肉品因富含脂肪、蛋白质等营养物质，易发生氧化，严重影响其色泽、质构、风味及营养价值，进而造成经济损失。近些年来，市场上抗氧化剂的使用越来越多，但经研究证明，常用的合成抗氧化剂可诱发肠胃病，甚至是导致癌症，天然抗氧化物相对安全性较高，因此深受广大消费者的青睐[1]。目前，常用的天然抗氧化剂有多酚、维生素、多糖、皂苷四大类，其中多酚类抗氧化物研究较多，主要因其苯环上连接的多羟基结构经相关反应后发挥抗氧化作用，如茶多酚、单宁等[2]。常用的维生素类抗氧化剂如维生素E（vitamin E，VE）、维生素C（vitamin C，VC），通过与其他物质的相互作用及相关基因调控脂类代谢[3]。虾青素是一种类胡萝卜素，存在于各种海洋生物中，它是一种生物抗氧化剂，比维生素E和其他类胡萝卜素具有更强的自由基清除活性[4]。皂苷是苷元为三萜或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷，皂苷主要通过清除自由基、减少细胞损伤、调节氧化应激等机制达到抗氧化的效果[5]。多糖是超过10个单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物，多糖的抗氧化作用主要体现在提高机体抗氧化酶活性、清除体内自由基、抑制脂质过氧化、保护生物膜等方面[3-6]。
目前，天然抗氧化物的研究已经比较深入，越来越多研究者通过研究抗氧化物的抗氧化能力，以期将其联合使用，从而使其各有效成分通过多靶点、多环节综合发挥其功效。经陈雪[7]研究，在对DPPH自由基的清除能力测定中，南瓜多糖和人参皂苷复配物要强于单一组。本试验选择具有多酚结构的单宁、人参皂苷、枸杞多糖、虾青素等4种天然抗氧化物在不同浓度下对DPPH、ABTS+、羟基、超氧阴离子等自由基清除能力、金属离子螯合能力、总还原能力、脂质抗氧化能力的影响，为天然抗氧化剂的复配应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
单宁提取物（纯度99%）、人参皂苷提取物（纯度80%）、枸杞多糖提取物（纯度50%）、虾青素提取物（纯度10%）：西安瑞林生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-偶氮二（2-甲基丙基醚）二盐酸盐[2，2'-azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride，AAPH]、2，2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、罗恩试剂、硫酸亚铁、30%过氧化氢（均为分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）、VC、邻二氮菲（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；2-硫代巴比妥酸（分析纯）：上海科丰实业有限公司；邻苯三酚（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
SYNERGY H 1酶标仪（96孔板）：雷康恒泰（北京）商贸有限公司；DHP-9802电热恒温水浴锅：北京长安科学仪器厂；AL204万分之一电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；JC-HW-2涡旋振荡器：北京优晟联合科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品制备
单宁、人参皂苷、枸杞多糖、虾青素分别配制浓度为 5 mg/mL 的溶液，并分别稀释为 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，作为待测样品备用。
1.3.2 DPPH自由基清除能力的测定
参考Kop等[8]的研究方法，取4 g DPPH用无水乙醇定容至100 mL容量瓶内，配制浓度为0.04 mg/mL的DPPH溶液避光放置备用；取0.1 mL样品加入到新配制的3.9 mL DPPH溶液中，混匀，在37℃水浴条件下反应60 min，在517 nm处测吸光度，计算公式如下。
DPPH 自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A3]×100
式中：A1为3.9 mL DPPH+0.1 mL样品的吸光度；A2为3.9 mL乙醇+0.1 mL样品的吸光度；A3为3.9 mL DPPH+0.1 mL乙醇的吸光度。
