栀子（Gardenia jasminoides Ellis）又称黄栀子、山栀子，为茜草科植物栀子的果实，是一种具有较高营养价值以及在多种行业均有广泛应用的药食两用资源[1]。栀子在食品中的应用主要是以栀子果实为原材料进行栀子油的提取，栀子黄色素等天然色素的开发以及功能性饮料的加工等。同时，栀子还具有保肝利胆、解热镇痛、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降糖降脂和神经保护等多种生理功能，具备良好的保健食品开发和利用价值[2-3]。植物中具有显著生理活性和药理作用，并在临床上有应用价值的化学成分称为有效成分。目前栀子属植物中已被分离鉴定的有效成分包括环烯醚萜类、三萜类化合物、有机酸类、黄酮类、多糖类以及挥发油等。其中环烯醚萜类的栀子苷以及栀子黄色素、黄酮、栀子油等物质的研究最为常见。多糖在栀子果实中的含量约为4%～11%，也是栀子重要的有效成分之一，但目前关于栀子多糖的研究并不多。本文对栀子多糖的提取、分离纯化及其化学结构、生物活性等方面的研究现状详细阐述，以期为栀子多糖的进一步深入研究和开发利用提供理论参考。
1.1.1 原材料预处理
多糖的提取是对多糖进行研究和分析的基础。用于多糖提取的植物原材料通常含有较多的脂类物质，在提取过程中容易随多糖一起从破碎后的细胞中被提取出来，因此需要对原材料进行脱脂预处理。一般采用乙醇、石油醚等有机溶剂浸泡或者回流提取的方法除去脂质，同时除去部分脂溶性色素。脱脂后的原材料以水、稀酸或稀碱溶液为溶剂进行提取，所得提取液经过滤、浓缩、有机溶剂（乙醇、甲醇、丙酮或异丙醇等）沉淀后可得粗多糖样品。
1.1.2 提取方法研究概况
栀子多糖是一种水溶性多糖，因此一般以水为溶剂进行提取，考察的提取工艺参数包括料液比、提取温度、提取时间、提取次数等。选择的参数不同，提取结果差异较大。因此还需通过工艺优化来确定最佳提取条件。常用的工艺优化方法有正交法、响应面法等。如郑文诚等[4]通过响应面法优化水浸提栀子多糖最佳工艺条件为时间4.5 h、温度85℃，在此条件下，栀子多糖提取率为3.651%。宋智琴等[5]采用正交试验法优选栀子多糖的水提工艺，确定最佳提取时间为1.5 h，在此条件下，栀子多糖提取率为4.61%。水提法主要是以浸渍、回流的方式进行，此外还可采取微波辅助提取或超声波辅助提取等方式，以提高多糖提取率。但目前采用这两种方法制备栀子多糖的研究相对较少。宫江宁等[6]研究表明，采用超声波辅助提取栀子多糖，并经响应面法优化后的最佳提取工艺条件为超声功率120 W、提取时间73 min，在此条件下，栀子多糖的提取率为（6.34±0.09）%。可见，与单纯水浸渍或回流提取相比，超声波辅助提取明显缩短了提取时间同时提高了提取效率。这是由于超声波的空化效应可增大物质分子运动频率，增加溶剂穿透率，使得物质成分溶出速度加快、次数增加，且超声破碎是一个物理过程，因而不会改变被提取成分的结构和性质。韩东等[7]采用闪式提取工艺提取栀子多糖，响应面法确定最佳提取时间仅为42 s，在此条件下，多糖得率可达6.38%。闪式提取与其他提取方法相比，能够在短时间内最大限度萃取出有效成分，并具有溶剂用量少、提取效率高的特点，尤其在提取时间上表现出极大的优势。但目前，闪式提取工艺在栀子多糖的提取中应用较少。
多糖的分离纯化是探讨多糖结构和生物活性的首要前提。经水提醇沉得到的粗多糖通常含有蛋白质、色素和小分子化合物等非多糖组分，需通过一系列纯化步骤先将杂质去除，再对多糖组分进行分级纯化，以获得化学组成、聚合度和分子形状相同的均一多糖。多糖纯度越高，其结构越稳定，越有利于后续理化性质的鉴定和结构表征[8]。目前，栀子多糖的纯化工艺并无特定标准，通用的流程包括脱蛋白、脱色、除杂的初步纯化，以及采用分步沉淀法、金属络合物法、离子交换法、柱层析法等进行的分级纯化[9]。
