红枣（Ziziphus jujuba Mill.）是鼠李科枣属植物，在我国新疆、陕西、山西、河北等北方地区大量种植[1]。红枣可用于日常直接食用或泡酒、熬粥，在食品工业中一般用于红枣饮品的制作，在烘焙类食品中也会添加红枣[2]。红枣中富含多糖[3]、皂苷、维生素、多酚[4]、脂肪酸[5]等营养物质，其中红枣多糖是红枣最重要的活性成分之一[6]。红枣多糖具有治疗糖尿病、抗炎[7]、增强免疫力、抗癌[8]、抗过敏[9]、抗肿瘤活性[10]等生理功能，同时还表现出较好的抗氧化能力。
食品加工过程中，红枣多糖的损失成为需要解决的重要问题。目前在食品工业中提取多糖的方法大多为传统溶剂提取或高温水提法提取。超声辅助提取多糖最为普遍，此法具有耗时短、操作简单、提取率高的优点[11-14]，而高温水提法由于耗时长、药品用量高且提取率低[15]，已经不能满足市场需要。低共熔溶剂是绿色溶剂，其污染小、药品易获得、毒性小、价格低廉且与其他有机溶剂相比，有更高的溶解性和扩散性[16-19]，因此采用超声辅助低共熔溶剂提取红枣多糖符合日后食品工业发展需求。在研究多糖提取过程中，由于不同低共熔溶剂体系的黏稠度及扩散性和对不同品种多糖的溶解能力不同[20-22]，因此需要对低共熔溶剂体系进行探究。本文以新疆阿克苏红枣作为研究对象，选用超声辅助低共熔溶剂，通过研究不同低共熔溶剂体系、超声温度、超声时间、料液比以及含水率对红枣多糖提取效果影响的规律，确定最优的提取工艺。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
阿克苏红枣：市售。
无水乙醇（分析纯）：天津北联精细化工有限公司；硫酸（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；苯酚（分析纯）：西陇科学股份有限公司；葡萄糖（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；尿素（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；柠檬酸（分析纯）：天津市化学试剂三厂；氯化胆碱、乳酸、1，4-丁二醇、脯氨酸、苹果酸（均为分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
电子天平（LE203E/02）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；超级恒温水浴锅（HH-501）：江苏金怡仪器科技有限公司；超声清洗机（JP-060S）：深圳市洁盟清洗设备有限公司；真空泵（SHZ-DⅢ）：巩义市予华仪器有限责任公司；旋转蒸发仪（RE-3000A）：上海亚荣生化仪器厂；高速台式离心机（TGL-20B）：上海安亭科学仪器厂；涡旋混匀器（VM-02U）：美国精骐有限公司；分光光度计（UV-5500PC）：上海元析仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品前处理
红枣清洗、去核和切片，放入60℃烘箱烘干，烘干后用粉碎机粉碎，过80目筛制备红枣粉。
1.3.2 低共熔溶剂的制备
按照司悦悦[23]的方法，将氯化胆碱分别与乳酸、1，4-丁二醇、尿素、柠檬酸、脯氨酸和苹果酸按比例混合，在85℃条件下水浴搅拌至形成清澈透明的溶液。
1.3.3 总多糖提取工艺以及低共熔溶剂体系的确定
按照倪玉娇等[24]的方法并加以改进，称取1.00 g红枣粉于离心管中，按照料液比1∶20（g/mL），含水率为20%加入低共熔溶剂16 mL，蒸馏水4 mL混合均匀，40℃超声30 min，4 000 r/min条件下离心20 min，取上清液，加入4倍体积无水乙醇于4℃环境中醇沉过夜，4 000 r/min离心20 min收集沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀3次后，继续4 000 r/min离心10 min收集沉淀，沉淀物加水溶解定容至100 mL，测量其多糖提取率。低共熔溶剂的种类及比例见表1。
表1 低共熔溶剂的种类及比例
Table 1 Types and proportions of low eutectic solvents
序号 种类 摩尔比DES-1 氯化胆碱∶乳酸 1∶2 DES-2 氯化胆碱∶1，4-丁二醇 1∶4 DES-3 氯化胆碱∶尿素 1∶2 DES-4 氯化胆碱∶柠檬酸 1∶1 DES-5 氯化胆碱∶脯氨酸∶苹果酸 1∶1∶1
1.3.4 单因素试验
1.3.4.1 超声温度对红枣多糖提取率的影响
在超声时间 30 min，料液比 1∶20（g/mL），含水量20%的条件下，探究超声温度分别为20、30、40、50、60℃对红枣多糖提取率的影响。