1.3.3 ABTS+自由基清除能力的测定
参考孙玉姣等[9]的研究方法，取同等体积的7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L K2S2O8溶液，置于100 mL棕色广口瓶中，混合均匀，于室温（20℃）静置12 h～16 h，再用无水乙醇稀释45倍作ABTS工作液（OD734nm=0.7±0.02）备用。取 0.2 mL 样品，加入到 0.8 mL ABTS溶液中，振荡10 s，充分混合后避光静置6 min，在734 nm处测吸光度为A1，以0.2 mL乙醇代替样品为空白组，测得吸光度A0，计算公式如下。
ABTS+自由基清除率/%=（1-A1/A0）×100
1.3.4 羟基自由基清除能力的测定
参考王贺等[10]的方法，取样品2 mL，加入1 mL 0.75 mmol/L邻二氮菲溶液、2 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）（pH7.4），混匀再加入1 mL 0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液、1 mL 0.01%过氧化氢溶液，混匀后在37℃水浴1 h，在536 nm处测吸光度，对照组用蒸馏水代替过氧化氢溶液，空白组用蒸馏水代替样品，计算公式如下。
羟基自由基清除率/%=（As－Ac）/（Ab－Ac）
式中：As为试验样品的吸光度；Ac为对照组的吸光度；Ab为空白组的吸光度。
1.3.5 超氧阴离子自由基清除能力的测定
参考王雅等[11]的研究方法，取2 mL样品、4 mL 0.05 mol/L Tris-HCl溶液（pH8.2），在25℃水浴加热20 min；取出后加入60 μL 25 mmol/L邻苯三酚溶液，充分混匀在25℃水浴加热5 min；取出后加入200 μL 10 mmol/L盐酸溶液，终止反应，在325 nm处测吸光度。
超氧阴离子自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A3]×100
式中：A1为60 μL邻苯三酚+2 mL样品的吸光度；A2为 60 μL 蒸馏水+2 mL 样品的吸光度；A3为 60 μL邻苯三酚+2 mL蒸馏水的吸光度。
1.3.6 金属离子螯合能力
参考齐佳慧等[12]的研究方法，取0.5mL样品、0.1mL 10g/LVC溶液、0.1mL4g/L硫酸亚铁溶液、1mL0.2mol/L氢氧化钠溶液，混匀后，在37℃水浴静置20 min；取出后，加入0.2 mL 10%三氯乙酸溶液，静置10 min，再取0.2 mL上清液，加0.5 mL 1 g/L邻二氮菲溶液，充分混匀，静置10 min，在510 nm处测吸光度。用0.5 mL蒸馏水做空白对照，计算公式如下。
金属离子螯合能力/%=（1-As/Ac）×100
式中：As为样品的吸光度；Ac为空白样的吸光度。
1.3.7 总还原能力
参考齐佳慧等[12]的研究方法，将15.2 mL 0.1 mol/L氢氧化钠溶液和0.68g磷酸二氢钾混匀后定容至100mL，配制成0.2 mol/L pH6.6的磷酸缓冲盐溶液。取0.5 mL不同浓度样品，加入1 mL PBS缓冲液、1 mL 1%铁氰化钾溶液，混匀后，在50℃水浴加热20 min；取出后加入1 mL 10%三氯乙酸溶液充分混匀，终止反应；取1 mL上清液、1 mL蒸馏水、1 mL 0.15%三氯化铁溶液，混匀后，静置20 min；在700 nm处测量吸光度，蒸馏水做空白试验。
总还原能力=A1-A0
式中：A1为样品的吸光度；A0为空白样的吸光度。
1.3.8 脂质抗氧化能力
参考孙玉姣等[9]的研究方法，取0.4 mL 10%蛋黄匀浆液，加入0.2 mL样品，再加入0.2 mL 40 mmol/L AAPH，混匀，37℃温浴1 h，再加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，1 mL 0.67%β-硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA）溶液，100μL2mol/L盐酸，2mL 0.1 mol/L PBS（pH7.4），混匀，95℃水浴 30 min，立即放入冰水浴，冷却，5 000 r/min离心15 min，取上清液，于532 nm处测吸光度，用蒸馏水做空白试验。
