蓝莓原产美洲，目前在国内广泛种植。蓝莓果实含有丰富的维生素C，硒含量高于一般水果，花青素含量高居水果之首，还含有超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、熊果苷、类黄酮、鞣花酸等活性成分[1-2]，有助于改善视力、预防心血管疾病、改善记忆力[3-4]。随着蓝莓产量增加，鲜果贮藏期短等问题日渐凸显，以及消费者对水果的食用、感官、营养等多方面需求，蓝莓的深加工和综合开发利用备受关注[5-7]。其中蓝莓发酵制品不仅能延长蓝莓的保质期，改善其风味，还能提供多种小分子活性物质，更有利于人体吸收。本文通过动物实验观察蓝莓发酵制品对免疫功能的影响，为蓝莓的综合开发利用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 样品与试剂
蓝莓发酵原浆冻干粉：成都雨瑞蓝果果农业科技有限公司提供，人体推荐剂量为4.5 g/d（75 mg/kg bw），实验前样品用纯水配制成所需浓度。绵羊红细胞（sheep red blood cell，SRBC）：采自健康绵羊颈静脉；鸡红细胞（chicken red blood cell，CRBC）：采自健康公鸡心脏；刀豆蛋白 A（ConA）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐 [3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]、氧化型辅酶Ⅰ：美国Sigma公司；RPMI1640培养基：美国Gibco公司；AC-1细胞：中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；墨汁：北京一得阁工贸公司产品；补体：由健康豚鼠血清制得；小牛血清：浙江天杭生物科技股份有限公司；乳酸锂：国药集团化学试剂有限公司；乙基苯基聚乙二醇（nonidet P-40，NP-40）、吩嗪二甲酯硫酸盐：Biosharp公司；含双抗的RPMI1640培养液：成都哈里生物科技有限公司。
1.2 实验动物
SPF级雄性Balb/c小鼠 [许可证号：SCXK（京）2019-0008]，6 周龄～8 周龄，18 g～22 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。饲养于屏障系统SPF级动物房[许可证号：四川省实验动物管理委员会SYXK（川）2018-011]，温度20℃～26℃，相对湿度40%～70%。饲料由成都达硕实验动物有限公司提供，饮水为纯水，实验期间动物自由摄食和饮水。
1.3 仪器与设备
BSA223S电子天平：德国赛多利斯股份公司；数显游标卡尺：桂林广陆数字测控股份有限公司；Multiskan GO全波长多功能酶标仪：Thermo公司；MCO-15AC CO2培养箱：三洋电机国际贸易有限公司；、UV8100B紫外可见分光光度计：北京莱伯泰科仪器股份有限公司。
1.4 实验方法
1.4.1 功效成分检测
蓝莓发酵原浆中的熊果酸含量检测参照文献[8]，鞣花酸含量测定参照DB32/T 1879—2011《黑莓中鞣花酸含量的测定高效液相色谱法》，花青素（包含飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、锦葵色素）含量测定参照NY/T 2640—2014《植物源性食品中花青素的测定高效液相色谱法》，多糖含量检测参照文献[9]，SOD含量测定参照GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定》，低聚肽含量测定参照GB/T 22729—2008《海洋鱼低聚肽粉》。
1.4.2 增强免疫力功能实验
实验动物适应性喂养3 d后，随机分为空白对照组和3个蓝莓发酵原浆冻干粉实验组。参照文献[10]方法，确定受试物剂量分别为0.75 g/kg bw（低剂量组）、1.50 g/kg bw（中剂量组）和 2.25 g/kg bw（高剂量组）（分别相当于人体推荐摄入量的10、20、30倍）。实验动物按20 mL/kg bw灌胃。空白对照组动物以纯水灌胃，每日1次。每周称1次实验动物体质量，调节灌胃体积，连续灌胃30 d后进行指标检测。
1.4.2.1 脏器指数测定
实验结束后处死小鼠，取胸腺、脾脏称重，计算脏器指数。
1.4.2.2 脾淋巴细胞转化实验
处死小鼠后无菌取脾，制成单个细胞悬液，调整细胞浓度为3×106个/mL。按照MTT法[10]在570 nm波长处测OD值，用ConA孔的OD值与不加ConA孔的OD值的差值表示淋巴细胞的增殖能力。
1.4.2.3 迟发型变态反应实验
采用足跖增厚法进行迟发型变态反应实验。小鼠腹腔注射0.2 mL 2%SRBC进行免疫，4 d后测量左后足跖部厚度，再在测量部位皮下注射20 μL 20%SRBC，24 h后测量左后足趾部厚度，测量3次，取平均值。计算攻击前后足跖厚度差值。足跖肿胀程度可反映迟发型变态反应程度。
1.4.2.4 血清溶血素测定
采用血凝法进行血清溶血素测定实验，免疫方法同1.4.2.3。5 d后于小鼠眼球取血，收集血清。将血清用生理盐水按照所需浓度稀释，将其分别置于血凝实验板内，加入等量SRBC悬液，置于37℃CO2培养箱3 h，观察血球凝集程度，并计算抗体积数，抗体积数越大，表示血清溶血素（抗体）水平越高。
式中：1、2、3……n代表血清稀释的指数；S代表凝集程度的级别。
1.4.2.5 抗体生成细胞检测
