米糠是糙米加工的主要副产物（占稻谷的10%），产量高，具有一定的营养价值，但其利用率低，多被用作饲料处理，造成了米糠资源浪费[1-2]。米糠蛋白在米糠营养物质中占13%～18%，富含限制性氨基酸（赖氨酸），是一种优质的谷物蛋白[3]。米糠蛋白具有氨基酸组成合理、生物效价高及消化率高等优点[4]。此外，米糠蛋白还具有低过敏性，可适用于易过敏人群及婴幼儿。因此，充分提取米糠蛋白是改善米糠资源浪费、提高米糠资源利用率的有效途径。
米糠蛋白中的二硫键使蛋白质发生高度聚合，从而导致米糠蛋白提取率低、溶解性差[5]，在食品应用方面受限制。提取米糠蛋白的方法主要有物理法、碱法、酶法等[6]。碱法会导致蛋白质氨基酸之间反应生成有毒物质或变性；酶法会破坏米糠蛋白的天然结构，从而影响其功能特性。相比于以上两种方法，物理法提取具有减小米糠颗粒、打破米糠细胞结构、维持米糠蛋白功能特性，且不引起蛋白质变性等优点，更适用于工业生产。研究发现，超微粉碎能快速、高效地粉碎物料，保持物料原有的理化特性和活性物质。相关研究表明，与普通粉碎相比，经超微粉碎的酸枣仁蛋白质提取率由69.71%提高至76.56%[7-8]。Bedin等[9]对比碱提、超声波辅助碱提等方法，发现超声波辅助提取能在较短时间内获得较高米糠蛋白提取率，且杂质少，对米糠蛋白结构破坏小。超声波能产生高剪切力，破坏米糠细胞结构[10]，增大米糠蛋白分子运动频率和速度；超微粉碎能减小米糠颗粒、打破米糠结构，提高米糠资源利用率[11]；研究表明[12-14]联合两种物理方法较单一物理法更能提高蛋白质的提取率。
目前，超声波和超微粉碎已广泛应用于活性物质的提取，但两者联合作用提取米糠蛋白的报道较少。因此，为了提高米糠蛋白的提取率、加深米糠资源的利用率，本研究联合超微粉碎和超声波提取米糠蛋白，并采用响应面法对米糠蛋白提取工艺进行优化，确定米糠蛋白的高效提取工艺。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜米糠：原阳县八素米业有限公司；正己烷、盐酸、氢氧化钠、硫酸（均为分析纯）：四川西陇科学有限公司；考马斯亮蓝G-250：上海蓝季科技发展有限公司。
1.2 仪器与设备
WF-18小型超微粉碎机：温州顶历医疗器械有限公司；JY92-IIN超声波细胞粉碎机（变幅杆型号Φ10）：宁波新芝生物科技股份有限公司；Kjeltec 8400全自动凯式定氮仪：丹麦福斯公司；UV1800PC紫外可见分光光度计：上海菁华科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 米糠基本成分的测定
分别参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》、GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》、GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》和GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》测定米糠中的水分、灰分、蛋白质和脂肪。
1.3.2 脱脂米糠的制备
新鲜米糠经超微粉碎后，以1∶10（g/mL）的料液比加入正己烷，在（25±2）℃下对米糠进行振荡脱脂3 h，重复3次，静置30 min。上清液通过旋转蒸发回收正己烷，沉淀于通风橱晾干10 h，于-20℃密封保存。
1.3.3 米糠蛋白提取工艺流程
脱脂米糠→以一定料液比加入去离子水→以一定条件（超声功率、超声时间）进行超声波处理（固定超声间歇时间：2、2 s）→调节pH值至9.5→50℃水浴搅拌→5 000 r/min离心30 min→收集上清液，定容→测定上清液中蛋白质含量，计算提取率→酸沉，调节pH值为4.5→冷冻干燥→-20℃贮藏、备用。
1.3.4 米糠蛋白提取率的测定
采用GB 5009.5—2016中的凯式定氮法测定蛋白质含量，米糠蛋白提取率按公式（1）计算。
1.3.5 单因素试验
选择料液比 [1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）]、超声功率（65、130、195、260、325 W）、超声时间（4、8、12、16、20 min）和提取时间（1、2、3、4、5 h）进行单因素试验，探究各因素对米糠蛋白提取率的影响。
1.3.6 响应面优化试验
选取料液比、提取时间和超声时间为优化因素，利用响应面法优化米糠蛋白提取工艺。保持超声功率为130 W，以米糠蛋白提取率为响应值，采用Box-Behnken设计进行试验。因素水平见表1。
表1 响应面因素水平
Table 1 Response surface factor level
水平X1料液比/（g/mL）X2提取时间/hX3超声时间/min-1 1∶40 3 8 0 1∶50 4 12 1 1∶60 5 16
1.3.7 蛋白质溶解度
配制10 mg/mL的米糠蛋白溶液（以pH7.0的磷酸缓冲液配制），（25±2）℃下振荡 30 min，离心 10 min（4 000 r/min），取上清液，经考马斯亮蓝G-250染色后，测定可溶性蛋白质量[15]，溶解度根据公式（2）计算。
