中国是茶的国度，也是茶文化的起源地[1]。茶凭借其健康、营养、快捷等特点，深受广大消费者青睐与欢迎，茶是世界上消费量仅次于水的饮料，全球约有2/3人口喝茶[2]。茶是一种具有营养保健功能的冲泡类饮品，含有蛋白质、碳水化合物、氨基酸、脂质、维生素和矿物质等营养成分[3-4]。大量研究表明，长期饮用茶能降低癌症、心血管疾病、糖尿病和帕金森病等慢性疾病的发病率[5]，且饮茶还具有解渴消食、祛痰、解热、利尿等功效[6]。茶叶中的茶多酚是一种抗氧化物质，具有良好的抗衰老、抗癌作用，且能够有效预防糖尿病、心血管疾病和神经性疾病等病症的发生[3，7]。此外，研究证实茶叶中的多糖、咖啡碱等植物活性成分具有增强免疫力、预防心血管疾病、降血压、抗血栓等保健功能[8-10]。
随着人们生活水平的提高，越来越多的消费者追求口感更佳、便捷且具有保健功效的茶饮品[11]。茶饮料的制备对茶叶原料等级要求不高，茶饮料作为茶叶消费的新兴渠道，具有成本低、口感丰富及绿色健康等特点，已成食品行业研究热点之一[12]。目前，国内外市场上销售的茶饮料，以奶茶、果味茶、气泡茶等调味茶饮料为主。发酵茶饮料是以茶叶浸提液为主要基质，通过微生物的生理代谢作用改善茶叶品质，使得茶饮料呈现出更多的口味和更高的营养价值[13]。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一类能够利用碳水化合物发酵产生乳酸、乙酸、乳酸菌素、胞外多糖等的无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称[14]。乳酸菌不仅可以促进酸类、醇类、酯类等风味物质的产生来提高发酵食品品质，而且是主要的益生菌种类，具有调节胃肠道健康、促进免疫等多种生理功效[15-16]。几项研究结果表明，植物乳杆菌在添加茶提取物的MRS肉汤培养基中生长良好[17-18]，同时植物乳杆菌发酵茶提取物增加了儿茶素的含量和抗氧化生物活性[19]。目前，乳酸菌发酵茶饮料主要集中在风味和稳定性研究[20-21]，益生乳酸菌发酵茶饮料及其生物学功效的研究鲜见报道，研发集益生乳酸菌与茶叶保健功效于一体的新型茶叶制品具有重要意义。
本研究以绿茶浸提液为原料，以自主分离的具有优良益生特性的植物乳杆菌ST为菌种，采用单因素试验和响应面法对乳酸菌发酵绿茶饮料进行工艺优化，并评价最佳工艺条件下发酵绿茶饮料的体外抗氧化活性以及贮藏过程中品质变化情况，旨在为微生物发酵茶饮料新产品的开发提供一定理论依据，研究结果对于促进茶叶资源的合理应用和拓展茶产业结构具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
绿茶茶叶：市售；植物乳杆菌ST：云南农业大学益生菌课题组从发酵食品中自主分离获得，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC NO.13911。
1.2 主要试剂
1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]：美国 Sigma-Aldrich 公司；MRS 肉汤培养基、琼脂粉、CaCl2、NaHCO3、NaCl、碳酸钙：美伦生物科技有限公司；液体石蜡、无水乙醇、异丙醇：成都市科隆化学品有限公司；氯仿：重庆川东化工（集团）有限公司；六偏磷酸钠、羧甲基纤维素（carboxymethyl cellulose，CMC）、β-环状糊精、黄原胶：佳力士添加剂（海安）有限公司；蔗糖：昆明多悦多工贸有限公司；厌氧产气袋：日本三菱MGC公司。以上试剂均为分析纯。
1.3 仪器与设备
721紫外分光光度计：云南赛恩斯实验设备有限公司；LDZX-50L立式高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；SW-CJ-1FD单人单面超净工作台：苏州市华宇净化设备有限公司；PHS-3C pH计：上海雷磁仪器厂；GRX-9203A微生物恒温培养箱：上海福玛实验设备有限公司；TGL-16G高速低温离心机：上海安亭科学仪器厂。
1.4 试验方法
1.4.1 工艺流程
1.4.2 操作要点
1.4.2.1 茶叶浸提液的制备
称取5 g绿茶茶叶置于1 000 mL蒸馏水中，于90℃～95℃条件下浸提20 min，用180目筛过滤即得茶叶浸提液。
1.4.2.2 调配均质
将0.05%六偏磷酸钠、0.3%β-环状糊精、0.04%黄原胶、0.04%CMC以及6.6%蔗糖添加到茶叶浸提液中并混匀。将上述调配好的茶叶浸提液于20 MPa～30 MPa条件下均质3 min～5 min。
