牡蛎又称为生蚝，根据《2020中国渔业统计年鉴》[1]，2019年贝类总产量占全国海水养殖产量的69.67%，其中牡蛎产量占比为36.31%。牡蛎肉鲜美多汁，富含多种人体日常所需要的营养成分，营养价值较高，一直以来被称作“海洋牛奶”[2]。我国养殖牡蛎种类较多，而市场中常见的食用牡蛎品种是长牡蛎。长牡蛎又称太平洋牡蛎，原产于亚洲东部，具有抗逆性强、生长快等优点[3]，被广泛引进到全球多个国家和地区养殖，也是我国经济海产品中产量最大的贝类[1-4]。近几年，未经烹饪的鲜牡蛎受到部分消费者的喜爱，尤其是冬季牡蛎集中上市季节（11月到次年3月）。而贝类滤食这一特性使得牡蛎易于富集海洋环境中的致病菌，从而成为人类致病菌的携带者。江河及海洋环境中普遍存在着大量的弧菌，是牡蛎中最常见的食源性致病菌，这些细菌往往会通过未被充分加热的海产品或交叉污染的食物进入人体，导致腹泻、呕吐等急性肠胃炎症状[5-7]。长牡蛎所携带的微生物造成了长牡蛎食用过程中的安全隐患，而其体内的微生物群落组成与长牡蛎生长或繁殖的环境有着巨大关系。在水体环境和生物饵料的影响下，长牡蛎体内微生物种类、数量组成在时间和空间维度上存在差异[8]，给生食长牡蛎引发食源性疾病的风险评估造成困难。传统微生物群落分析多依赖于培养微生物与其他方法相结合，但这种研究方法的局限性很大。而近几年来，快速发展的高通量测序技术可以同时对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，具有高准确性、高通量、高灵敏度和低运行成本等优势，不仅突破了传统微生物学限制，而且可以在同一时间检测样品中的高丰度菌群和低丰度菌群，并将这些菌群的丰富度用数字的方式直观地呈现出来[9]。
有学者采用Illumina HiSeq高通量测序技术对牡蛎的微生物群落结构及其在冷藏过程中的变化进行了分析[10-11]，在初始阶段，牡蛎体的细菌群落在属水平上丰度最高的菌属为弧菌属（Vibrio）、希瓦氏菌属（Shewanella）和交替假单胞菌属（Pseudoalteromonas）。长牡蛎在不同季节下的品质有较大差异，食用安全风险也有可能不同，其微生物群落的季节变化目前尚未有研究报道。本文通过高通量测序技术分析高温季节和低温季节的长牡蛎微生物群落结构及其变化，旨在提供基础信息以便可以更加深入地研究长牡蛎的菌群组成、风险评估及相关调控技术。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
长牡蛎：青岛市即墨区鳌山湾牡蛎养殖场。高温季节采样日期为2019年08月01日，当日海水温度25.2℃；低温季节采样日期为2019年11月12日，当日海水温度15.3℃。样本采集后放置于便携式冰箱中保存，并立即返回实验室，从采集的样本中选取5只完整个体作为5份平行样本，使用无菌海水冲洗后，使用已灭菌的刀具小心割断其闭壳肌，使得外壳能够完整去除，从而保留样本软体组织的完整性，在洁净工作台中切割挑取长牡蛎的闭壳肌、鳃、外套膜和肝胰腺4个组织，置于无菌离心管中。将最后提取出来的20个样本简单处理后，进行高通量测序。
磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）：北京索莱宝科技有限公司；taq mix酶：宝日医生物技术（北京）有限公司；引物515F、806R：上海生工生物工程股份有限公司；GeneJET胶回收试剂盒：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建库试剂盒：Illumina公司；硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖（thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，TCBS）琼脂培养基：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。
1.1.2 仪器与设备
Veriti 96孔梯度型PCR扩增仪、S-2000凝胶成像仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；DYY-6C电泳仪、WD-2105A微型离心机：北京六一生物科技有限公司；LRH-250F生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；SW-CJ-2FD洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；OSE-Y30电动研磨器：天根生化科技（北京）有限公司；MK2000-2干式恒温器：杭州奥盛仪器有限公司；CX30 DC速冻车载冰箱：佛山市艾凯电器有限公司；NovaSeq6000基因测序仪：Illumina公司。
1.2 试验方法
1.2.1 传统培养条件下高、低温季节长牡蛎弧菌变化
