余甘子（Phyllanthus emblica L.）是大戟科叶下珠属余甘子的果实，又名“滇橄榄”[1-2]，是主产于热带、亚热带地区的一种富含维生素、微量元素、有机酸、糖类、蛋白质的水果，具有较高的营养价值[3]。研究表明，余甘子果实中含有丰富的超氧化物歧化酶、维生素C、多酚类物质，具有抗衰老、抗癌、抗炎、抗菌、降血压、降脂减肥等作用[4-6]。
余甘子中含有果胶质、纤维素及半纤维素等物质，导致余甘子的果肉不能在经过一次压榨后充分破碎，出汁率较低。另外，果胶在贮存期间会生成胶凝沉淀，因此在余甘子汁及饮料的加工和贮藏期间，会存在产生沉淀的问题[7-8]。针对这一问题，已经有多种果蔬汁的澄清方法，例如自然澄清法、明胶-单宁法、酶法等[9]。从刘松涛[9]的研究结果看，自然澄清法用时较长，果蔬汁风味变质；明胶-单宁法澄清所需温度条件苛刻，运用较少；酶法澄清在瓜果类食品中具有很好的效果，其可在一定程度上使果蔬细胞壁中的果胶、纤维素等物质降解，提高果蔬出汁率[10-11]。王亚男等[12]利用果胶酶-热浸提法提高野樱莓的出汁率，对一次榨汁完剩余的果渣进行二次榨汁，提高了出汁率。综合上述研究，根据不同的研究对象，相对于单一的酶，选用复合酶法能使不同的酶产生协同作用，提高酶解效率，对比超声等方法在大规模生产上具有一定局限性，使用生物酶法在操作上较为简单快捷，生产成本较低，且酶本身的反应条件较为温和、选择性强。针对余甘子是由果胶质、纤维素等构成的复杂致密结构的特点，通过果胶酶-纤维素酶复合酶酶解，将余甘子细胞壁中的果胶质、纤维素等物质进行降解，使之破坏余甘子细胞壁的致密结构，从而提高余甘子的出汁率，以达到长时间贮藏的效果，减少沉淀的出现。研究表明，通过添加复合酶酶解果蔬等，其可溶性固形物（soluble solid，SS）含量、总酸（total acid，TA）含量提高[13-14]。
本试验拟以果胶酶-纤维素酶复合酶的酶解技术[15]作为手段，选择响应曲面设计方法（response surface methodology，RSM）[16-17]中的 Box-Benhnken 设计法[18]，以出汁率为主要指标，可溶性固形物含量及总酸含量作为参考，研究复合酶添加量、复合酶质量比、酶解温度、酶解时间因素对余甘子二次榨汁出汁率的影响，确定果胶酶和纤维素酶复合酶酶解余甘子汁的最佳工艺条件，为余甘子的精深加工和利用提供理论和技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
余甘子：市售成熟果实；果胶酶（100 000 U/g）、纤维素酶（50 000 U/g）：北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器与设备
手持折光仪（WS-108）：上海测维光电技术有限公司；数显恒温水浴锅（HH-6）：常州澳华仪器有限公司；万分之一电子天平（ESJ200-4B）：沈阳龙腾电子有限公司；离心机（TDL-BA）：上海菲恰尔分析仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 工艺流程
无霉变、无腐烂的新鲜余甘子果实→清洗→破碎→榨汁→粗滤（留滤液）→添加复合酶进行酶解→离心（留上清液作为待测样品）。
1.3.2 余甘子粗滤液的酶解
将混匀的余甘子粗滤液分装于锥形瓶中，每个锥形瓶盛装50 g余甘子粗滤液，加入一定量的复合酶，在一定温度和时间，完成酶解过程。
1.3.3 单因素试验设计
以余甘子汁粗滤液为研究对象，以出汁率为主要评价指标，以可溶性固形物和总酸含量为辅助评价指标，研究不同复合酶添加量、复合酶质量比、酶解温度和酶解时间对余甘子果汁二次榨汁的影响，以确定余甘子果汁二次榨汁的最佳工艺条件。
1.3.3.1 最佳复合酶添加量的确定
取50 g余甘子粗滤液若干份，在添加复合酶质量比为1∶1，酶解温度为55℃的条件下，改变复合酶添加量分别为 0%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%和 0.05%，酶解3 h后冷却至室温（25℃），经5 000 r/min离心10 min后，测定出汁率、可溶性固形物含量及总酸含量，以确定最佳复合酶添加量。
1.3.3.2 最佳复合酶质量比的确定