1.3.4.2 超声时间对红枣多糖提取率的影响
在超声温度 40 ℃，料液比 1∶20（g/mL），含水量20%的条件下，探究超声时间分别为10、20、30、40、50 min对红枣多糖提取率的影响。
1.3.4.3 料液比对红枣多糖提取率的影响
在超声温度40℃，超声时间为30 min，含水量20%的条件下，探究料液比分别为 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30（g/mL）对红枣多糖提取率的影响。
1.3.4.4 含水量对红枣多糖提取率的影响
在超声温度40℃，超声时间为30 min，料液比为1∶10（g/mL）的条件下，探究含水量分别为 5%、10%、20%、30%、40%对红枣多糖提取率的影响。
1.3.5 响应面试验
在单因素试验基础上，选取超声温度、超声时间、料液比、含水量4个因素，红枣中的多糖提取率为响应值，进行Box-Behnken响应面试验设计，红枣多糖提取率响应面试验因素水平见表2。
表2 红枣多糖提取率响应面试验因素水平
Table 2 Response surface experimental factor level of extraction rate of jujube polysaccharide
水平因素A超声温度/℃B超声时间/min C料液比/（g/mL） D含水量/%-1 30 20 1∶5 10 0 40 30 1∶10 20 1 50 40 1∶15 30
1.3.6 多糖提取率的计算
1.3.6.1 葡萄糖标准曲线的制定
根据郭毓菲等[25]的方法，采用苯酚-硫酸法测定多糖提取率，将葡萄糖放置于105℃烘箱中烘至恒重后，准确称取50 mg，配制成1 mg/mL的葡萄糖标准溶液，分别吸取不同体积1 mg/mL的标准溶液配置成为0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.250、0.500 mg/mL 的标准溶液，分别吸取1 mL标准溶液，加入1 mL 6%苯酚和5 mL浓硫酸，涡旋混匀，90℃煮沸20 min后，于490 nm处测量其吸光值。得线性回归方程为y=9.851 5x-0.018 4，R2=0.998 2，x为葡萄糖浓度，mg/mL；y 为对应吸光值，根据回归方程确定红枣中多糖浓度。
1.3.6.2 多糖提取率的测定方法及计算
吸取红枣粗多糖溶液1mL，稀释到一定体积。在稀释后的溶液中吸取1mL，加入1mL6%苯酚和5mL浓硫酸，使用涡旋混匀器进行涡旋，避光保存20min后，于490 nm处测量其吸光值。多糖提取率计算公式如下。
式中：C为回归方程计算得到红枣多糖的浓度，mg/mL；V为定容的体积，mL；N为稀释的倍数；M为原材料的质量，g。
1.4 数据统计
试验所有数据测定3次，绘图采用origin 2019b软件，响应面分析软件为Design-Expert 8.0.6，采用IBM SPSS Statistics26进行显著性分析和方差分析。
2 结果与分析
2.1 最优低共熔溶剂体系的确定
低共熔溶剂种类对红枣多糖提取率的影响见图1。
图1 低共熔溶剂种类对红枣多糖提取率的影响
Fig.1 Effect types of deep eutectic solvents on extraction rate of jujube polysaccharide
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图1可知，不同低共熔溶剂体系中黏稠度、扩散性、电极性以及对多糖的氢键作用力不同，导致能溶解到低共熔溶剂中的红枣多糖提取率不同[26]。通过比较不同低共熔溶剂种类和比例发现，控制其他条件不变，当氯化胆碱与尿素摩尔比为1∶2时，从红枣粉中提取的多糖提取率最高，可能是氯化胆碱与尿素的混合体系黏稠度较低和扩散性较强，使多糖溶解率升高。因此，确定摩尔比1∶2的氯化胆碱与尿素为提取红枣多糖的低共熔溶剂体系。
2.2 单因素试验
2.2.1 超声温度对红枣多糖提取率的影响
超声温度对红枣多糖提取率影响结果见图2。
图2 超声温度对红枣多糖提取率的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of jujube polysaccharide
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
红枣多糖提取率随着超声温度的升高呈先上升后下降的趋势，并在40℃时多糖提取率最高。这是因为在未达到峰值时，温度升高，使其多糖溶解速度加快；当温度高于40℃后，随着温度继续增大可能会有其他物质析出，导致溶液中的黏稠度增加，抑制多糖的溶解，导致多糖提取率降低[27]。因此，红枣多糖最优提取温度为40℃。