高温、低温季节同批样本各选取20个长牡蛎分别采用TCBS琼脂培养基（用于筛选弧菌）进行传统纯培养分析，分离株通过16S rDNA测序鉴定。
1.2.2 DNA提取和聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增
样本基因组DNA采用十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）[12]法提取，通过浓度为1%的琼脂糖凝胶在100 V电压下电泳40 min检测DNA的纯度，采用微量紫外法进行定量。根据鉴定细菌多样性的试验目的，选择V4区进行测序，PCR扩增使用的引物分别为515F和806R[12]，样本DNA采用无菌水稀释至1 ng/μL作为扩增模板。引物序列为 515F:5′-GTTTCGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；806R:5′-GCCAATGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。扩增程序：98 ℃，1 min；98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃30 s，30 个循环；72 ℃ 延伸 5 min。
1.2.3 PCR产物的混合与纯化
根据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后进行PCR产物的纯化，使用浓度为2%的琼脂糖胶在80 V电压下电泳40 min，随后选择长度为400 bp～450 bp的序列进行切胶回收。
1.2.4 文库构建与测序
构建文库使用TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建库试剂盒[13]，文库构建好后经过Qubit定量和文库检测合格后，使用NovaSeq6000进行上机测序。
1.2.5 测序数据处理
根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，去除引物序列后使用Flash软件[14]进行拼接，得到Tags数据；进一步过滤处理[15]得到Clean Tags。根据扩增子分析工具Qiime软件[16]的Tags控制方法，进一步过滤Tags之后，Tags序列通过与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列并去除[17]，得到有效数据。
1.2.6 分类操作单元（operational taxonomic units，OTUs）聚类和物种注释
对1.2.5节得到全部有效数据通过Uparse软件[18]进行聚类，将Identity≥97%Tags数据聚类成OTUs。
对OTUs序列使用Mothur方法与SILVA132[19]的SSUrRNA数据库[20]进行物种注释（定阈值为0.8～1.0），获得分类学信息并分别从界至种各个分类水平统计各样本的群落组成。使用MUSCLE[21]软件进行多重序列比对，得到所有OTUs代表序列的系统发生关系。
根据所有样本在纲水平的物种注释及丰度信息，选取丰度比为前20的属根据丰度信息进行聚类，以便于样本中显著差异物种水平聚集。
1.3 数据处理
为了对高、低温季节长牡蛎体内微生物群落变化情况进行分析，将高温和低温季节各5份长牡蛎、共20个组织样本的测序数据通过NovoMagic云平台合并成高温季节组和低温季节组，并利用平台处理数据和绘制相关的数据图进行比较分析。同时，将高温季节5份长牡蛎的鳃、闭壳肌、外套膜、肝胰腺组织的测序数据合并，低温季节5份长牡蛎的鳃、闭壳肌、外套膜、肝胰腺组织测序数据也按照组织类型合并，采用平台处理数据和绘制相关的数据图进行比较分析。根据物种注释结果，选取高、低温季节或不同组织在不同分类水平上丰度值排名前十的物种生成相对丰度柱形图，对长牡蛎菌群物种组成情况进行展示。使用Qiime 软件计算 Chao1、Shannon、Simpson、ACE、Goodscoverage指数，使用R软件绘制稀释曲线、等级聚类曲线。采用统计学分析指数评估样本中微生物群落的物种丰富度（ACE指数和Chao1指数）和多样性（Shannon指数和Simpson指数）。
2 结果与讨论
2.1 测序数据统计
稀释曲线（rarefaction curve，RC）和等级聚类曲线（rank abundance curve，RAC）常用于描述组内样本多样性。图1展示了样本的稀释曲线和等级聚类曲线图。
图1 稀释曲线和等级聚类曲线
Fig.1 Rarefaction curve and rank abundance
由图1可知，随着测序数量的增加，稀释曲线趋向平缓，能够看出测序数据量逐渐合理，即使有更多的数据量对与发现新的OTUs边际贡献也很小，而从等级聚类曲线的宽度和平滑程度能够看出两组样本中物种分布比较均匀，夏季长牡蛎样本中的物种丰富度要高于低温季节长牡蛎样本。
