苹果采摘后经过分级、清洗、整修、去皮、切分、保鲜、包装等工序得到鲜切苹果，鲜切苹果食用方便，受到广大消费者的青睐，在鲜切果蔬行业占有重要地位[1-2]。近年来，国内市场对鲜切果蔬产品的需求日益增长，促进了鲜切果蔬行业的发展。然而鲜切苹果的加工工序和操作方法不当会带来许多问题，比如在加工过程中经过去皮、切分，鲜切苹果的褐变速度加快、货架期缩短，同时口感风味及其营养价值降低，这成为制约我国鲜切果蔬产业发展的障碍之一[3]。
鲜切苹果极易发生褐变，影响其感官品质和营养价值，同时也影响着人们的可接受度。研究发现，酶促褐变是引起鲜切果蔬褐变的关键因素，对于鲜切苹果亦是如此。鲜切苹果中的酚类物质与氧气接触，在多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的作用下发生氧化反应，生成大量的醌类物质，并迅速聚合形成黑色物质[4-7]。此外，苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）和过氧化物酶（peroxidase，POD）等酶也与褐变的发生密不可分[8]。孙程旭等[9]研究发现，PPO和POD的活性与果蔬的褐变度直接相关。张玉华等[10]发现采用乙醇熏蒸与高氧预处理有利于鲜切苹果的保鲜，防止其营养物质的快速流失，延长其货架期。此外，柠檬酸、半胱氨酸、精氨酸等也能降低其pH值，与PPO活性中心的铜离子相互作用从而抑制褐变的发生[1，3，11]。但是，这些物质存在一定的安全风险，人们更倾向于天然、安全的褐变抑制剂。
植物提取物来源广泛，特别是药食同源植物，天然、安全，从植物提取物中筛选抗褐变的物质是研究方向之一。胡燕等[12]发现洋葱提取液能够有效地抑制鲜切莲藕PPO活性，维持鲜切莲藕的感官品质，有利于鲜切莲藕的保鲜，延长其贮藏期限。葡萄籽提取物、苦荞幼苗提取物也能抑制PPO活性，减轻桃、土豆等的褐变[13-14]。覆盆子（Rubus idaeus L.）是蔷薇科悬钩子属的木本植物，其果实含有丰富的营养物质，并含有水杨酸、酚酸等各类活性成分，可以作为药材入药。程丹等[15]发现覆盆子在药用方面具有明显的效果，其含有的黄酮、生物碱等化学成分有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等功效。但是，目前关于覆盆子水提取液抑制鲜切果蔬褐变的研究较少。
覆盆子具有抑制鲜切苹果褐变的效果，可能与覆盆子中存在的酚类和黄酮类等活性物质相关。为了进一步确定覆盆子中含有的酚类、黄酮类物质成分，采用通过高效液相色谱分析覆盆子水提取液中酚类和黄酮类成分组成，通过筛选研究覆盆子水提取液对苹果褐变的抑制效果、覆盆子水提取液抑制鲜切苹果褐变的处理技术以及抗褐变的机理，旨在为鲜切果蔬的褐变控制提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
苹果：市售，采购后立即保存在冷库中（2℃～4℃）备用。选择形状大小相似（200g左右，直径12cm～14cm）、无损害的新鲜苹果为试验材料；覆盆子、当归、人参、菊花、陈皮、桔梗、黄精、金银花、松花粉：北京康德瑞琪食品有限公司。
1.2 试剂与仪器
1.2.1 试剂
硼酸、硼砂、愈创木酚、邻苯二酚、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、没食子酸、无水乙醇（均为分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；儿茶素、原儿茶酸、表儿茶素、绿原酸、芦丁、阿魏酸、金丝桃苷、根皮苷（均为标准品）：上海源叶生物科技有限公司；无水碳酸钠（分析纯）：上海国药集团；甲醇（色谱级）：美国Sigma公司。
1.2.2 仪器
UV-5100B紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；GL-20G-II高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；HH-4A恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；AL204万分之一天平：瑞士梅特勒-托利多集团；ZFG40制冰机：黄石东贝制冷有限公司；DW-HL388超低温冰柜：中科美菱低温科技有限责任公司；LC-20A高效液相色谱仪：日本岛津公司。
1.3 方法
1.3.1 植物提取物的制备
将覆盆子及其他8种药食同源植物样品在60℃烘干24 h后过120目筛，保存在避光干燥环境下。取过筛后的植物粉末与蒸馏水以1∶20（g/mL）的比例浸提2 h，在8 000 r/min离心20 min。取上清液即植物提取物，保存在4℃下备用。
1.3.2 苹果冻粉制备