2.2.2 超声时间对红枣多糖提取率的影响
超声时间对红枣多糖提取率的影响结果见图3。
图3 超声时间对红枣多糖提取率的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of jujube polysaccharide
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图3可知，红枣多糖提取率随着超声时间的增加呈先上升后下降的趋势，并在30 min时到达峰值。这主要是由于在30 min之前红枣多糖未能被溶剂充分溶解，导致多糖提取率较低；30 min后，由于过度超声可能引起部分多糖降解，糖苷键发生断裂，细胞破碎，结构破坏，引起多糖提取率减少[28]。因此，红枣多糖提取的最优超声时间为30 min。
2.2.3 料液比对红枣多糖提取率的影响
料液比对红枣多糖提取率的影响结果见图4。
图4 料液比对红枣多糖提取率的影响
Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of jujube polysaccharide
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
如图4所示，随着溶剂用量的不断增加，红枣多糖提取率先上升后下降，在料液比为1∶10（g/mL）时取得最大值，且料液比在 1∶5（g/mL）～1∶20（g/mL）时红枣多糖提取率变化较小。原因是溶剂用量较小时低共熔溶剂体系达到饱和，无法溶解更多的红枣多糖；当溶剂用量较大时红枣粉与溶剂体系的接触面积不断增大，溶解出其他杂质，导致多糖溶解被抑制[29]。因此，选择1∶10（g/mL）为多糖提取的最优料液比。
2.2.4 含水量对红枣多糖提取率的影响
含水量对红枣多糖提取率的影响结果见图5。
图5 含水量对红枣多糖提取率的影响
Fig.5 Effect of water content on extraction rate of jujube polysaccharide
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
如图5所示，红枣多糖提取率随着含水量增大呈现先升高后降低的趋势，在含水量为20%时达到最大值。原因可能是含水量太低时，溶液体系太黏稠，导致多糖无法充分析出[30]；当含水量大于20%后，可能因为含水率太高，使溶液体系中出现了其他的亲水混合物，导致低共熔溶剂与多糖之间的作用力下降，引发多糖提取率减少[31]。因此，红枣多糖提取工艺的最优含水量确定为20%。
2.3 响应面优化提取红枣多糖工艺
2.3.1 响应面试验设计及结果
以红枣多糖提取率为评价指标，设计四因素三水平分析试验，试验设计和结果见表3。
表3 红枣多糖提取率响应面试验设计及结果
Table 3 Response surface design and results of jujube polysaccharide extraction rate
序号 A超声温度 B超声时间 C料液比 D含水量 多糖提取率/%1 -1 -1 0 0 3.69 2 1 -1 0 0 3.54 3 1 1 0 0 4.38 4 1 1 0 0 3.80 5 0 0 -1 -1 4.89 6 0 0 1 -1 4.90 7 0 0 -1 1 5.45 8 0 0 1 1 5.36
续表3 红枣多糖提取率响应面试验设计及结果
Continue table 3 Response surface design and results of jujube polysaccharide extraction rate
序号 A超声温度 B超声时间 C料液比 D含水量 多糖提取率/%9 1 0 0 -1 3.22 10 1 0 0 -1 3.42 11 -1 0 0 1 5.56 12 1 0 0 1 3.59 13 0 -1 -1 0 5.35 14 0 1 -1 0 5.93 15 0 -1 1 0 4.07 16 0 1 1 0 5.56 17 -1 0 -1 0 4.38 18 1 0 -1 0 5.17 19 -1 0 1 0 5.67 20 1 0 1 0 3.74 21 0 -1 0 -1 3.30 22 0 1 0 -1 5.19 23 0 -1 0 1 6.07 24 0 1 0 1 6.10 25 0 0 0 0 8.51 26 0 0 0 0 8.13 27 0 0 0 0 8.30 28 0 0 0 0 7.97 29 0 0 0 0 7.81
2.3.2 回归模型显著性检验及方差分析
通过回归分析，得出红枣多糖提取率的回归方程：红枣多糖提取率=8.14-0.30A+0.41B-0.16C+0.60D-0.11AB-0.68AC-0.54AD+0.23BC-0.47BD-0.025CD-2.48A2-1.63B2-1.19C2-1.62D2。