1.2.1 多糖的脱蛋白方法
常见的脱蛋白方法有沙维积法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法以及酶解法等。沙维积法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法均是利用蛋白质在有机溶剂中变性的原理除去蛋白；蛋白酶法则是利用蛋白质水解酶，使蛋白质大分子降解达到去除目的。每种方法对脱除栀子多糖中蛋白的效果不一。蔡永红等[10]研究比较了沙维积法、三氯乙酸法和蛋白酶法3种方法对栀子多糖中蛋白的去除效果，结果显示，三氯乙酸法除蛋白的效果最好。有时单一的除蛋白方法虽去除蛋白多，但也伴随着多糖的损失大。为了既可以有效地去除蛋白质，又能较好地保留多糖，可以采用两种方法联用。一般认为，可以先使用蛋白质水解酶降解样品中的部分蛋白质，再采用沙维积法效果更佳。此外，有研究采用冷酚抽提法连续抽提栀子粗多糖溶液中的蛋白3次，使得杂蛋白的脱除率达到90%以上[11]。为减少有机溶剂的用量，还可以采取将样品反复冻融离心除蛋白的方法。如王庆奎等[12]将沙维积法和反复冻融法对当归多糖的脱除效率进行对比，结果表明，反复冻融法除蛋白的效果优于沙维积法。从环保和安全性的角度来讲，反复冻融法避免了有机溶剂的使用，可减少对环境的污染以及目标成分中有机溶剂残留，但该法对多糖的生物活性是否有影响尚待探讨。
1.2.2 多糖的脱色方法
多糖的来源不同以及提取方法的局限导致色素残留而赋予多糖较深的颜色，植物多糖常呈现为褐色、红色或黄色。由于色素属于杂质性物质，会影响多糖的进一步分离纯化、定性和定量分析以及结构测定，因此有必要对多糖进行脱色处理。目前，多糖的脱色方法有吸附法（活性炭吸附、大孔吸附树脂吸附）、离子交换法（弱碱性离子交换树脂）、过氧化氢（H2O2）氧化法、金属络合物法等。脱色前的栀子多糖溶液所含色素主要为栀子黄色素，这是一种以藏红花素和藏红花酸为主要成分的水溶性类胡萝卜素，在水提取栀子多糖时一同被提取溶于水中而使多糖溶液呈黄色或橘黄色。大部分的栀子黄色素在原材料脱脂预处理阶段和使用乙醇沉淀多糖的过程中被留在上清液中而除去，剩余的部分可通过吸附树脂或离子交换树脂，利用物理吸附和离子交换作用将色素脱除。
植物多糖还可能含有酚类、羟基蒽醌衍生物等大多呈负性离子的色素，以及部分与糖结合的色素，这些色素不适合用活性炭吸附脱色，可选择二乙氨基乙基（dicthylaminoethyl，DEAE）纤维素或 Duolite A-7等弱碱性离子交换树脂，或采用H2O2氧化脱色。树脂与H2O2对多糖均有较高的脱色效率，而且树脂的脱色效果甚至优于H2O2[13-14]。但树脂处理量小，生产周期长，且容易受污染，因而成本较高。H2O2脱色后不易复色，且脱色剂易于从样品中清除，较树脂脱色过程更为简单。不过相较于物理吸附，化学氧化过程可能造成多糖结构的破坏，降低多糖活性，因而使用此法必须结合多糖保留率指标来筛选出合适的H2O2水平[15]。
1.2.3 多糖的除杂方法
除了蛋白质和色素，粗提的植物多糖还含有无机盐及单糖、低聚糖等一些醇不溶性的小分子有机物，影响多糖纯度和质量，必须分别去除。目前，去除小分子杂质多采用透析法。多糖中的小分子杂质去除主要通过蒸馏水透析，利用透析袋的半透性使溶质中的小分子物质从高浓度溶液扩散到低浓度溶液中，直至渗透压达到平衡。通过不同截留分子量的透析袋可使目标分子与杂质得以分离。栀子多糖的分子量为10 kDa～50 kDa，10 kDa以下的透析袋并不会使多糖分子透过流失。因此，针对栀子多糖的透析，可采用3 kDa～4 kDa的透析袋透析24 h～72 h，除去小分子杂质，由此可获得初步纯化的栀子多糖。
