18 h。同时以不添加碳源（以水替代）作为对照，考察碳源种类对发酵核桃乳酸度的影响。
1.2.2.2 碳源添加量的选择
以乳酸菌接种量9%，34℃发酵10 h，考察碳源添加量（5、10、20、30、40 g/L）对发酵核桃乳酸度的影响。
1.2.2.3 乳酸菌接种量的选择
以碳源添加量20 g/L，34℃发酵10 h，考察乳酸菌接种量（5%、7%、9%、11%、13%）对发酵核桃乳酸度的影响。
1.2.2.4 发酵温度的选择
以乳酸菌接种量9%和碳源添加量20 g/L，发酵10 h，考察发酵温度（28、31、34、37、40 ℃）对发酵核桃乳酸度的影响。
1.2.3 响应面法优化试验
在单因素试验的基础上，以乳酸菌接种量、发酵温度、碳源添加量为3个考察因素，发酵核桃乳酸度为考察指标，利用Design-Expertv8.0.6.1软件进行Box-Behnken响应面分析和优化，响应面试验因素与水平见表1。
表1 响应面试验因素水平
Table 1 The factor and level of response surface test
水平编码A乳酸菌接种量/%B发酵温度/℃C碳源添加量/（g/L）-1 9 34 20 0 11 37 30 1 13 40 40
1.2.4 发酵核桃乳的感官评价
由10名经过训练具有感官评定经验的人员对发酵核桃乳进行感官评价，结果取平均值。发酵核桃乳感官评分标准见表2。
表2 发酵核桃乳感官评分标准
Table 2 Sensory scoring standards for fermented walnut milk
项目 评分标准 评分值色泽 乳白色或白色微显灰色 优（14分～15分）（15分） 灰白色 良（11分～13分）灰色 中（8分～10分）青灰色 差（0～7分）风味 具有浓郁的发酵核桃香气，无异味 优（27分～30分）（30分）具有核桃乳香气，略带发酵香气，无异味 良（22分～26分）核桃乳香气和发酵香气平淡，略带其他气味中（16分～21分）核桃乳香气和发酵香气微弱，有明显异味 差（0～15分）口感 具有核桃乳特有滋味，且细腻爽滑 优（35分～40分）（40分） 发酵核桃乳特有的滋味较淡，略感爽滑 良（28分～34分）有发酵核桃乳的滋味，滋味平淡 中（21分～27分）发酵核桃乳的滋味不明显，口感粗糙 差（0～20分）组织 组织均匀一致，细腻 优（14分～15分）形态 组织基本均匀，无分层 良（11分～13分）（15分） 组织不均匀，略有分层 中（8分～10分）组织不均匀，分层明显 差（0～7分）
1.3 数据处理
所有试验均做3个平行，取平均值，利用Origin8.5软件作图，通过SPSS22.0统计软件进行数据统计分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 碳源种类对发酵核桃乳酸度的影响
碳源种类对发酵核桃乳酸度的影响结果见图1。
图1 碳源种类对发酵核桃乳酸度的影响
Fig.1 The effect of carbon source types on the acid degree of fermented walnuts
由图1可见，未添加碳源和添加蔗糖时发酵过程中乳酸菌产酸效果较差，相比之下，添加乳清粉时乳酸菌产酸效果明显，乳清粉与蔗糖相比含有更多种营养物质，如蛋白质和一些小分子物质。从工业化生产角度考虑，乳清粉价格比较低廉，所以最终选取乳清粉为碳源。
2.1.2 碳源添加量对发酵核桃乳酸度的影响
碳源添加量对发酵核桃乳酸度的影响结果见图2。
图2 不同碳源添加量对发酵核桃乳酸度的影响
Fig.2 The effect of different carbon sources addition on the acid degree of fermented walnuts
如图2所示，碳源添加量在5 g/L～40 g/L范围内，发酵核桃乳酸度随着碳源添加量的增加先上升后下降，其原因可能是由于碳源添加量过大时抑制了乳酸菌的生长，导致发酵过程受到了影响，发酵核桃乳酸度下降，最佳碳源添加量为30 g/L。
2.1.3 乳酸菌接种量对发酵核桃乳酸度的影响
乳酸菌接种量对发酵核桃乳酸度的影响结果见图3。
图3 乳酸菌接种量对发酵核桃乳酸度的影响
Fig.3 Effect of lactic acid bacteria inoculation amount on the acid degree of fermented walnuts
如图3所示，当乳酸菌接种量低于11%时，随乳酸菌接种量的提高，发酵核桃乳酸度逐渐增大。当乳酸菌接种量高于11%时，菌种发酵产酸的效果变差，发酵核桃乳中酸含量下降，可能的原因是乳酸菌接种量过大，导致乳酸菌大量生长繁殖，不利于发酵，从而导致最终酸度有所降低。综上，发酵核桃乳的最佳乳酸菌接种量为11%。
2.1.4 发酵温度对发酵核桃乳酸度的影响
发酵温度对发酵核桃乳酸度的影响结果见图4。
图4 发酵温度对发酵核桃乳酸度的影响