取50 g余甘子粗滤液若干份，在复合酶添加量为0.01%，酶解温度为55℃的条件下，改变复合酶质量比（果胶酶 ∶纤维素酶）分别为 3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶1，酶解3 h后冷却至室温（25℃），经5 000 r/min离心10 min后，测定出汁率、可溶性固形物含量及总酸含量，以确定混合酶的最佳质量比。
1.3.3.3 最佳酶解时间的确定
取50 g余甘子粗滤液若干份，在复合酶质量比为1∶1，复合酶添加量为0.01%，酶解温度为55℃的条件下，改变酶解时间分别为1、2、3、4 h和5 h后，冷却至室温（25℃），经5 000 r/min离心10 min后，测定出汁率、可溶性固形物含量及总酸含量，确定最佳酶解时间。
1.3.3.4 最佳酶解温度的确定
取50 g余甘子粗滤液若干份，在复合酶质量比为1∶1，复合酶添加量为0.01%的条件下，改变酶解温度分别为 40、45、50、55℃和60℃，酶解3 h后冷却至室温（25℃），经5 000 r/min离心10 min后，测定出汁率、可溶性固形物含量及总酸含量，以确定最适酶解温度。
1.3.4 响应面试验设计
综合单因素试验结果，根据Box-Behnken试验设计方法，以酶解温度、酶解时间、复合酶添加量、复合酶质量比为变量，以出汁率为响应值设计试验，因素水平编码见表1。
表1 试验因素和编码水平
Table 1 Test factors and coding levels
水平D复合酶质量比/（g/g）-1 50 2.5 0.005 1∶2 0 55 3.0 0.010 1∶1 1 60 3.5 0.015 2∶1因素A酶解温度/℃B酶解时间/h C复合酶添加量/%
1.4 指标测定方法
1.4.1 出汁率的测定
参照刘刚等[19]的方法并做一定改进。对酶解前后的余甘子汁进行称量，出汁率按如下公式计算。
式中：G1为酶解后果汁质量，g；G2为酶解前果浆质量，g。
1.4.2 可溶性固形物含量的测定
先用柔软绒布擦净棱镜表面，滴加2滴～3滴待测样液，使样液均匀分布在整个棱镜表面，对准光源，折射仪读数P（%）即为该样液的可溶性固形物含量。
1.4.3 总酸含量的测定
参照GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》方法[20]，使用酸碱指示剂滴定法，根据酸碱中和原理，用碱液滴定试液中的酸，以酚酞为指示剂确定终点，使用试剂均为分析纯，对余甘子汁的总酸含量进行测定，按照如下公式计算。
式中：c为标准氢氧化钠溶液的浓度，mol/L；V1为滴定所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V2为空白所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；m为试样体积，mL；k为酸的换算系数，以苹果酸计算，k=0.067；F为试液稀释的倍数；1 000为换算系数。
1.5 数据处理
所有试验设3次重复，结果用平均值±标准差表示，应用Microsoft office Excel 2013处理试验数据，SPSS 25.0软件进行单因素方差分析，Design Expert 12.0软件进行响应面试验统计与分析。
2 结果与分析
2.1 复合酶添加量对余甘子汁出汁率、可溶性固形物及总酸含量的影响
复合酶添加量对余甘子汁出汁率、可溶性固形物含量及总酸含量的影响见图1。
图1 复合酶添加量对余甘子汁出汁率、可溶性固形物含量及总酸含量的影响
Fig.1 Effect of enzyme complex addition on juice yield，soluble solids content and total acid content
不同小写字母表示同组数据间有显著性差异（p＜0.05）。
由图1可知，当果胶酶和纤维素酶复合酶添加量为0.01%时，余甘子汁的出汁率最高，为91.03%。同时，可溶性固形物含量及总酸含量也上升到最高值，分别为12.00%和28.46 g/L。随着复合酶添加量继续增加，余甘子汁出汁率、可溶性固形物含量及总酸含量显著下降（p＜0.05）。当复合酶添加量升高到0.02%时，继续增加其添加量，余甘子汁的出汁率显著下降（p＜0.05），但可溶性固形物和总酸含量的变化无显著差异（p＞0.05）。综合上述结果表明，果胶酶和纤维素酶复合酶的最佳添加量为0.01%。