为了更好地研究覆盆子水提取液对苹果褐变的抑制作用，将苹果于200 mg/L次氯酸钠溶液中浸泡消毒 2 min，晾干、去皮，切片（5 mm厚度，5 mm～10 mm大小）后迅速用液氮进行冷冻、研磨，研磨后的粉末装入自封袋中，于-80℃的冰箱中保存备用。
1.3.2.1 最佳浸提时间的确定
取苹果液氮冻粉样品2 g于离心管中，迅速加入2 mL水混匀，快速加入覆盆子水提取液2 mL，按1.3.1的步骤，浸提时间设定为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，蒸馏水处理作为空白对照组（CK），常温下贮藏10 h，观察记录褐变程度（1分～5分打分，1为没有褐变，5分为严重褐变），每个处理重复3次。
1.3.2.2 最佳处理倍数的确定
取苹果液氮冻粉样品2 g于离心管中，迅速加入2 mL 水混匀，分别加入稀释 0、2、5、10、20、50、100 倍的覆盆子水提取液2 mL混匀，蒸馏水处理作为空白对照组（CK），常温下贮藏10 h，观察记录褐变程度，每个处理重复3次。
1.3.2.3 最佳处理时间的确定
取苹果液氮冻粉样品2 g于离心管中，迅速加入2 mL水混匀，分别在稀释2倍的浸提液中浸泡1、3、5、10、15、30 min，以蒸馏水处理作为空白对照组（CK），常温下贮藏10 h，观察记录褐变程度，每个处理重复3次。
1.3.3 鲜切苹果处理过程及生理指标测定
苹果去皮、切片之后，放入蒸馏水中处理10 s，然后按照优选的最佳处理工艺，放入覆盆子水提取液处理，以蒸馏水处理（CK）和0.5%VC处理作为对照，考察覆盆子水提取液对鲜切苹果生理指标的影响。
1.3.3.1 PPO活性的测定
PPO活性测定采用邻苯二酚法，参考纪淑娟等[16]的方法并略有改动。1 g苹果样品中加入0.05 g聚乙烯聚吡咯烷酮（polyvinylpolypyrrolidone，PVPP）和 3 mL磷酸缓冲溶液（0.1 mol/L，pH值为6.8），摇匀后离心（10 000 r/min，4℃）15 min，得上清液。取0.75 mL上清液、1.5mL磷酸缓冲液、0.75mL儿茶酚溶液（10mmol/L）组成3 mL反应体系，于475 nm波长下测定吸光值。以每分钟内吸光值增加0.01为一个酶活力单位，结果以U/g表示。
1.3.3.2 POD活性的测定
POD活性测定参考王伟玲等[17]方法并略有改动。1 g苹果样品中加入0.05 g PVPP和3 mL磷酸缓冲溶液（0.1 mol/L，pH 值为 6.0），摇匀后离心（10 000 r/min，4℃）15 min，得上清液。将56 μL愈创木酚、100 mL磷酸缓冲溶液（0.1 mol/L，pH 值为 6.0）和 38 μL 过氧化氢（30%）溶液混合组成反应液。取0.2 mL上清液与2.8 mL反应液混合，于470 nm波长下测定吸光值。以每分钟内吸光值变化0.01为一个酶活力单位，结果以U/g表示。
1.3.3.3 PAL活性的测定
PAL活性的测定方法参考张丽等[18]方法并稍作修改。将5 g苹果样品添加到含有0.05 mol的β-巯基乙醇和0.1 g聚乙烯吡咯烷酮的硼酸钠缓冲液（5 mL，4℃，0.2 mol/L，pH 值为 8.8）中，摇匀后离心（10 000 r/min，4℃）15 min，得上清液即为PAL粗酶液。
将0.8 mL粗酶液、2 mL硼酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH值为8.8）和1 mL的L-苯丙氨酸（0.02 mol/L）混合，在40°C下反应30 min后，加入0.2 mL 6 mol/L的HCl终止反应，用分光光度计在290 nm波长下测定吸光度。以每分钟内吸光值变化0.01为一个酶活力单位，并按如下公式计算酶活性。
式中：A290nm为吸光度变化值；Vt为酶提取液总体积，mL；WF为鲜重，g；Vs为测定时取用酶液体积，mL；t为反应时间，min。
1.3.3.4 总酚含量的测定
总酚含量测定用福林酚法并稍作改动。取1 g苹果样品，加入4 mL丙酮（70%），混匀，避光条件下浸提3 h后离心（10 000 r/min，4℃）15 min，得到上清液。取0.5 mL上清液加入0.5 mL福林酚，摇匀。室温下静置4 min，加入0.5 mL的Na2CO3溶液（10%）和9 mL水，室温避光2 h，于725 nm波长下测定吸光值，以没食子酸为标准品绘制标准曲线，标准曲线方程为y=0.092 3x-0.082 8。测定结果以每千克鲜样中没食子酸当量表示（g/kg FW）。
1.3.3.5 DPPH自由基清除活性的测定
1 g苹果样品中加入5 mL乙醇（95%），充分混匀后离心（10 000 r/min，4℃）15 min得上清液。吸取0.5 mL待测液加入到2.5 mL DPPH乙醇溶液（0.05 mmol/L）中，室温避光反应10 min，于517 nm下测定吸光值，按如下公式计算DPPH自由基清除率。