1.2.4 多糖的分级纯化方法
多糖不是一种纯粹的化学物质，而是聚合程度不同的物质混合物。提取、除杂后的多糖在单糖组成、相对分子质量分布、结构等方面仍有不均一性。还需通过分级纯化将多糖混合物分离为均一的多糖，以适用于后续多糖的化学结构和生物功能的研究。常用的分级纯化方法有沉淀法、色谱分离法以及膜分离法等。
根据不同组分多糖的分子量大小差异以及在有机溶剂或盐析剂中的溶解度不同的特性，可采用有机溶剂沉淀法和盐析法。其中最常用的是乙醇分步沉淀法，通过增加乙醇浓度使多糖组分按照分子量由大到小逐级沉淀而出[16]。盐析法则是向多糖溶液中加入中性盐（如氯化钠、氯化钾、硫酸铵等），使各多糖组分按溶解度差异而在盐溶液中逐步析出。另有季铵盐沉淀法，是指以季铵盐及其氧化物为乳化剂，与酸性多糖形成不溶性沉淀，使之得以与中性糖分离。沉淀法适用于物化性质差异较大的多糖组分，对于一些性质较为接近的待分离组分，色谱分离法具有明显的优越性[17]。色谱分离法能够依靠植物多糖中各组分物化性质的差异，及其在两相之间分布和流动速度的差异实现分离目的。根据分离原理不同，色谱分离法可分为凝胶柱色谱法和离子交换柱色谱法。前者常用的层析柱填料为葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶，并根据凝胶颗粒间隙小的特点，利用分子筛原理将分子量大小不同的组分进行分离，但此法不适宜分离黏多糖[18]。离子交换柱色谱法则是以DEAE-纤维素和交联醇胺-纤维素为交换剂，通过载体表面带电基团与样品离子及淋洗离子进行可逆交换、离子偶极作用和离子吸附实现色谱分离。
关于栀子多糖的分级纯化目前少有深入研究，仅见孟延发等[19]将栀子粗多糖GPS1通过DEAE-纤维素（DE-52）柱层析得GPS2和GPS3两个组分，GPS2和GPS3分别经SephadexG-200层析进一步纯化得精品GPS4和GPS5，并由电泳分析验证GPS4和GPS5是均一性多糖。说明凝胶柱对栀子多糖有良好的分级纯化效果。由于天然植物成分复杂，仅凭一种色谱分离方法无法很好满足试验和生产的需要，多种方法联用是促进多糖分离纯化发展的途径之一。实际过程中常将离子交换层析和凝胶过滤层析联合用于多糖纯化。
多糖是一种化学结构比蛋白质更为复杂的生物大分子，但它又与蛋白质一样具有分级结构。多糖的结构可分为初级结构（一级）和高级结构（二、三、四级）。初级结构包括分子量、单糖组成、异头碳构型、糖苷键的类型和连接顺序、糖链有无分支以及分支的位置与长短、取代度等，这些均是与多糖生物活性相关的重要因素[20]。多糖的高级结构和空间构象对其活性和功能有决定性作用，而初级结构是高级结构的基础。因此，对多糖初级结构的解析是深入探讨其活性和功能的前提。
当前对多糖初级结构的解析技术已相对成熟，包括经典的化学方法如水解法、高碘酸氧化法、Smith降解、甲基化、乙酰化等；生物学方法如特异性糖苷酶水解、免疫学方法等；还有仪器分析法如色谱法、光谱法、质谱法和核磁共振谱法等。水解法是分析单糖组成及比例的主要手段，通过水解过程将多糖链分解成单糖，包括完全酸水解、部分酸水解、乙酰解和甲醇解等。水解后的多糖经中和、过滤后可采用薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法和离子色谱法等进行分析[21-23]。高碘酸氧化法和Smith降解主要用于判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度和支链多糖的分支数，同时结合甲基化反应、质谱法以及核磁共振谱法可对糖链接顺序及链接位点、取代官能团等进行具体分析[24-25]。光谱法有红外光谱和拉曼光谱，常用于多糖糖环形式（吡喃型、呋喃型）和异头碳构型（α型、β型）的分析[26]。此外，一些现代化新型解析技术如毛细管电泳-质谱联用技术、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱、二维核磁共振等的发展与应用，使多糖一级结构解析迈入更微量、更高效、更快速和更准确的层次[27]。