1.4.2.3 灌装杀菌
将上述调配均质后的茶汤分装于250 mL玻璃饮料瓶中，每瓶200 mL，于62℃～65℃灭菌30 min，作为绿茶饮料发酵基液。
1.4.2.4 接菌发酵
向上述绿茶发酵基液中接种植物乳杆菌ST 7 lg（CFU/mL），于 38.7 ℃下发酵 17 h，即得发酵绿茶饮料。
1.4.3 乳酸菌发酵绿茶饮料工艺优化
1.4.3.1 乳酸菌发酵绿茶饮料单因素试验
以接种量7 lg（CFU/mL）、加糖量6%、发酵温度37℃、发酵时间24 h为绿茶饮料基础发酵条件，以植物乳杆菌 ST 接种量 4、5 、6、7、8 lg（CFU/mL），加糖量2%、4%、6%、8%、10%，发酵时间 6、9、12、15、18、21、24 h，发酵温度 31、33、35、37、39、41、43 ℃为变量进行单因素试验，考察各因素对乳酸菌发酵绿茶饮料感官品质和抗氧化活性的影响。
1.4.3.2 响应面分析优化乳酸菌发酵茶饮料最佳工艺条件
依据单因素试验确定不同因素的影响程度，选取接种量（A）、加糖量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）4个因素为考察对象，以感官评分（E）为评价指标，利用Design-Expert V8.0.6软件，设计四因素三水平响应面试验，试验因素和水平见表1。
表1 发酵绿茶饮料的试验因素和水平
Table 1 Factors and levels of response surface design for
fermentation of green tea beverage
水平D发酵时间/h-1 6 4 35 12 0 7 6 38 18（CFU/mL）]B加糖量/% C发酵温度/℃因素A接种量/[lg 1 8 8 41 24
1.4.4 感官评分标准
根据GB/T 21733—2008《茶饮料》的相关规定，由具有一定专业知识及良好口感敏锐性的5男5女组成10人感官评定小组对发酵绿茶饮料进行严格打分，感官评分标准见表2[22]。
表2 植物乳杆菌ST发酵绿茶饮料的感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation criteria of Lactobacillus plantarum ST-fermented green tea beverage
评价指标 感官描述 感官评分色泽（20分） 汤色金黄色或黄绿色，色泽明亮 15～20汤色黄色或绿色，色泽一般 8～14汤色深绿色或白色，无光泽 1～7香气（20分） 茶香气味纯正，无异味 15～20茶香气味尚纯正，无异味 8～14茶香气味不纯，带少许杂味 1～7滋味（30分） 口感酸甜可口，具有茶和乳酸菌发酵后的混合滋味，醇厚回甘21～30口感偏甜或偏淡，发酵滋味不明显，纯和回甘，淡淡酸味和涩味9～20口感极酸，难以接受，苦涩味重 1～8组织状态（30分） 组织形态均匀，无沉淀 21～30组织形态较均匀，有少量沉淀 11～20有明显沉淀或分层现象 1～10
1.4.5 植物乳杆菌ST发酵绿茶饮料抗氧化活性分析
1.4.5.1 DPPH自由基清除能力的测定
参照文献方法[23-25]进行DPPH自由基清除率的测定。取1 mL发酵绿茶饮料上清液（4 000 r/min，15 min）加入到1 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液中，振荡摇匀，25℃避光静置30 min，于517 nm处测吸光度，每个样品平行测定3次（取平均值记为A样）。另取2 mL未加样品液的0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，振荡摇匀，25℃避光静置30 min，于517 nm处测其吸光度，记为A0。DPPH自由基清除率计算公式如下。
式中：A样为1 mL样品＋1 mL DPPH乙醇溶液的吸光度；A0为加样品液的0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液的吸光度。
1.4.5.2 ABTS+自由基清除能力的测定