脂质抗氧化能力/%=（1-A1/A0）×100
式中：A1为样品的吸光度；A0为空白样的吸光度。
1.4 数据分析
数据采用spss18.0进行平均值、标准差及主成分分析，采用Excel作图。
2 结果与分析
2.1 DPPH自由基清除能力
4种天然抗氧化剂DPPH自由基清除能力的变化见图1。
图1 4种天然抗氧化剂DPPH自由基清除能力的变化
Fig.1 Changes in DPPH free radical scavenging ability of four natural antioxidants
DPPH自由基是一种很稳定的以氮为中心的自由基，可表示对羟基、烷基及过氧化自由基抑制作用[13]。如图1所示，单宁浓度在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL时，对DPPH自由基清除能力在90%以上且随着浓度的增加变化不大，较高于其它3种抗氧化物，可能是由于单宁为多酚类物质，可以更快地从酚或酚阴离子转移电子到DPPH自由基，形成较强的氢键[14]。虾青素、人参皂苷的DPPH自由基清除能力均随浓度增高呈上升趋势，枸杞多糖与人参皂苷在0.4 mg/mL～1.0 mg/mL浓度时，DPPH自由基清除能力差异不明显，清除能力均在18%～34%之间。结果表明，4种天然抗氧化剂皆对DPPH自由基有清除作用，在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL时，单宁清除能力较高。
2.2 ABTS+自由基清除能力
ABTS+自由基清除试验是测定化合物抗氧化能力的重要方法[15]。4种天然抗氧化剂ABTS+自由基清除能力的变化如图2所示，
图2 4种天然抗氧化剂ABTS+自由基清除能力的变化
Fig.2 Changes in the ABTS+free radical scavenging ability of four natural antioxidants
单宁浓度在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL时，对ABTS+自由基清除能力在81%～86%，变化不明显，0.6 mg/mL～1.0 mg/mL时人参皂苷的ABTS+自由基清除能力与单宁相近，浓度在 0.2 mg/mL～1.0 mg/mL，单宁的 ABTS+自由基清除能力高于虾青素组。刘晓培[16]的研究表明单宁纯化物具有较强的ABTS+自由基清除能力。人参皂苷及枸杞多糖的ABTS+自由基清除能力随着浓度的增加呈上升趋势，单宁浓度在0.2 mg/mL～0.8 mg/mL时，对ABTS+自由基清除能力随着浓度的增长而上升，虾青素与枸杞多糖的ABTS+自由基清除能力无明显差异。结果表明，在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL之间4种天然抗氧化剂的ABTS+自由基清除能力为单宁优于其他3种。
2.3 羟基自由基清除能力
4种天然抗氧化剂羟基自由基清除能力的变化见图3。
图3 4种天然抗氧化剂羟基自由基清除能力的变化
Fig.3 Changes in the scavenging ability of four natural antioxidant hydroxyl radicals
羟基自由基是活性氧中最活泼的氧自由基[17]，也是毒性最大的自由基，是造成生物体损伤的主要因素[18]。如图3所示，在0.2 mg/mL～0.6 mg/mL之间的枸杞多糖清除羟基自由基的能力较高于虾青素和人参皂苷，而虾青素、单宁的羟基自由基清除能力无明显差异，根据张丽等[19]研究，枸杞多糖具有较强的羟基自由基清除能力。在浓度为0.8 mg/mL时，4种抗氧化物差异不明显。在样品浓度为1.0 mg/mL时，人参皂苷的羟基自由基清除能力为75.70%，大于其他3种。根据张馨妍等[20]的研究结果显示在西洋参总皂苷提取出的6种人参皂苷皆有较强的羟基自由基清除能力。结果表明，0.2 mg/mL～0.6 mg/mL的枸杞多糖及1.0 mg/mL的人参皂苷具有较好的清除羟基自由基的能力。
2.4 超氧阴离子自由基清除能力
4种天然抗氧化剂超氧阴离子自由基清除能力的变化见图4。
图4 4种天然抗氧化剂超氧阴离子自由基清除能力的变化
Fig.4 Changes in superoxide radical scavenging ability of four natural antioxidants