抗体生成细胞检测的免疫方法同1.4.2.3。5 d后处死小鼠，无菌取脾制成单个细胞悬液，调整细胞浓度为5×106个/mL。按照Jerne改良玻片法，计数溶血空斑数。
1.4.2.6 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验
采用半体内法进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。小鼠腹腔注射1 mL 20%鸡红细胞悬液，0.5 h后处死，固定于鼠板，剪开腹壁皮肤，注射2 mL生理盐水，转动鼠板1 min，吸出腹腔洗液1 mL，平均分滴于载玻片上，置于37℃CO2培养箱30 min。用生理盐水漂洗晾干，在油镜下计数吞噬细胞，计算吞噬率和吞噬指数。吞噬率或吞噬指数表示小鼠巨噬细胞的吞噬能力。
1.4.2.7 碳廓清实验
小鼠尾静脉注射稀释的墨汁，2 min（t1）和10 min（t2）后分别从内眦静脉丛取血20 μL，将其加入Na2CO3溶液中，以Na2CO3溶液作空白对照，在600 nm波长处测光密度值，以吞噬指数a表示小鼠碳廓清的能力。
式中：K为碳廓清指数；OD1和OD2分别为2 min和10 min所取血样的光密度值。
1.4.2.8 NK细胞活性测定
处死小鼠后无菌取脾，制成单个细胞悬液，按乳酸脱氢酶法[10]，用酶标仪在490 nm处测OD值，计算NK细胞活性。
1.5 数据统计
数据结果以平均值±标准差表示，以便结果与分析使用。实验数据用SPSS 24.0统计软件进行方差分析，方差不齐者用秩和检验。
2 结果与分析
2.1 蓝莓鲜果及发酵原浆冻干粉功效成分含量
蓝莓鲜果及发酵原浆冻干粉中功效成分含量见表1。
表1 蓝莓鲜果及发酵原浆冻干粉中功效成分含量
Table 1 Functional component of fresh blueberry and freeze-dried blueberry fermented pulp powder
注：-表示未查明相关数据。
蓝莓 熊果酸/（mg/100 g）鞣花酸/（mg/100 g）花青素总量/（mg/kg）飞燕草色素/（mg/kg）矢车菊色素/（mg/kg）矮牵牛色素/（mg/kg）锦葵色素/（mg/kg）多糖（以葡聚糖计）/%SOD/（U/mL）低聚肽/%鲜果 - 125.4[11] 1 440[12] - - - - 0.473[12] 34.54[13] -发酵原浆冻干粉 6.44 0.164 80.5 8.63 53.3 5.43 13.1 1.27 360.0 0.69
2.2 蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠脏器指数的影响
蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠脏器指数的影响见表2。
表2 蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠脏器指数的影响
Table 2 Effect of freeze-dried blueberry fermented pulp powder on organ index of mice
胸腺指数/（mg/g）空白对照组 0 10 4.205±0.435 1.411±0.222低剂量组 0.75 10 4.330±0.559 1.433±0.150中剂量组 1.50 10 3.976±0.472 1.379±0.197高剂量组 2.25 10 4.561±0.330 1.323±0.354组别 剂量/（g/kg bw） 动物只数 脾指数/（mg/g）
如表2所示，蓝莓发酵原浆冻干粉3个剂量组小鼠的脾指数和胸腺指数与空白对照组相比无显著性差异。表明蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠免疫器官的质量无明显影响。
2.3 蓝莓发酵原浆冻干粉对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的影响
蓝莓发酵原浆冻干粉对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的影响见表3。
表3 蓝莓发酵原浆冻干粉对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的影响
Table 3 Effect of freeze-dried blueberry fermented pulp powder on ConA-induced transformation of splenic lymphocytes in mice
组别剂量/（g/kg bw）动物只数OD差值空白对照组 0 10 0.341±0.110低剂量组 0.75 10 0.346±0.142中剂量组 1.50 10 0.368±0.102高剂量组 2.25 10 0.366±0.139
如表3所示，蓝莓发酵原浆冻干粉3个剂量组的OD差值与空白对照组相比无显著性差异。说明蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠的淋巴细胞增殖能力无明显影响。
2.4 蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠迟发型变态反应的影响
蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠迟发型变态反应的影响见表4。