参照文献方法[26-27]进行ABTS+自由基清除能力测定。在734 nm处将ABTS+储备液用pH7.4磷酸缓冲溶液调节吸光度至0.70±0.02，即为ABTS+反应试液。取2 mL ABTS+反应试液，加入20 μL发酵绿茶饮料上清液（4 000 r/min，15 min）并混匀，避光静置6 min后于734 nm处测吸光度，平行测定3次（取平均值记为A样），同时取2.02 mL ABTS+反应试液，避光静置6 min后于734 nm处测吸光度（记为A0）。取2 mL溶剂（去离子水），加入20 μL样品溶液并混匀，避光静置6 min后于734 nm处测其吸光度（记为A对）。ABTS+自由基清除率计算公式如下。
式中：A样为 20 μL 样品+2 mLABTS+反应试液的吸光度；A0为 2.02 mLABTS+反应试液吸光度；A对为 20 μL样品+2 mL溶剂（去离子水）的吸光度。
1.4.6 植物乳杆菌ST发酵绿茶饮料贮藏期内品质变化
按照1.4.1制备乳酸菌发酵绿茶饮料，测定在4℃条件下贮藏 1、3、5、7、14、21 d 的感官评分、pH 值、乳酸菌总数、茶多酚含量、咖啡碱含量和DPPH自由基清除率以及ABTS+自由基清除率。乳酸菌活菌数参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》进行测定；茶多酚含量参照GB/T 21733—2008《茶饮料》进行测定；咖啡碱含量参照GB/T 5009.139—2014《食品安全国家标准饮料中咖啡因的测定》进行测定；pH值利用pH计测定。
1.5 数据处理
数据用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析，采用Ducan法进行多重比较，响应面试验数据分析应用Design-Expert8.0.6软件分析。结果以平均值±标准差表示，显著水平设置P＜0.05。
2 结果与分析
2.1 单因素试验最佳工艺条件的确定
2.1.1 植物乳杆菌ST接种量对发酵绿茶饮料的影响
接种量对发酵绿茶饮料感官评分和自由基清除率的影响见图1。
图1 乳酸菌接种量对发酵绿茶饮料的影响
Fig.1 Effect of inoculation amount of Lactobacillus plantarum ST on fermented green tea beverage
不同小写字母表示具有显著差异，P＜0.05。
由图1可知，随着植物乳杆菌ST接种量的增加，发酵绿茶饮料的感官评分先缓慢上升后急剧下降，分析可能是由于乳酸菌接种量过低，产酸少、发酵风味不足；而接种量过高，产酸过多，导致产品口感较差、接受度差。接种量为7 lg（CFU/mL）时，发酵绿茶饮料的感官评分和抗氧化活性均最高。因此，选取植物乳杆菌ST的最佳接种量为7 lg（CFU/mL）。
2.1.2 蔗糖添加量对发酵绿茶饮料的影响
加糖量对发酵绿茶饮料感官评分和自由基清除率的影响见图2。
图2 蔗糖添加量对发酵绿茶饮料的影响
Fig.2 Effect of sucrose addition on fermented green tea beverage
不同小写字母表示具有显著差异，P＜0.05。
由图2可知，随着加糖量的增加，发酵绿茶饮料的感官评分和抗氧化活性均先缓慢上升再缓慢下降。加糖量低于6%时，感官评分随着加糖量的增加缓慢升高，高于6%时，感官评分有所下降，原因是蔗糖添加过多，口感过于甜腻。加糖量为6%时，绿茶饮料的风味较好，酸甜适中，此时DPPH自由基清除率最高，ABTS+自由基清除率较高。因此选取发酵绿茶饮料的最适加糖量为6%。
2.1.3 发酵时间对发酵绿茶饮料的影响
发酵时间对发酵绿茶饮料感官评分和自由基清除率的影响见图3。
图3 发酵时间对发酵绿茶饮料的影响
Fig.3 Effect of fermentation time on fermented green tea beverage
不同小写字母表示具有显著差异，P＜0.05。
由图3可知，随着发酵时间的延长，发酵绿茶饮料的感官评分先上升后急剧下降，18 h时感官评分最高，18 h后感官评分急剧下降，这可能是因为发酵时间过长，导致产酸过多而影响产品的口感和风味，且发酵18 h时的DPPH自由基清除率最高，ABTS+自由基清除率接近最大值。综合分析，选取发酵绿茶饮料的最适发酵时间为18 h。
2.1.4 发酵温度对发酵绿茶饮料的影响
发酵温度对发酵绿茶饮料感官评分和自由基清除率的影响见图4。
图4 发酵温度对发酵绿茶饮料的影响
Fig.4 Effect of fermentation temperature on fermented green tea beverage
不同小写字母表示具有显著差异，P＜0.05。