1.3.8 数据处理
所有试验重复3次，取平均值。采用SPSS 23.0进行显著性分析（P＜0.05），Design-Expert 10.0.1进行响应面设计、方差分析及预测。
2 结果与分析
2.1 米糠基本成分测定结果
米糠基本成分测定结果见表2。
表2 基本成分的测定
Table 2 Determination of basic components
原料 水分/% 灰分/% 蛋白质/% 脂肪/%米糠 10.68±0.04 9.56±0.07 13.68±0.08 21.36±0.12
如表2所示，原料米糠中水分、灰分、蛋白质和脂肪分别为10.68%、9.56%、13.68%和21.36%。
2.2 单因素试验
2.2.1 料液比对米糠蛋白提取率的影响
料液比对米糠蛋白提取率的影响，结果见图1。
图1 料液比对米糠蛋白提取率的影响
Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of rice bran protein
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图1可知，当溶剂用量较少时，反应体系因淀粉及纤维素等物质[16]吸水膨胀变黏稠，导致流动性变差，蛋白分子扩散变慢，米糠蛋白无法充分溶出，从而降低了蛋白提取率；当料液比为1∶50（g/mL）时，反应体系黏度降低、物料流动性增强且充分扩散[17]，增加了溶液中物质的传质速度，从而提高了米糠蛋白的提取率；但继续增加溶剂用量时，其他非蛋白物质溶出[18]，阻碍了米糠蛋白的溶出，从而导致蛋白提取率降低。因此，提取工艺最佳料液比确定为1∶50（g/mL）。
2.2.2 超声功率对米糠蛋白提取率的影响
超声功率对米糠蛋白提取率的影响见图2。
图2 超声功率对米糠蛋白提取率的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction rate of rice bran protein
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图2可知，当超声功率增加至130 W时，超声波的空化效应破坏了米糠细胞，加快了传质速度，促进了细胞内容物溶出，增大了物质和液体之间的接触面，从而进一步提高了米糠蛋白提取率[19-20]；超声功率继续增加，过强的剪切力破坏了米糠蛋白的高级结构[10，21]，且反应体系温度升高，米糠中淀粉发生糊化，使蛋白质溶出受到阻碍，从而导致米糠蛋白提取率下降。因此，提取工艺最佳超声功率确定为130 W。
2.2.3 超声时间对米糠蛋白提取率的影响
超声时间对米糠蛋白提取率的影响见图3。
图3 超声时间对米糠蛋白提取率的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of rice bran protein
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图3可知，米糠蛋白提取率随超声时间的延长有明显变化。在料液比为1∶50（g/mL）、超声功率为130 W的条件下，当超声时间延长至12 min时，超声波的空化效应逐渐增强，使米糠蛋白与淀粉、纤维素等结合物分离[22]，且空化气泡破裂所产生的压力使米糠结构变得疏松[10]，引入了大量溶剂，增大了细胞内物质与溶剂的接触面，促进了米糠蛋白的溶出；而当超声时间过长时，超声所伴随的热量过高，使米糠蛋白发生变性[22]，导致米糠蛋白提取率下降。因此，提取工艺最佳超声时间确定为12 min。
2.2.4 提取时间对米糠蛋白提取率的影响
提取时间对米糠蛋白提取率的影响见图4。
图4 提取时间对米糠蛋白提取率的影响
Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of rice bran protein
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
在料液比1∶50（g/mL）、超声功率130 W及超声时间12 min的条件下，提取时间对米糠蛋白提取率有明显影响。由图4可知，当提取时间较短时（1h～2 h），米糠蛋白与其结合物的分离程度较小[23]，导致提取率较低；随着提取时间增至4 h，长时间地浸泡使米糠结构变疏松，米糠蛋白大量溶出，导致米糠蛋白提取率逐渐上升；但当提取时间超过4 h时，米糠蛋白因其高聚合活性发生聚集沉淀[18，24]，进而导致米糠蛋白提取率降低。因此，提取工艺最佳提取时间确定为4 h。
2.3 响应面试验及结果分析
根据单因素试验，选择料液比、超声时间及提取时间进行响应面Box-Behnken优化试验，其中固定超声功率为130 W，以米糠蛋白提取率为优化指标。试验设计及结果见表3，方差分析见表4。
表3 试验设计及结果
Table 3 Test design and results