关于栀子多糖的化学结构，目前仅见分子量、单糖组成以及糖苷键类型测定方面的研究报道。如孟延发等[19]采用SephadexG-150层析法测得多糖组分GPS4和GPS5的分子量分别为14 000和10 000；经红外光谱分析GPS4和GPS5分别含有β-糖苷键和呋喃糖苷键构型。马越鸣等[28]的研究显示，其制备所得栀子多糖的重均相对分子量为10 kDa～20 kDa，其中总糖含量为41%～56%，糖醛酸含量为34%～45%，蛋白质含量为7%～10%；并经完全酸水解后分析，栀子多糖的主要单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。另有研究表明，栀子花多糖组分的主要成分为中性糖（46.83±3.14）%、糖醛酸（35.21±0.17）%、蛋白质（1.63±0.34）%和总酚（9.49±0.08）mgGAE/g；主要单糖为半乳糖醛酸（41.05±0.59）%，其他单糖组成包括半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖和葡萄糖醛酸[29]。各研究报道的栀子多糖在单糖组成方面较为接近，而分子量大小有明显差异，这是因为多糖和低分子量化合物不同，它是不同分子量同系物的混合体系，并无固定的分子量，不同的纯化方法和纯化程度可获得不同分子量范围的均一多糖。上述研究仅仅是对栀子多糖初级结构的解析，目前国内外尚无关于解析栀子多糖高级结构的相关报道，这主要与多糖高级结构解析难度高、解析技术水平相对有限等原因有关。即使现代仪器在多糖高级结构的研究上已大有突破，但总体应用仍较少。
植物多糖具有广泛的生物活性，其中免疫调节和抗氧化是其较为突出也较为普遍的功能。植物多糖可作为免疫调节剂，通过激活巨噬细胞、激活补体系统、促进细胞因子生成等途径，进一步活化T淋巴细胞和B淋巴细胞，发挥免疫调节作用，增强机体的免疫功能[30]。植物多糖的抗氧化性主要表现在对超氧阴离子自由基（O2-·）、羟基自由基（·OH）、脂质过氧化物等多种活性氧物质具有明显的抑制和清除作用，该作用可抑制脂质过氧化并提高抗氧化酶活性，形成抗氧化过程[31]。研究表明，栀子多糖具有一定的抗氧化能力，但总还原能力小于维生素C，其清除自由基的强弱顺序为·OH＞DPPH·＞ABTS+·＞O2-·[6]。王晓颖等[32]研究发现，栀子多糖对DPPH·、OH·以及O2-·的清除率分别为21.65%、70.97%、19.26%，且可促进小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7）的增殖，在体外表现出良好的抗氧化活性及免疫作用。但该研究结果与石若夫[33]发现的栀子多糖对O2-·的清除效果最好（清除率83.48%），而对·OH的清除效果不佳（清除率28.14%）有所差异。其影响因素可能有原材料栀子的产地、质量以及不同试验过程中对栀子多糖的处理方法不同等，而同一栀子多糖对不同自由基的清除效果不同，可能与多糖本身的纯度和结构差异有关。