由图4可知，随着发酵温度的升高，发酵绿茶饮料感官评分呈先缓慢上升后缓慢下降的趋势，发酵温度为37℃～39℃时，绿茶饮料感官评分最为理想，口感风味最佳，DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除率较高，温度偏高或偏低可能均不利于菌株的生长，进而影响产品风味和抗氧化活性。综合分析，选取发酵绿茶饮料的最适发酵温度为38℃。
2.2 响应面优化乳酸菌发酵绿茶饮料最佳工艺结果分析
响应面试验结果见表3。
表3 发酵绿茶饮料的响应面设计与结果
Table 3 Response surface design and results for the fermentation of green tea beverage
试验号 A B C D E 1 -1 -1 0 0 64.50 2 0 0 1 1 73.00 3 0 -1 1 0 66.00 4 0 0 0 0 73.50 5 1 -1 0 0 56.25 6 0 1 -1 0 72.25 7 1 0 0 -1 68.50 8 0 0 0 0 74.75 9 0 1 0 -1 77.25 10 0 0 1 -1 76.50 11 0 0 -1 -1 69.50 12 1 0 -1 0 64.75 13 1 0 1 0 59.75 14 0 -1 0 1 68.25 15 -1 0 1 0 70.50 16 -1 1 0 0 70.25 17 1 1 0 0 65.75 18 -1 0 0 1 71.25 19 0 0 0 0 74.00 20 -1 0 0 -1 68.00
续表3 发酵绿茶饮料的响应面设计与结果
Continue table 3 Response surface design and results for the fermentation of green tea beverage
试验号 A B C D E 21 0 1 1 0 72.00 22 0 -1 -1 0 63.75 23 0 0 0 0 75.55 24 0 1 0 1 72.50 25 0 0 0 0 73.50 26 0 0 -1 1 71.25 27 0 -1 0 -1 65.50 28 -1 0 -1 0 65.25 29 1 0 0 1 58.25
运用Design-Expert 8.0对表3中的感官评分进行回归拟合，得到二次多项回归方程：E=74.26-3.04A+3.81B+0.92C-0.90D+0.94AB-2.56AC-3.37AD-0.63BC-1.87BD-1.31CD-7.20A2-3.30B2-2.02C2-0.11D2。
对该响应面模型进行显著性分析，结果如表4所示。
表4 二次多项模型及各项的方差分析
Table 4 Analysis of variance of quadratic multinomial models and items
注：*表示差异显著（P＜0.05）；**表示差异极显著（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 783.73 14 55.98 36.87 ＜0.000 1 **A接种量 111.02 1 111.02 73.12 ＜0.000 1 **B加糖量 174.42 1 174.42 114.87 ＜0.000 1 **C发酵温度 10.08 1 10.08 6.64 0.021 9 *D发酵时间 9.63 1 9.63 6.34 0.024 6 *AB 3.52 1 3.52 2.32 0.150 4 AC 26.27 1 26.27 17.3 0.001 **AD 45.56 1 45.56 30.01 ＜0.000 1 **BC 1.56 1 1.56 1.03 0.327 6 BD 14.06 1 14.06 9.26 0.008 8 **CD 6.89 1 6.89 4.54 0.051 4 A2 336.53 1 336.53 221.64 ＜0.000 1 **B2 70.5 1 70.5 46.43 ＜0.000 1 **C2 26.35 1 26.35 17.35 0.001 **D2 0.077 1 0.077 0.051 0.824 7残差 21.26 14 1.52失拟项 18.13 10 1.81 2.32 0.216 7误差 3.13 4 0.78总和 804.99 28