表4 蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠迟发型变态反应的影响
Table 4 Effect of freeze-dried blueberry fermented pulp powder on delayed type hypersensitivity in mice
注：*表示与空白对照组比较，差异显著，P＜0.05。
组别剂量/（g/kg bw）动物只数足跖增厚/mg空白对照组 0 10 0.161±0.073低剂量组 0.75 10 0.204±0.089中剂量组 1.50 10 0.278±0.087*高剂量组 2.25 10 0.272±0.097*
如表4所示，蓝莓发酵原浆冻干粉1.50 g/kg bw和2.25 g/kg bw剂量组小鼠足跖增厚程度显著高于空白对照组（P＜0.05）。说明蓝莓发酵原浆冻干粉可显著提高小鼠迟发型变态反应程度。
2.5 蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠血清溶血素产生的影响
蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠血清溶血素产生的影响见表5。
表5 蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠血清溶血素产生的影响
Table 5 Effect of freeze-dried blueberry fermented pulp powder on the production of serum hemolysin in mice
注：*表示与空白对照组比较，差异显著，P＜0.05。
组别剂量/（g/kg bw）动物只数抗体积数空白对照组 0 10 158.40±12.67低剂量组 0.75 10 175.20±15.29*中剂量组 1.50 10 174.40±13.10*高剂量组 2.25 10 177.00±10.42*
如表5所示，蓝莓发酵原浆冻干粉3个剂量组的小鼠抗体积数均显著高于空白对照组（P＜0.05）。说明蓝莓发酵原浆冻干粉能明显提高小鼠血清溶血素水平。
2.6 蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠抗体生成细胞产生的影响
蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠抗体生成细胞产生的影响见表6。
如表6所示，蓝莓发酵原浆冻干粉1.50 g/kg bw和2.25 g/kg bw剂量组的小鼠溶血空斑数显著高于空白对照组（P＜0.05）。溶血空斑数反映抗体生成细胞数，结果表明蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠抗体生成细胞增殖有明显作用。
表6 蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠抗体生成细胞产生的影响
Table 6 Effect of freeze-dried blueberry fermented pulp powder on antibody-producing cells in mice
注：*表示与空白对照组比较，差异显著，P＜0.05。
组别剂量/（g/kg bw）动物只数溶血空斑数（106脾细胞）空白对照组 0 10 562.50±149.36低剂量组 0.75 10 574.00±151.34中剂量组 1.50 10 747.50±216.64*高剂量组 2.25 10 767.00±183.11*
2.7 蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响
蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响见表7。
表7 蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响
Table 7 Effect of freeze-dried blueberry fermented pulp powder on phagocytosis of chicken red blood cells by peritoneal macrophages in mice
组别剂量/（g/kg bw）动物只数吞噬率/%吞噬指数空白对照组 0 10 22.60±3.03 0.231±0.031低剂量组 0.75 10 22.20±3.30 0.229±0.035中剂量组 1.50 10 22.50±1.80 0.229±0.019高剂量组 2.25 10 23.00±2.92 0.232±0.031
如表7所示，蓝莓发酵原浆冻干粉3个剂量组的小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数与空白对照组相比无显著性差异。说明蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠巨噬细胞的吞噬功能无明显影响。
2.8 蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠碳廓清的影响
蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠碳廓清的影响见表8。