微生物群落的丰度和多样性可通过Alpha多样性来反映[22]。ACE指数和Chao1指数揭示样本中细菌群落的丰富程度，Shannon指数和Simpson指数揭示样本中细菌群落的多样性。ACE指数与群落中物种数量呈正相关。Chao1指数与细菌群落的物种丰富度呈正相关。此外，Coverage代表各样本的文库覆盖率，可以直接反映测序结果是否具有代表性。表1数据展示了样本内的Alpha多样性指数。
表1 Alpha指数统计表
Table 1 Statistic graph of alpha indices
C h a o 1指数高温季节 7.2 8 0.8 9 2 5 2 6.3 7 0.9 8 3 2 5 4 9.2 7低温季节 5.8 3 0.8 2 2 5 6 1.8 6 0.9 8 0 2 7 0 0.5 3季节 S h a n n o n指数S i m p s o n指数A C E指数C o v e r a g e指数
由表1可知，相比于高温季节，低温季节的长牡蛎样本中，ACE指数、Chao1指数呈上升趋势，而Shannon指数、Simpson指数呈下降趋势，可以看出随着季节温度的降低，长牡蛎中微生物物种数量有所增加，但细菌群落的多样性有所减少。且Coverage指数均在0.980以上，说明测序对样本中细菌的覆盖率高，并且测序深度符合分析长牡蛎样品中细菌多样性的要求[23]。
2.2 长牡蛎测序结果OTU聚类及物种注释
2.2.1 OTUs聚类
利用高通量测序技术得到高温和低温季节长牡蛎样本下机原始数据后，通过相关处理后，得到高温季节样本的有效序列范围为39 767条～69 778条，平均长度范围为408 bp～429 bp；低温季节样本的有效序列范围为44 105条～69 381条，平均长度范围为397 bp～416 bp。对高温季节和低温季节这两个季节样本的Effective Tags进行聚类后分别得到9625、9253个OTUs，其中高温季节和低温季节样本共有OTUs 4 809个。
2.2.2 门、纲、目、科水平上高温、低温季节及不同组织间的长牡蛎物种注释
高温和低温季节长牡蛎样本整体的微生物物种注释结果如图2所示。
图2 不同季节下在门、纲、目和科水平上长牡蛎中细菌群落的物种注释结果
Fig.2 Species annotation results of bacterial communities in Crassostrea gigas at phylum,class,order and family levels in different seasons
在门的水平上，高温季节长牡蛎样品中附着的主导细菌为变形菌门（Proteobacteria，40.35%）、厚壁菌门（Firmicutes，19.87%）、放线菌门（Actinobacteria，12.23%）和拟杆菌门（Bacteroidetes，10.39%）；而低温季节长牡蛎样品中放线菌门占比从12.23%下降为4.14%，不再是优势菌群；蓝细菌门（Cyanobacteria）占比由2.61%上升为9.05%，其它变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门仍然是主导菌群。在纲、目、科水平上，高温季节的长牡蛎样品以γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria，23.52%）、梭菌目（Clostridiales，14.45%）、毛螺菌科（Lachnospiraceae，5.47%）、莫拉氏菌科（Moraxellaceae，5.34%）和双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae，5.17%）为主；低温季节的长牡蛎样品以α-变形菌纲（Alphaproteobacteria，33.00%）、鞘脂单胞菌目（Sphingomonadales，22.87%）、鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae，22.87%）为主，放线菌和蓝细菌未得到更为详细的物种分类，变化趋势同门水平一致。部分细菌组成的季节差异变化可能与细菌特性有关，根据相关资料[24-25]，蓝细菌在干燥、低温和长期黑暗等条件下，可形成休眠状态的静息孢子，比放线菌更加耐寒抗冻。其他细菌种类如梭杆菌门（Fusobacteria）等在高温和低温季节群落中占比相差不大。
长牡蛎不同组织的菌群结构季节差异如图3所示。
图3 不同季节下长牡蛎4个组织中细菌群落在门、纲、目和科水平上的物种注释结果
Fig.3 Species annotation results of bacterial communities in 4 tissues of Crassostrea gigas at phylum，class，order and family levels in different seasons