由表4可知，模型P＜0.000 1，说明该模型极显著。在模型中，A、B、AC、AD、BD、A2、B2和 C2项差异极显著（P＜0.01），C 和 D 项差异显著（P＜0.05）；各发酵因素对感官评分的影响次序是B>A>C>D，即加糖量＞接种量＞发酵温度＞发酵时间。相关系数R2=0.973 6，表明此模型的拟合度很好，能较好地描述因素与响应值之间的关系，可以解释97.36%的变化。R2Adj=0.947 2，说明试验误差小，可信度较高。因此，可用该模型来确定植物乳杆菌ST发酵绿茶饮料的最优工艺。
各因素之间交互作用的等高线3D响应面图见图5。
图5 各试验因素交互作用对发酵绿茶饮料感官评分的响应面图
Fig.5 Response surface plots of effect of interaction of experimental factors on sensory quality of fermented green tea beverage
由图5可知，AC、AD、BD之间交互作用明显，且AD交互效果最好，三维立体图响应面的开口朝下，表明响应面具有最大值，在试验范围内有最优配方。根据上述二次多项回归方程可得，当接种量为7.12 lg（CFU/mL）、加糖量为6.66%、发酵温度为38.72℃、发酵时间为16.83 h时，发酵绿茶饮料的感官评分达75.15。考虑到实际操作将上述工艺条件修正为接种量7 lg（CFU/mL）、加糖量 6.6%、发酵温度 38.7℃、发酵时间17 h。在此工艺条件下进行3次独立试验验证制备的乳酸菌发酵绿茶饮料，得到的感官评分实际值为76.31，与模型预测值接近，证明此模型可靠。
2.3 乳酸菌发酵对绿茶饮料抗氧化活性的影响
抗氧化活性是茶多酚的主要功能活性之一，乳酸菌发酵对茶饮料抗氧化活性的影响见图6。
图6 乳酸菌发酵对绿茶饮料抗氧化活性的影响
Fig.6 Antioxidant activity of fermented green tea beverage
不同小写字母表示具有显著差异，P＜0.05。
由图6可知，与未发酵相比，乳酸菌发酵绿茶饮料的DPPH自由基和ABTS+自由基清除率显著提高（P＜0.05），其中，DPPH自由基清除率提高了10.34%，ABTS+自由基清除率提高了23.10%，表明利用乳酸菌发酵绿茶饮料可以提高绿茶饮料的抗氧化活性。
2.4 乳酸菌发酵绿茶饮料贮藏期品质变化
乳酸菌发酵绿茶饮料4℃贮藏21 d的品质变化结果见图7。
图7 发酵绿茶饮料在贮藏期内的品质变化
Fig.7 Changes in quality of fermented green tea beverage during storage
不同小写字母表示具有显著差异，P＜0.05。
由图7可知，随着贮藏时间的延长，感官评分先升高后降低，乳酸菌活菌数及茶多酚、咖啡因含量均逐渐降低，pH值则整体缓慢增加，分析可能是因为酸性环境的缓冲作用[22]，也可能是贮藏过程中发生了某种酯化反应消耗了酸[28]。贮藏21 d时，乳酸菌活菌数为6.30 lg（CFU/mL），pH值为3.42，茶多酚含量为1 002.98 mg/L，咖啡因含量为 193.58 μg/mL。贮藏过程中，发酵茶饮料无异味和分层，组织状态略有沉淀，可能是由于茶多酚、咖啡因和蛋白质的络合沉淀作用[29]。上述结果表明乳酸菌发酵绿茶饮料冷藏货架期可达21 d。
3 结论
本研究以植物乳杆菌ST接种量、加糖量、发酵时间、发酵温度4个因素进行单因素试验，对乳酸菌发酵绿茶饮料的感官品质及抗氧化活性进行研究。在单因素试验的基础上，采用响应面法对乳酸菌发酵绿茶饮料的工艺进行优化，得到各因素对乳酸菌发酵绿茶饮料影响大小排序为加糖量＞接种量＞发酵温度＞发酵时间。最佳工艺条件为接种量7 lg（CFU/mL）、加糖量6.6%、发酵温度38.7℃、发酵时间17 h，该条件下，发酵绿茶饮料感官评分为76.31，植物乳杆菌ST活菌数均值为8.49 lg（CFU/mL），pH值为3.24，茶多酚含量为1 079.93 mg/L，咖啡因含量为 195.94 μg/mL，DPPH自由基、ABTS+自由基清除率分别为69.91%和42.29%，与未发酵相比均显著增加（P＜0.05）。对乳酸菌发酵绿茶饮料进行4℃、21 d贮藏试验，结果显示，乳酸菌活菌数在 6 lg（CFU/mL）以上，pH 值在 3.24～3.42 之间，茶多酚含量为1 002.98 mg/L，咖啡因含量为193.58 μg/mL，在贮藏期内饮料的风味和口感稳定。
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