2.2 复合酶质量比对余甘子出汁率、可溶性固形物含量及总酸含量影响
复合酶质量比对余甘子汁出汁率、可溶性固形物含量及总酸含量影响见图2。
图2 复合酶质量比对余甘子汁出汁率、可溶性固形物含量及总酸含量的影响
Fig.2 Effect of the ratio of complex enzymes on juice yield，soluble solids content and total acid content
不同小写字母表示同组数据间有显著性差异（p＜0.05）。
由图2可知，当果胶酶-纤维素酶复合酶质量比为1∶1时，余甘子汁的出汁率最高，为89.39%。同时，其可溶性固形物含量及总酸含量也上升到最高值，分别为12.23%和27.66 g/L。随着复合酶质量比的减小，余甘子汁的出汁率、可溶性固形物和总酸含量显著下降（p＜0.05），但当复合酶质量比为1∶2时，继续减小复合酶质量比，余甘子汁的总酸含量无显著变化（p＞0.05）。当两种酶同时作用时，其对余甘子细胞壁及胞间结构的影响更为复杂，果胶酶和纤维素酶在酶解余甘子汁时可能具有协同作用[21]。果胶酶含量较高时，纤维素不能被充分降解，而当纤维素含量较高时，果胶不能被充分降解，这可能是不同酶质量比导致余甘子汁中可溶性固形物含量和总酸含量及余甘子汁出汁率先增后减的原因。综合上述结果表明，果胶酶-纤维素酶复合酶的最佳质量比为1∶1。
2.3 酶解时间对余甘子汁出汁率、可溶性固形物含量及总酸含量的影响
酶解时间对余甘子汁出汁率、可溶性固形物含量及总酸含量的影响见图3。
图3 酶解时间对余甘子汁出汁率、可溶性固形物含量及总酸含量的影响
Fig.3 Effect of enzymatic digestion time on juice yield，soluble solids content and total acid content
不同小写字母表示同组数据间有显著性差异（p＜0.05）。
由图3可知，当酶解时间为3 h时，余甘子汁的出汁率最高，为91.54%。同时，其可溶性固形物含量及总酸含量也上升到较高值，分别为12.53%和27.18 g/L。随着酶解时间的继续延长，对余甘子汁的出汁率、可溶性固形物含量及总酸含量无显著影响（p＞0.05）。综合上述结果表明，余甘子汁酶解的最佳时间为3 h。
2.4 酶解温度对余甘子汁出汁率、可溶性固形物含量及总酸含量的影响
酶解温度对余甘子汁出汁率、可溶性固形物含量及总酸含量的影响见图4。
图4 酶解温度对余甘子汁出汁率、可溶性固形物含量及总酸含量的影响
Fig.4 Effect of enzymatic digestion temperature on juice yield，soluble solids content and total acid content
不同小写字母表示同组数据间有显著性差异（p＜0.05）。
由图4可知，当酶解温度为55℃时，余甘子汁的出汁率最高，为92.15%。同时，其可溶性固形物含量及总酸含量也上升到最高值，分别为11.90%和26.61 g/L。但随着酶解温度的升高，酶活性逐渐降低，使得酶解效率降低，余甘子汁的出汁率、可溶性固形物含量及总酸含量均显著下降（p＜0.05）。综合上述结果表明，余甘子汁酶解的最佳温度为55℃。
2.5 响应面设计及结果
2.5.1 响应面试验结果与方差分析
应用Design-Expert 12.0对试验结果进行多元回归分析，结果如表2所示。
表2 复合酶酶解余甘子汁的响应面试验设计与结果
Table 2 Response surface experimental design and results for the enzymatic digestion of Phyllanthus emblica L.by a complex enzyme