序号1为高温季节样本；序号2为低温季节样本。
高温季节下鳃、闭壳肌和外套膜3种组织的菌群结构较为相似，优势菌群为变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门。肝胰腺组织的微生物群落组成与上述3种组织中的差异较大，其中厚壁菌门占比（27.90%）比上述3种组织（14.99%～19.74%）高；软壁菌门占比17.74%，远远高于其它组织（＜1%）；而变形菌门占比为25.80%，远低于在其它3个组织中的占比（42.75%～48.30%）。低温季节下长牡蛎不同组织的微生物群落结构存在较大差异，变形菌门在闭壳肌中占比21.74%，远小于在其它3种组织（46.92%～59.0%）；蓝细菌门在肝胰腺中占比26.22%，而远高于其它3种组织（1.24%～5.76%）；软壁菌门在鳃中占比20.35%，远高于其他3种组织（0.21%～0.76%）；拟杆菌门在闭壳肌中占比28.22%，远高于其他3种组织（4.29%～6.95%）。
从高温季节到低温季节，随着生长季节温度的降低，长牡蛎鳃、肝胰腺、闭壳肌组织的菌群构成均发生了明显变化。鳃组织中优势菌群厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门占比减少；变形菌门占比略有增加，其中α-变形菌纲占比大幅增加，主要包括红螺菌目、鞘脂单胞菌目，而γ-变形菌纲占比大幅减少；软壁菌门（Tenericutes）从0.87%大幅增加至20.34%，主要包括软壁菌纲、支原体目、支原体科微生物；在肝胰腺组织中，优势菌群中厚壁菌门、软壁菌门（支原体科）和放线菌门的占比大幅降低，蓝细菌门的占比从6.31%大幅上升至26.30%。闭壳肌组织中，厚壁菌门、拟杆菌门占比上升明显，而变形杆菌门占比大幅降低，其中莫拉氏菌科由19.06%降至0.16%。外套膜组织高低温季节的菌群组成在门水平差异较小。从高温季节到低温季节，所有组织中变形菌门中的鞘脂单胞菌科细菌占比均大幅上升。
2.2.3 属水平上高温、低温季节及不同组织间的长牡蛎微生物物种注释
属水平上高、低温季节长牡蛎细菌群落组成情况如表2所示。
表2 高、低温季节长牡蛎附着细菌群落在属水平的分布情况
Table 2 Distribution of bacterial communities attached to Crassostrea gigas at genus level in different seasons
低温季节双歧杆菌属Bifidobacterium 5.11 0.58栖水菌属Enhydrobacter 5.03 0.05内源性单胞菌属Endozoicomonas 4.81 3.50甲基杆菌属Methylobacterium 3.04 1.79乳杆菌属Lactobacillus 1.98 1.28分类不明确的肠杆菌科unidentified_Enterobacteriaceae 1.73 1.00分类不明确的瘤胃球菌科unidentified_Ruminococcaceae 1.71 0.88分类不明确的毛螺菌科unidentified_Lachnospiraceae 1.61 1.05脱硫弧菌属Desulfovibrio 1.57 0.10布劳特氏菌属Blautia 1.37 1.12弧菌属Vibrio 1.25 0.10分类不明确的梭菌目unidentified_Clostridiales 1.24 0.28拟杆菌属Bacteroides 1.21 1.19分类不明确的蓝细菌unidentified_Cyanobacteria 1.20 7.70栖粪杆菌属Faecalibacterium 0.91 1.06鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas 0.80 21.13鞘氨酸单胞菌Sphingoaurantiacus 0.71 0.21链球菌属Streptococcus 0.67 1.49支原体属Mycoplasma 0.53 5.08嗜血菌属Haemophilus 0.10 1.03其他Others 63.42 49.35属占比/%高温季节
高温季节长牡蛎样品中双歧杆菌属（5.11%）、栖水菌属（5.03%）、内源性单胞菌属（4.81%）和甲基杆菌属（3.04%）占比相对较高，乳杆菌属（1.98%）等其它细菌的占比较低。低温季节的长牡蛎样品中双歧杆菌属（0.58%）、栖水菌属（0.05%）占比大幅降低，内源性单胞菌属（3.50%）、甲基杆菌属（1.79%）、乳杆菌属（1.28%）占比有所降低，而鞘氨醇单胞菌属（21.13%）、分类不明确的蓝细菌（7.70%）、支原体属（5.08%）的占比大幅增加。另外，高温季节和低温季节的长牡蛎样本中存在大量占比＜0.1%的菌属，分别达到63.42%和49.35%，表明长牡蛎组织的微生物种类组成整体较为复杂，且随着季节温度的降低组织的细菌群落结构略有简化。