超氧阴离子自由基是机体内寿命最长的自由基，通常作为自由基链式反应的引发剂，产生活性更强的自由基[21]。如图4所示，浓度在0.4 mg/mL～1.0 mg/mL，人参皂苷对超氧自由基的清除能力高于单宁、枸杞多糖和虾青素，且浓度增大清除能力呈增长趋势，即有一定的计量效应。黄文静等[22]、杨炳伟[23]的研究表明皂苷类对超氧阴离子自由基具有较强的清除能力。单宁、虾青素以及枸杞多糖的超氧阴离子自由基清除能力无明显差异。结果表明，在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL间人参皂苷对超氧阴离子自由基的清除能力较强。
2.5 总还原能力
4种天然抗氧化剂总还原能力的变化见图5。
图5 4种天然抗氧化剂总还原能力的变化
Fig.5 Changes in total reducing power of four natural antioxidants
如图5所示，单宁的总还原能力与其浓度呈正比，具有一定的剂量依赖性，在0.4 mg/mL～1.0 mg/mL，单宁的总还原能力高于枸杞多糖、人参皂苷、虾青素，根据Zargar等[24]研究，提取于金合欢、尤金妮亚、菩提树、银合欢、番石榴等植物树叶的单宁具有较强的还原性。而枸杞多糖的总还原能力又高于人参皂苷和虾青素，人参皂苷和虾青素的总还原能力无明显差异。结果表明，在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL 4种天然抗氧化物的总还原能力：单宁优于枸杞多糖及人参皂苷、虾青素。
2.6 金属离子螯合能力
4种天然抗氧化剂金属离子螯合能力的变化见图6。
图6 4种天然抗氧化剂金属离子螯合能力的变化
Fig.6 Changes in metal ion chelating ability of four natural antioxidants
金属离子在有机体内具有多样的配位作用和重要的催化作用，当金属离子与有机配体形成稳定的螯合物后，螯合物可以发挥独特的生理生化功能[25]。单宁是一种水溶性的多羟基物质，对金属具有较强的螯合作用[26]。如图6所示，通过对4种天然抗氧化剂金属离子螯合能力分析，随浓度升高4种抗氧化剂螯合金属离子能力均呈上升趋势。浓度在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL时，单宁金属离子螯合能力在76%～85%之间，高于枸杞多糖、人参皂苷、虾青素。人参皂苷金属离子螯合能力在50%～62%，高于虾青素和枸杞多糖。虾青素的螯合能力与枸杞多糖无明显差异。结果表明，在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL间4种天然抗氧化物的金属离子鏊合能力：单宁优于人参皂苷、虾青素及枸杞多糖。
2.7 脂质抗氧化能力
4种天然抗氧化剂脂质抗氧化剂能力的变化见图7。
图7 4种天然抗氧化剂脂质抗氧化能力的变化
Fig.7 Changes in lipid antioxidant capacity of four natural antioxidants
自由基引发脂质过氧化并产生丙二醛，丙二醛可与硫代巴比妥酸缩合形成粉红色复合物，该复合物在532 nm处有最大吸收峰，当体系加入抗氧化剂后将使该复合物颜色减弱，进而采用分光光度计测定该抗氧化剂的活性[27]。如图7所示，4种抗氧化物皆随其浓度增高脂质抗氧化能力呈上升趋势，浓度在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL，单宁脂质抗氧化能力较强且具有良好的量效关系，优于枸杞多糖、人参皂苷及虾青素。结果表明，在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL 4种天然抗氧化物的脂质抗氧化能力：单宁＞枸杞多糖＞人参皂苷＞虾青素。
2.8 4种天然抗氧化物抗氧化作用主成分分析
为探究4种天然抗氧化物的DPPH自由基、ABTS+自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基、总还原能力、金属离子螯合能力对抗氧化性贡献差异及其影响作用大小，得到4种天然抗氧化剂主成分特征值、贡献率和累积贡献率，如表1所示。成分得分系数反映抗氧化各指标对主成分影响的相对大小和方向，数值反映原变量对因子影响的大小，正负代表变化方向的差别。4种天然抗氧化物成分得分系数矩阵见表2。
表1 4种天然抗氧化主成分特征值及贡献率