试验号 A酶解温度B酶解时间C复合酶添加量D复合酶质量比 出汁率/%1 -1 -1 0 0 87.97 2 1 -1 0 0 86.81 3 -1 1 0 0 87.75 4 1 1 0 0 86.82 5 0 0 -1 -1 84.45 6 0 0 1 -1 84.35 7 0 0 -1 1 82.02 8 0 0 1 1 82.18 9 -1 0 0 -1 83.62 10 1 0 0 -1 84.09 11 -1 0 0 1 84.16 12 1 0 0 1 81.77 13 0 -1 -1 0 88.22 14 0 1 -1 0 87.27
续表2 复合酶酶解余甘子汁的响应面试验设计与结果
Continue table 2 Response surface experimental design and results for the enzymatic digestion of Phyllanthus emblica L.by a complex enzyme
试验号 A酶解温度B酶解时间C复合酶添加量D复合酶质量比 出汁率/%15 0 -1 1 0 87.63 16 0 1 1 0 88.50 17 -1 0 -1 0 87.85 18 1 0 -1 0 87.53 19 -1 0 1 0 87.43 20 1 0 1 0 87.23 21 0 -1 0 -1 84.33 22 0 1 0 -1 83.42 23 0 -1 0 1 81.64 24 0 1 0 1 81.89 25 0 0 0 0 88.72 26 0 0 0 0 88.53 27 0 0 0 0 89.12 28 0 0 0 0 88.93 29 0 0 0 0 89.49
对表2试验数据进行回归分析，求得多元二次回归方程为出汁率/%=88.96-0.38A-0.08B-0.002C-0.88D+0.06AB+0.03AC-0.72AD+0.46BC+0.29BD+0.07CD-0.72A2-0.82B2-0.52C2-5.11D2。
对出汁率回归模型进行方差分析，结果见表3。
表3 余甘子出汁率回归模型方差分析
Table 3 Juice yield regression model ANOVA
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 p值 显著性模型 185.42 14 13.24 54.30 ＜0.000 1 **A酶解温度 1.71 1 1.71 7.01 0.019 1 *B酶解时间 0.075 2 1 0.075 2 0.308 3 0.587 5 C复合酶添加量 0 1 0 0.000 1 0.990 8 D复合酶质量比 9.36 1 9.36 38.39 ＜0.000 1 **AB 0.013 2 1 0.013 2 0.054 2 0.819 3 AC 0.003 6 1 0.003 6 0.014 8 0.905 0 AD 2.04 1 2.04 8.38 0.011 7 *BC 0.828 1 1 0.828 1 3.39 0.086 7 BD 0.336 4 1 0.336 4 1.38 0.259 8 CD 0.016 9 1 0.016 9 0.069 3 0.796 2 A2 3.38 1 3.38 13.87 0.002 3 *B2 4.36 1 4.36 17.87 0.000 8 **C2 1.74 1 1.74 7.15 0.018 1 *D2 169.45 1 169.45 694.67＜0.000 1 **剩余 3.41 14 0.244
续表3 余甘子出汁率回归模型方差分析
Continue table 3 Juice yield regression model ANOVA
注：*表示差异显著（p＜0.05），**表示差异极显著（p＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 p值 显著性失拟 2.87 10 0.287 2.08 0.249 7误差 0.55 4 0.138总和 188.83 28
由表3可知，模型p＜0.000 1，表明模型极显著；失拟 p=0.249 7＞0.05，差异不显著。模型 R2=0.981 9，R2Adj=0.963 8，说明预测值与实测值间相关性较好，该二次回归模型适当，具有实际意义。并且由各因素均方值可知，各种因素对出汁率的影响顺序为复合酶质量比＞酶解温度＞酶解时间＞复合酶添加量。
2.5.2 响应面交互作用分析