此外，食源性病原菌弧菌属在青岛鳌山湾养殖长牡蛎样品中占比较小，并且从高温季节到低温季节存在较为明显的降低趋势，弧菌属在高温季节占比1.25%，在低温季节仅占比0.10%。这一结果与传统纯培养的细菌16SrDNA鉴定结果一致，从20只高温季节长牡蛎中分别分离到了46株弧菌，主要包括溶藻弧菌（11株）、克拉索氏弧菌（4株）、哈维氏弧菌（2株）和灿烂弧菌（2株）等，而从20只低温季节长牡蛎中分离出17株弧菌，包括嗜环弧菌（5株）和灿烂弧菌（2株）等，高低温季节均未分离到副溶血性弧菌。低温季节生食长牡蛎的弧菌感染风险是否有所降低，有待进一步研究。
高通量测序可以详细准确地反映长牡蛎不同组织、不同季节等附着的高丰度菌群和低丰度菌群。曹荣等[10-11]对牡蛎体中附着的细菌种类和牡蛎冷藏过程中的微生物群落变化进行了研究分析，研究发现新鲜牡蛎样品中附着的细菌以变形菌门（77.50%）、γ-变形菌纲（72.30%）和弧菌目（Vibrionales，49.30%）为主[10]。牡蛎冷藏过程中随时间推移，弧菌属（28.30%～6.2%）占比迅速减少，希瓦氏菌属（Shewanella，10.30%）占比先迅速下降至4.00%，后又增加至19.50%，而交替假单胞菌属（Pseudoalteromons，7.20%～32.20%）占比增加[11]。本文所研究的长牡蛎菌群结构结果与上述报道在门和纲水平的优势菌群是较为一致的，但在目水平存在一定差异，如弧菌属在群落中占比较低，占比仅有1.25%和0.10%，这可能受多种因素的影响[11，26]，比如牡蛎的品种、生长水域、饵料、捕获季节、捕获手段等。
不同季节温度下长牡蛎4个组织中微生物丰度聚类热图（属水平）见图4。
图4 不同季节温度下长牡蛎4个组织中微生物丰度聚类热图（属水平）
Fig.4 Heat map of microbial abundance in 4 issues of Crassostrea gigas at genus level in different seasons
序号1为高温季节样本；序号2为低温季节样本。
物种丰度热图将不同丰度微生物反映在颜色梯度上，从而可以对比横向的样本信息和纵向的物种信息。由图4可知，长牡蛎中细菌的组成随季节温度变化发生了显著变化。从高温季节到低温季节，长牡蛎中双歧杆菌属、栖水菌属和拟杆菌属等菌类占比明显下降，而鞘氨醇单胞菌属、支原体属（Mycoplasma）和分类不明确的蓝细菌等菌类占比有明显提升，这可能是因为这几种菌类都能更好地适应低温[24-25]，从而使得这几种菌群在低温季节中占比上升，成为长牡蛎中的高丰度菌群。由此可知，不同季节温度下长牡蛎样品的优势细菌、种类及占比，均发生了改变。此外，可以清晰看出高温季节的外套膜组织中弧菌属占比（3.03%）明显高于其他3个组织（0.48%～0.89%），且高温季节4个组织中弧菌属的占比均高于低温季节4个组织（0.04%～0.16%）。之前的研究也表明副溶血性弧菌更容易定殖于外套膜中[27]，具体可能与夏季海洋环境中弧菌的丰度较高，长牡蛎滤食过程中外套膜与内脏等形成的外套腔直接与海水、排泄物等接触有关。
2.2.4 菌群物种进化情况
通过多序列比对得到所有OTUs的系统进化关系，选取相对丰度前20的属所对应的OTUs数据，并结合置信度信息构建系统发育树，该菌属所对应的门通过分支和扇形的颜色表示，不同样本中该菌属的丰度则由扇环外侧的柱形图来表示，结果见图5。
图5 OTUs的系统发育关系
Fig.5 Phylogenetic relationship of OTUs
*表示该菌未得到属水平的分类。
从图5可以看出，鞘氨醇单胞菌属、内源性单胞菌、支原体属和分类不明确的蓝细菌虽然在系统进化关系上相对较远，但是相对丰度很高。
3 结论
为了掌握长牡蛎物种菌群组成情况，通过高通量测序法对高温和低温季节青岛鳌山湾养殖长牡蛎软组织中的微生物群落结构进行了测序。结果表明，高温季节长牡蛎软体组织群落以变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门为主，在属水平上双歧杆菌属、栖水菌属、内源性单胞菌属和甲基杆菌属的丰度较高。而低温季节长牡蛎软体组织中放线菌门占比大幅降低，蓝细菌门占比有明显上升，属水平上鞘氨醇单胞菌属、分类不明确的蓝细菌和支原体属的丰度较高。潜在食源性致病菌弧菌属在高温季节长牡蛎中占比（1.25%）高于低温季节（0.10%），尤其是在高温季节的外套膜组织（3.03%）占比较高。研究结果可为评估不同季节微生物群落组成对长牡蛎品质与安全的影响提供参考，长牡蛎群落的季节变化对长牡蛎品质、人体健康风险的影响应重点关注。
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