Table 1 Characteristic values and contribution rates of the four natural antioxidant main components
成分 单宁 枸杞多糖 人参皂苷 虾青素特征值 方差/% 特征值 方差/% 特征值 方差/% 特征值 方差/% 累积/%1 5.357 89.285 4.377 72.955 5.55 92.508 5.635 93.912 93.912 2 0.443 7.391 1.196 19.931 0.304 5.062 0.243 4.051 97.963 3 0.136 2.266 0.273 4.557 0.132 2.205 0.11 1.831 99.795 4 0.063 1.058 0.153 2.557 0.013 0.225 0.012 0.205 100 5 1.43×10-16 2.39×10-15 7.87×10-17 1.31×10-15 2.65×10-16 4.42×10-15 2.17×10-16 3.62×10-15 100 6 -2.54×10-16-4.23×10-15 -1.15×10-16-1.92×10-15 -3.76×10-17-6.26×10-16 -6.25×10-17-1.04×10-15 100累积/%89.285 96.676 98.942 100 100 100累积/%72.955 92.886 97.443 100 100 100累积/%92.508 97.57 99.775 100 100 100
表2 4种天然抗氧化物成分得分系数矩阵
Table 2 Matrix of score coefficients of four natural antioxidants
指标 单宁（主成分1） 枸杞多糖 人参皂苷（主成分1） 虾青素（主成分1）主成分1 主成分2 ABTS+自由基清除能力 0.178 0.190 -0.445 0.166 0.171 DPPH自由基清除能力 0.180 0.223 0.136 0.174 0.177超氧阴离子自由基清除能力 0.163 0.214 -0.138 0.178 0.168羟基自由基清除能力 0.172 0.102 0.724 0.169 0.168总还原能力 0.185 0.207 0.218 0.176 0.176金属离子螯合能力 0.179 0.209 -0.168 0.175 0.173
主成分分析（principal component analysis，PCA）目的在于利用原变量间相关性较强的特点，用较少的指标尽可能多地反映原数据信息，且所含信息互不重复，具有更优越的性能[28]。主成分分析中贡献率越大，说明主成分所包含的原始变量信息越强。单宁的特征值在1以上的一个成分为主成分，贡献率为89.285%。枸杞多糖特征值在1以上的两个成分为主成分，累计贡献率是92.886%，人参皂苷特征值在1以上的1个成分为主成分，贡献率为92.508%；虾青素特征值在1以上的1个成分为主成分，贡献率为93.912%，皆能较好地代表原始数据所反映的信息，符合主成分分析要求。
由表2可知，单宁抗氧化性主成分1其因子得分系数在0.16以上，其中DPPH自由基清除能力，ABTS+自由基清除能力，总还原能力，金属离子螯合能力相对较高。枸杞多糖主成分1各因子的得分系数最高的是DPPH自由基，主成分2影响最高的因子是羟基自由基。人参皂苷及虾青素都只有一个主成分，且各指标相关程度很高，说明这一个主成分可以很好地反映抗氧化能力测定结果。人参皂苷抗氧化性影响最高的是超氧自由基清除能力。虾青素的抗氧化性各因子得分系数最高的是DPPH自由基清除能力。主成分分析结果与不同浓度下各天然物质的各抗氧化指标研究结果一致。
3 结论
经不同物质在不同浓度下抗氧化活性分析，单宁的ABTS+、DPPH自由基清除能力最强。枸杞多糖及1.0 mg/mL的人参皂苷具有良好的清除羟基自由基的能力。人参皂苷对超氧阴离子自由基的清除能力较强。单宁的总还原能力较强，枸杞多糖次之。单宁螯合金属离子能力较强，人参皂苷次之。4种天然抗氧化剂对脂质抗氧化能力由强到弱为单宁、枸杞多糖、人参皂苷、虾青素。经主成分分析，单宁的DPPH自由基清除能力较好。虾青素的DPPH自由基清除能力较好，人参皂苷的超氧阴离子自由基清除能力较好，枸杞多糖的羟基自由基清除能力及总还原能力较好。
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