通过Design-Expert 12.0软件中响应面优化分析方法得出酶解时间、酶解温度、复合酶质量比和复合酶添加量各交互因素对出汁率的响应面图和等高线图，如图5所示。根据响应面图中的曲面坡度可知，各因素对响应值的影响大小，坡面越陡说明因素对响应值的影响越大。而根据等高线形状可知各因素之间交互作用的强弱，等高线呈椭圆形表明因素间的交互作用显著。
图5 酶解温度和复合酶质量比交互作用对出汁率的影响
Fig.5 Effect of the interaction between enzymatic digestion temperature and enzyme complex ratio on juice yield
由图5可知，酶解温度和复合酶质量比交互作用的曲面较陡且等高线形状呈椭圆形，说明酶解温度和复合酶质量比对余甘子汁出汁率影响较大。同时，结合表3可知，一次项D和交互项B2、D2达到极显著影响水平，一次项A、交互项AD、A2、C2达到显著水平。说明复合酶质量比对余甘子汁的出汁率影响极显著（p＜0.01），酶解温度、酶解温度和复合酶质量比交互作用对余甘子汁的出汁率影响显著（p＜0.05）。
2.5.3 复合酶酶解余甘子汁响应面试验模型的验证
根据Design-Expert 12.0软件分析出的若干解决方案条件及其相应预测值，考虑保证高响应值，结合实际应用需要，对响应面优化结果进行最优分析的验证，获得最佳参数组合为酶解温度55℃、酶解时间2.9 h、复合酶添加量0.01%、复合酶质量比1.1∶1，3次平行试验得到实测值余甘子汁出汁率（88.81±0.20）%，该值与预测值出汁率88.99%的相对误差为0.20%，小于1%，同时，测得可溶性固形物含量为（14.57±0.06）%、总酸含量为（29.28±0.15）g/L。说明数值模拟和回归方程的预测值与试验值之间具有较好的拟合度，验证了该模型的正确性。
3 讨论与结论
罗兰等[22]利用纤维素酶辅助超声提取余甘子多糖工艺的研究，其研究结果表明，在超声温度41℃、液料比6∶1、超声时间75 min、超声功率300 W的工艺条件下，余甘子多糖提取率达到最佳，为5.76%。本研究与其研究相比较，都运用了生物酶法，但本研究运用果胶酶-纤维素酶复合酶法，不仅能将余甘子细胞壁中的纤维素降解，其果胶质的降解更能减少后续加工中沉淀现象。刘盈盈等[15]利用果胶酶-纤维素酶复合酶法优化澄清余甘子汁，研究结果表明，在复合酶添加量0.01%、酶解温度55℃、酶解3 h的条件下，得到余甘子汁的褐变度为0.452，透光率为94.0%，和空白组相比，褐变度无明显增加，透光率相对增加。本研究与其研究结果相比较，结果基本一致，而且本试验更进一步研究了复合酶质量比对余甘子汁出汁率的影响，得到了最佳复合酶质量比1.1∶1的结果，更好地研究了两种复合酶的用量比例关系，可为余甘子的实际生产应用提供一定参考。刘东[23]研究的余甘子清汁饮料的酶解工艺条件为果胶酶添加量0.02%、纤维素酶添加量0.04%，并在45℃下酶解3 h，果肉出汁率为77.6%。本研究与其研究相比较，研究材料皆为经过一次榨汁得到的粗滤余甘子汁，并对粗滤的余甘子汁进行二次榨汁，以达到提高出汁率的效果，通过对比发现本研究出汁率为（88.81±0.20）%，相对提高了（11.21±0.20）%；刘东[23]的研究用酶量较高，而本研究通过果胶酶和纤维素酶复配，减少了酶的用量；温度有差异的原因可能是原料和酶的产地、性质不同。综合上述，本研究使用复合酶法酶解余甘子汁使其出汁率提高具有一定的效果和优势，并且试验过程没有试剂污染，环境污染小，与低碳经济的原则相契合，酶解工艺比较简单、操作便捷，出汁率较高，可以为余甘子加工的规模化和产业化提供一定试验基础。
本研究获得的果胶酶-纤维素复合酶酶解余甘子汁的最佳工艺条件：酶解温度55℃、酶解时间2.9 h、复合酶添加量0.01%、复合酶质量比1.1∶1，在该工艺条件下余甘子汁出汁率为（88.81±0.20）%，与预测值的相对误差为0.20%，小于1%，同时其可溶性固形物含量为（14.57±0.06）%、总酸含量为（29.28±0.15）g/L，该模型具有较好的预测性能。
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