Fig.4 The influence of fermentation temperature on the acid degree of fermented walnuts
发酵温度对乳酸菌发酵核桃乳起到关键性作用。如图4所示，在37℃以下，随发酵温度升高发酵核桃乳酸度增大，当发酵温度超过37℃时，发酵核桃乳酸度会随发酵温度升高而降低，因此最适宜的发酵温度为37℃。
2.2 响应面试验法优化核桃乳发酵工艺条件
发酵条件优化响应面设计方案及结果见表3，方差分析见表4。
表3 发酵条件优化Box-Behnken试验设计与结果
Table 3 Box-Behnken test design and results of optimization of fermentation conditions
试验号 A乳酸菌接种量 B发酵温度 C碳源添加量 Y酸度/°T 1 0 0 0 35.45 2 0 0 0 37.37 3-1 1 0 35.56 4 0 0 0 37.03 5-1 0 33.53 6-1 0 1 31.95 7 1 1 0 33.08 1 8 33.76 9 0 0 0 36.69 0 1 1 10 -1 0 -1 32.06 11 1 0 1 34.21 12 0 -1 -1 31.72 13 0 0 0 37.82 14 -1 -1 0 35.22 15 0 1 -1 32.85 16 1 0 -1 32.52 17 0 -1 1 32.63
表4 以酸度为响应值的回归模型及方差分析
Table 4 Regression model and analysis of variance with acidity as the response value
注：**表示影响极显著（P＜0.01）；*表示影响显著（P＜0.05）。
方差来源 平方和 自由度 均方值 F值 P值模型 56.5 9 6.28 4.45 0.030 9*A 0.26 1 0.26 0.19 0.678 9 B 0.58 1 0.58 0.41 0.542 5 C 1.44 1 1.44 1.02 0.345 1 AB 0.16 1 0.16 0.11 0.749 1 AC 0.81 1 0.81 0.57 0.473 2 BC -7.11×10-15 1 -7.11×10-15-5.04×10-15 1 A2 7 1 7 4.97 0.061 1 B2 6.42 1 6.42 4.55 0.070 3 C2 35.34 1 35.34 25.07 0.001 6**残差 9.87 7 1.41失拟项 6.64 3 2.21 2.74 0.177净误差 3.23 4 0.81总和 66.37 16
采用Design-Expert v8.0.6.1统计软件对表4结果进行多元回归拟合分析，建立二次回归方程：Y=36.87-0.18A+0.27B+0.42C-0.20AB+0.45AC+0.0001BC-1.29A2-1.23B2-2.90C2。
由表 4 可知，该模型 P＜0.05；失拟误差 P＞0.05，即回归模型显著而失拟项不显著，说明发酵核桃乳酸度与各因素的回归模型有统计学意义。方程的决定系数R2=0.851 3，拟合度良好，方程的显著性及可靠性较高。根据F值大小可知，各因素对发酵核桃乳酸度影响的主次因素为C＞B＞A，即碳源添加量＞发酵温度＞乳酸菌接种量。
通过软件进行分析得出最佳工艺条件为乳酸菌接种量10.86%，发酵温度37.34℃，碳源添加量30.7 g/L。在此条件下，发酵核桃乳酸度预测值为36.91°T。考虑到试验的可操作性，修正最佳工艺条件为乳酸菌接种量11%，发酵温度37℃，碳源添加量30 g/L。在此条件下，自选乳酸菌发酵核桃乳饮料酸度达到36.53°T，与预测值接近。说明模型拟合性良好，验证了模型的有效性。
2.3 发酵核桃乳饮料感官评价
发酵核桃乳饮料的感官评价结果见表5。
由表5可知，发酵后的核桃乳，色泽呈现乳白色和淡黄色，气味较未发酵之前有明显的核桃乳发酵香气，口感细腻、酸甜适度，可被大部分感官评价者所接受。经最佳工艺处理后，发酵核桃乳饮料的组织形态均匀、无分层，感官评分为84。
表5 发酵核桃乳的感官评价
Table 5 Sensory evaluation of fermented walnut milk
项目名称 评分 感官描述色泽（15分） 13 白色略带淡黄色，色泽均一风味（30分） 25 具有浓郁的发酵核桃乳香气口感（40分） 36 酸甜可口，具有发酵核桃乳特有滋味，细腻爽滑柔和组织形态（15分） 10 均匀一致，无颗粒总分 84
3 结论
在单因素试验基础上，采用Box-Behnken中心组合设计，通过响应面分析确定自选乳酸菌发酵核桃乳最佳工艺条件：碳源选择乳清粉，添加量为30 g/L，自选植物乳杆菌亚种 KDLLL1-1和意大利肠球菌KDLLJ3-1按照2∶1体积比，接种量为11%，37℃发酵10 h，所得发酵核桃乳饮料酸度为36.53°T，乳白色，细腻、均匀，核桃乳发酵香气独特，酸甜适度。
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