试验号 X1 X2 X3 Y蛋白提取率/%1 0 -1 1 60.54 2-1 1 0 59.31 3 1 -1 0 60.73 4 0 0 0 63.20 5-1 0 -1 61.68 6 0 -1 -1 62.16 7 0 0 0 63.20 8 1 0 -1 63.52 9 0 1 1 61.02 10 -1 0 1 60.75 11 0 0 0 63.20 12 0 0 0 63.20 13 1 0 1 61.41 14 0 1 -1 60.93 15 1 1 0 61.92 16 0 0 0 63.20 17 -1 -1 0 60.22
表4 方差分析
Table 4 Analysis of variance
注：**表示差异极显著，P＜0.01；*表示差异显著，P＜0.05。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 26.49 9 2.94 44.24 ＜0.000 1 **X1 3.95 1 3.95 59.35 0.000 1 **X2 0.028 1 0.028 0.42 0.539 9 X3 2.61 1 2.61 39.24 0.000 4 **X1X2 1.10 1 1.10 16.57 0.004 7 **X1X3 0.35 1 0.35 5.23 0.056 0 X2X3 0.73 1 0.73 10.99 0.012 9 *X12 4.12 1 4.12 61.88 0.000 1 **X22 11.69 1 11.69 175.72 ＜0.000 1 **X32 0.58 1 0.58 8.72 0.021 3 *残差 0.47 7 0.067失拟项 0.47 3 0.16纯误差 0 4 0总和 26.96 16
利用软件Design-Expert 10.0.1对试验数据进行方差分析，得到拟合后的二次多项回归方程为Y=63.20+0.70X1-0.059X2-0.57X3+0.52X1X2-0.30X1X3+0.43X2X3-0.99X12-1.67X22-0.37X32。由表4可知，该回归模型极显著（P＜0.0001），且模型的相关系数R2=0.9827，R2adj=0.960 5，说明该模型置信度高。因此，超微超声辅助提取工艺可用该模型进行分析和预测。根据F值的大小可以判断出各因素对米糠蛋白提取率的影响程度：X1＞X3＞X2，即料液比＞超声时间＞提取时间。根据 P值可以看出，X1、X3影响极显著（P＜0.01），X2影响不显著（P＞0.05）；X1和X2的交互作用对Y值的影响极显著（P＜0.01），X2和 X3的交互作用显著（P＜0.05），而 X1和X3的交互作用不显著（P＞0.05），可能是由于因素的主效应大于因素间的相互作用。
图5是各因素影响米糠蛋白提取率的直观反映。根据响应曲面坡度及等高线密度可判断交互作用是否显著，坡度越陡、密度越密，交互作用越显著。
图5 各因素交互作用响应面
Fig.5 Response surface of interaction of factors
由图5可知，料液比和提取时间、提取时间和超声时间的交互作用显著，料液比和超声时间的交互作用不显著，其结论与方差分析相符。
2.4 最佳工艺条件的确定及验证
对该回归模型进行计算，得最佳提取工艺为料液比1∶56.52（g/mL）、提取时间 4.06h、超声时间9.28min。根据实际可操作性，修改工艺参数为料液比1∶57（g/mL）、提取时间4 h、超声时间9 min。经多次验证试验，米糠蛋白提取率为（64.31±0.18）%，与预测结果63.58%接近。说明该回归模型能准确预测试验结果。因此，确定最佳工艺参数为料液比1∶57（g/mL）、提取时间4 h、超声时间9 min。
2.5 提取方法比较
将超微联合超声提取与传统碱溶酸沉提取的米糠蛋白进行比较，以蛋白提取率、蛋白纯度和蛋白溶解度为比较参数，结果如图6所示。
图6 提取工艺对米糠蛋白提取率、纯度和溶解度影响
Fig.6 Effect of extraction process on extraction rate，purity and solubility of rice bran protein
**表示差异极显著（P＜0.01）；*表示差异显著（P＜0.05）。
由图6可知，经超微联合超声提取，米糠蛋白提取率有极显著提升，由传统碱溶酸沉提取的45.41%提升到64.31%，提高了41.62%。超微粉碎减小了米糠粒径，增大了米糠与碱液的接触面，使得米糠蛋白更易提取；同时由于超声波的空化效应加快了米糠混合液的传质速度，加速了米糠蛋白的溶出，并且破坏了米糠蛋白与其他非蛋白物质的聚集体，使得酸沉下来的蛋白质纯度升高。进一步研究发现，经超微联合超声提取的米糠蛋白溶解度为25.49%，相比碱溶酸沉法有明显提升。
3 结论
研究发现经超微联合超声提取能有效提高米糠蛋白的提取率。通过单因素试验和响应面优化后，得到最佳提取工艺：料液比 1∶57（g/mL）、提取时间4 h、超声时间9min。最终米糠蛋白提取率为（64.31±0.18）%。进一步研究发现，经超微联合超声提取后，米糠蛋白的提取率、纯度及溶解度较传统碱溶酸沉提取有所提高。本研究有效提高了米糠蛋白的提取率，同时发现经此提取，其溶解度有所改善，后续将对米糠蛋白的增溶工艺进行探究，为米糠蛋白质资源的精加工及利用提供参考。
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