方差分析结果见表4。
表4 红枣多糖提取率响应面试验回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of response surface experiment regression model for jujube polysaccharide extraction rate
注：*表示P＜0.05，差异显著；**表示P＜0.01，差异极显著。
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 6 8.5 5 1 4 4.9 0 2 4.2 7 ＜0.0 0 0 1 **A 1.1 0 1 1.1 0 5.4 7 0.0 3 4 7 *B 2.0 3 1 2.0 3 1 0.0 8 0.0 0 6 8 **C 0.2 9 1 0.2 9 1.4 4 0.2 4 9 4 D 4.3 3 1 4.3 3 2 1.4 7 0.0 0 0 4 **A B 0.0 5 1 0.0 5 0.2 3 0.6 3 9 6 A C 1.8 5 1 1.8 5 9.1 7 0.0 0 9 0 **A D 1.1 8 1 1.1 8 5.8 3 0.0 3 0 0 *B C 0.2 1 1 0.2 1 1.0 3 0.3 2 8 3 B D 0.8 6 1 0.8 6 4.2 9 0.0 5 7 4 C D 0.0 0 1 0.0 0 0.0 1 0.9 1 3 0 A 2 3 9.9 7 1 3 9.9 7 1 9 8.1 0 ＜0.0 0 0 1 **B 2 1 7.2 3 1 1 7.2 3 8 5.4 0 ＜0.0 0 0 1 **C 2 9.2 4 1 9.2 4 4 5.8 0 ＜0.0 0 0 1 **D 2 1 7.0 5 1 1 7.0 5 8 4.4 9 ＜0.0 0 0 1 **残差 2.8 2 1 4 0.2 0失拟项 2.5 2 1 0 0.2 5 3.3 6 0.1 2 6 9净误差 0.3 0 4 0.0 8总和 7 1.3 8 2 8
根据表4可知 B、D、A2、B2、C2、D2、AC 对红枣多糖提取率影响极显著（P＜0.01）；A、AD对红枣多糖提取率影响显著（P＜0.05）；C、AB、BC、BD、CD 对红枣多糖提取率影响不显著（P＞0.05）。根据F值可知，红枣多糖提取率的影响因素从大到小依次：含水量＞超声时间＞超声温度＞料液比。由模型P值＜0.000 1，极显著；失拟项P值为0.126 9，不显著；R2以及RAdj2分别为0.960 4和0.920 8，可知该模型拟合度较好。由此可知，该模型可以较真实的反应红枣中多糖提取率的提取情况。
2.3.3 交互作用分析
各因素交互作用影响结果见图6。
图6 各因素交互作用对红枣多糖提取率的影响
Fig.6 Effect of interaction of various factors on extraction rate of jujube polysaccharide
通过等高线图和3D图可以直观发现各因素交互作用对红枣多糖提取率的影响。由图6中的等高线可知，超声温度与料液比和含水量之间所呈现的形状为椭圆形，且等高线较密集；且相对应的3D图坡度陡峭，表明超声温度与料液比和含水量之间的交互作用对红枣中的多糖提取率影响较大，与方差分析表中的结论相符合。
2.3.4 最优工艺条件确定及验证试验
通过响应面软件分析得出，红枣多糖最优的提取条件为超声温度39.21℃，超声时间31.00 min，料液比1∶9.82（g/mL），含水量 21.84%，在此条件下，预测的红枣多糖提取率为8.23%。考虑实际情况，调整提取工艺为超声温度 40 ℃，超声时间 30 min，料液比 1∶10（g/mL），含水量为20%，在此条件下进行3次验证试验，得出红枣多糖提取率为（8.33±0.26）%，与模型中预期的结果差异不显著，表明该优化结果可靠，可以用于提取红枣多糖的工艺。
3 结论
在快速发展的食品工业中，传统溶剂提取红枣多糖已不能满足市场需要。由于超声辅助低共熔溶剂提取多糖具有耗时短、提取简单、提取率高的优点，本试验采用超声辅助低共熔溶剂提取红枣多糖，以多糖提取率为评价指标，确定了以氯化胆碱与尿素摩尔比1∶2为低共熔溶剂体系的优化工艺，通过响应面法确定了最优提取工艺为超声温度40℃，超声时间30 min，料液比1∶10（g/mL），含水量20%；在此优化工艺条件下，多糖提取率高达8.33%。该工艺为日后食品工业中红枣多糖的提取奠定了理论基础。
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