表8 蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠碳廓清的影响
Table 8 Effect of freeze-dried blueberry fermented pulp powder on carbon clearance in mice
组别剂量/（g/kg bw）动物只数吞噬指数a空白对照组 0 10 5.30±0.83低剂量组 0.75 10 6.14±0.80中剂量组 1.50 10 5.85±0.81高剂量组 2.25 10 5.51±0.70
如表8所示，蓝莓发酵原浆冻干粉3个剂量组的吞噬指数a与空白对照组相比无显著性差异。说明蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠碳廓清能力无明显影响。
2.9 蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠的NK细胞活性的影响
蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠NK细胞活性的影响见表9。
表9 蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠NK细胞活性的影响
Table 9 Effect of freeze-dried blueberry fermented pulp powder on NK cells activity in mice
组别剂量/（g/kg bw）动物只数NK细胞活性/%空白对照组 0 10 43.49±5.73低剂量组 0.75 10 41.55±8.62中剂量组 1.50 10 42.11±5.41高剂量组 2.25 10 42.13±5.18
如表9所示，蓝莓发酵原浆冻干粉3个剂量组小鼠NK细胞活性与空白对照组相比无显著性差异。结合其腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力实验结果，表明蓝莓发酵原浆冻干粉对机体的非特异性免疫功能无明显影响。
3 讨论
与鲜果相比，蓝莓发酵原浆中的多糖含量和SOD含量增多。发酵初期，蓝莓中的单糖以碳源形式被微生物代谢分解，产生胞外多糖，这些胞外多糖一般是由单种或多种单糖组成的重复单元，大部分胞外多糖不再被微生物利用，进入机体后可发挥其抗氧化、免疫调节等生理功能[14-15]。生物体内SOD基因的表达调控与所处环境和细胞的新陈代谢变化有关[16]，可能是发酵环境使发酵菌株的SOD表达增加，进而蓝莓发酵原浆中的SOD含量增多。鞣花酸和花青素属于酚类化合物，发酵过程中不断被氧化分解[17-18]，二者含量减少。这也使得蓝莓发酵原浆苦涩味减少，口感更加柔和[19]。
本文设计了脏器指数测定、脾淋巴细胞转化实验、迟发型变态反应实验、血清溶血素和抗体生成细胞测定、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、碳廓清实验和NK细胞活性测定等实验，观察蓝莓发酵原浆冻干粉的增强免疫力作用。胸腺和脾脏是重要的免疫器官，脾淋巴细胞转化实验和迟发型变态反应实验反映机体细胞免疫水平；血清溶血素测定和抗体生成细胞检测反映机体体液免疫水平；腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验和碳廓清实验反映吞噬细胞功能；NK细胞活性则反映非特异性免疫功能[20-22]。结果显示，蓝莓发酵原浆冻干粉能够增强小鼠迟发型变态反应，促进小鼠抗体生成细胞产生，故具有增强免疫力功能。
迟发型变态反应是由致敏T细胞与相应抗原结合而引起的一种免疫应答[20]，分为识别、激活和效应3个阶段。当抗原攻击机体时，首先被识别，再诱导T细胞转化为致敏T细胞。蓝莓发酵原浆冻干粉中的营养成分能为T细胞的增殖提供物质基础。此外，熊果酸、蓝莓多糖、花青素具有提高机体免疫的能力。其中熊果酸和蓝莓多糖已被证实能在迟发型变态反应激活阶段促进细胞因子分泌[23-24]。蓝莓中的花青素具有极强的抗氧化活性和自由基清除功能[25]，可间接提高机体免疫功能，但有关其特异性免疫机制目前所见报道较少。
体液免疫依靠B淋巴细胞产生效应B细胞和记忆细胞，效应B细胞分泌抗体清除抗原，记忆细胞不分泌抗体，参与二次免疫反应[26]。红细胞与血清溶血素混合后，血清溶血素可与红细胞表面的抗原结合，诱导补体系统激活。溶血反应程度越高，血清抗体的水平越高，机体免疫功能越高[27]。抗体生成细胞检测用于测定效应B细胞产生抗体的能力。本研究显示血清溶血素的抗体积数和抗体生成细胞检测的溶血空斑数显著升高，侧面反映蓝莓发酵原浆冻干粉能提高B淋巴细胞的增殖分化能力和效应B细胞抗体释放能力。具体可能是因为蓝莓发酵原浆冻干粉中的多种功效成分通过免疫细胞和免疫分子两方面提高小鼠免疫功能。关于蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠的脏器指数、淋巴细胞增殖能力、巨噬细胞吞噬功能、碳廓清能力和NK细胞活性方面无明显影响，目前原因尚不明确，有待进一步探究。
4 结论
蓝莓发酵原浆冻干粉在中、高剂量水平上可显著提高小鼠足跖肿胀程度，各剂量组均可显著提高小鼠血清溶血素水平，中、高剂量水平上可显著提高小鼠抗体生成细胞增殖能力。因此该蓝莓发酵原浆冻干粉对小鼠细胞免疫和体液免疫有一定增强作用。综上所述，蓝莓发酵原浆冻干粉具有增强免疫力的功能，有望进一步开发利用。
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