就多糖的抗肿瘤机制而言，可将多糖分为两大类：一类是能够直接杀死肿瘤细胞的具有细胞毒性的多糖；另一类是通过阻滞细胞周期或作为生物免疫反应调节剂，通过提高机体免疫功能而间接发挥抗肿瘤作用的多糖[34-35]。大部分植物多糖的抗肿瘤作用主要与其免疫调节作用有关，且从结构上分析，杂多糖的抗肿瘤活性比同多糖更强[36]。此外，多糖的空间构象对其抗肿瘤活性也有影响，其中具有β-（1→3）-D-葡聚糖的三股螺旋结构的多糖抗肿瘤活性显著[37]。有关栀子多糖的抗肿瘤活性实验结果显示，栀子多糖对植物根癌农杆菌引起的根瘤、人红白血病K562细胞和小鼠腹水肝癌Hca-f实体瘤的抑制率分别为68.4%、63.2%、49.0%，说明栀子多糖具有较广谱的抑瘤效应和良好的抑瘤效果[38]。体外抑制肿瘤细胞实验研究表明，栀子多糖对S-180肉瘤细胞和腹水肝癌细胞均有一定的抑制作用，抑制率分别达到51%和58%[19]。以上研究结果均表明，栀子多糖具有明显的抗肿瘤活性，且都显示对肝癌细胞有50%左右的抑制效果。近年来也有研究报道，栀子多糖对α-异硫氰酸萘酯（1-naphthyl isoth-iocyanate，ANIT）和 3，5-二乙氧基羰基-1，4-二氢-2，4，6-三甲基吡啶（3，5-diethoxycarbonyl-1，4-dihydro-2，4，6-collidine，DDC） 诱导的胆汁淤积性肝损伤以及CCl4诱导的肝纤维化有明显的改善作用[28]。此结论进一步证明栀子多糖在肝损伤方面的保护作用。由此可见，栀子多糖有开发成为预防、调节或改善肝脏疾病症状以及具有护肝作用的功能性食品的良好前景。
植物多糖可通过多种途径发挥降血糖功能，主要作用机制包括：抑制胰岛β细胞凋亡；调节胰岛素与靶细胞特异性结合，增强胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗；调节糖代谢酶等关键酶活性，促进肝糖原合成，抑制糖异生；通过调控糖原合成、分解及促进血糖利用；通过增强免疫系统功能和抗氧化作用保护及修复胰岛β细胞，促进胰岛素分泌，拮抗胰高血糖素升高，以此调节糖代谢[39-40]。目前，有关栀子多糖降血糖活性的研究并不多，仅宫江宁等[6]在提取栀子多糖后对其进行了抑制α-葡萄糖苷酶的活性检测，结果表明，在栀子多糖浓度为2 000 mg/L～8 000 mg/L，半抑制浓度（IC50）为1 550 mg/L，说明栀子多糖有一定的降血糖活性。虽然不同种属植物多糖的降血糖机制无明显差别，但各科属类之间存在多样性，因而栀子多糖具体是通过何种途径发挥降血糖作用还需进一步研究和探讨。
栀子多糖来源于栀子果实，具有植物多糖所具有的生物活性广泛、毒性低、副作用小的特点。且栀子作为一种优质的药食两用资源，其多糖成分在保健食品领域也具有广泛的应用前景。因此栀子多糖的制备及其理化性质、活性研究，以及更进一步的构效关系的探讨，都具有重要的意义。
多糖是一种结构多样的生物大分子，相比于蛋白质和核酸等其他生物聚合物，其承载生物信息的能力更高，具有的结构变异潜力更大。对多糖结构和生物功能的研究已成为继蛋白质、核酸之后探索生命奥秘的第3个里程碑。但由于多糖的研究起步较晚，又因其种类繁多，结构复杂，分离纯化难度大等问题，使得目前对多糖的研究仍落后于蛋白质和核酸。就目前的研究工作来看，栀子多糖的相关研究主要集中在国内，研究内容涵盖栀子多糖的提取、分离纯化、基本性质以及生物活性，但各方面内容的研究报道均较少，尤其对栀子多糖结构方面的研究相当缺乏。现有相关研究仅是测定其分子量、单糖组成和糖苷键类型等多糖的基础性质。
相较于其他植物多糖的研究内容和进展，栀子多糖的研究尚处于滞后阶段。而我国拥有丰富的栀子资源，以及目前相对先进的研究手段和技术，研究者应该充分利用这些有利条件，对栀子多糖进行更多、更深入的探讨，让栀子多糖得到合理有效的利用和开发。
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