式中：AB为空白样品的吸光值；AE为样品的吸光值。
1.3.4 覆盆子水提取液成分的高效液相色谱分析
采用配有紫外检测器的高效液相色谱仪用于确定覆盆子水提取液成分的组成。色谱条件：C18色谱柱，流动相A为2%甲酸，流动相B为乙腈，用前过0.45 μm滤膜，脱气，梯度洗脱，流速 0.8 mL/min，进样量 10 μL，检测波长280 nm。配制标准工作液注入高效液相色谱仪检测，以标准品对应峰面积进行定量分析。
取2 g样品粉末加入20 mL的无水乙醇，涡旋振荡混匀，超声辅助萃取后离心（10 000 r/min，4℃）10 min得上清液，上清液通过0.45 μm滤膜过滤，然后存于棕色进样瓶中，进行高效液相色谱分析。
1.4 数据处理
数据用Origin进行处理，以平均值±标准差表示。使用SPSS 22.0统计软件进行方差分析，P＜0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 植物提取物的筛选
不同的植物提取物对苹果褐变的抑制作用如图1所示。
图1 9种植物提取物对鲜切苹果褐变程度的影响
Fig.1 Effect of 9 plant extracts on browning degree of fresh-cut apple
小写字母不同表示存在显著性差异（P＜0.05）。
植物提取物富含活性成分，是控制鲜切果蔬褐变的选择之一。由图1可知，通过对9种药食同源植物进行筛选发现，与CK相比，覆盆子水提取液对鲜切苹果褐变具有较好的抑制效果。常温下放置1 h后，覆盆子处理组颜色最浅。此外，当归、桔梗、金银花也有一定的抑制褐变效果。因此，本研究选择覆盆子水提取液作为鲜切苹果的褐变抑制剂，探究其处理技术及抑制鲜切苹果褐变的机制。
2.2 最佳处理技术优化
不同影响因素对苹果褐变的抑制效果如图2所示。
图2 不同影响因素对苹果褐变的抑制效果
Fig.2 Inhibitory effects of different factors on apple browning
A、B、C分别为覆盆子水提取液不同的浸提时间、处理浓度和处理时间；小写字母不同表示存在显著性差异（P＜0.05）。
如图2A所示，与CK相比，不同覆盆子水提取液浸提时间，对苹果浆液褐变的抑制效果有一定的影响。浸提时间为2.0 h的覆盆子水提取液抑制褐变效果最佳，褐变度仅为1.5，本研究确定最佳浸提时间为2.0 h。
如图2B所示，与CK相比，除稀释100倍外其他稀释倍数下的覆盆子水提取液对苹果浆液褐变均具有一定的抑制效果。稀释5倍的覆盆子水提取液抑制褐变效果最佳。此外，稀释0倍、2倍的覆盆子水提取液以及0.5%VC抑制褐变效果也较好。因此，本研究确定覆盆子水提取液稀释5倍为最佳浓度。
如图2C所示，与CK相比，不同的处理时间下，覆盆子水提取液对苹果浆液褐变均有一定的抑制效果。其中，覆盆子水提取液处理10 min对苹果浆液褐变的抑制效果最佳。因此，本研究确定覆盆子水提取液对鲜切苹果的最佳处理时间为10 min。
2.3 覆盆子水提取液对鲜切苹果各项生理指标的影响
覆盆子水提取液对鲜切苹果褐变度、PPO活性、POD活性、PAL活性、DPPH自由基清除率和总酚含量的影响如图3所示。
图3 覆盆子水提取液对苹果各项生理指标的影响
Fig.3 Effects of raspberry water extract on physiological indexes of apple
A、B、C、D、E、F分别为褐变度、PPO活性、POD活性、PAL活性、DPPH自由基清除率和总酚含量；小写字母不同表示存在显著性差异（P＜0.05）。
如图3A所示，与CK相比，0.5%VC和覆盆子水提取液都能抑制鲜切苹果的褐变，且覆盆子水提取液抑制褐变效果更好。
PPO是酶促褐变的关键酶，能够催化酚类物质形成醌，进而引起褐变[19]。如图3B所示，随着贮藏时间延长，CK鲜切苹果的PPO活性逐渐下降。覆盆子水提取液和0.5%VC处理组样品在贮藏过程中PPO活性也逐渐下降，并且显著低于CK，0.5%VC处理抑制褐变的效果要优于覆盆子水提取液处理组，这与胡燕等[12]的研究结果相似。因此，覆盆子水提取液可以通过抑制鲜切果蔬PPO活性从而抑制酶促褐变的发生[20]。
POD是果蔬中常见的一种氧化还原酶，可以清除果蔬中多余的自由基，维持机体自由基的动态水平；另一方面，POD会在一定条件下催化酚类物质生成醌类化合物，使果蔬发生褐变[21]。如图3C所示，随着贮藏时间的增长，CK、0.5%VC处理组和覆盆子水提取液处理组鲜切苹果的POD活性均呈逐渐降低的趋势。与CK相比，0.5%VC处理组和覆盆子水提取液处理组的POD活性显著降低，这与段志芳[22]用陈皮黄酮处理苹果汁的试验结果相似。因此，覆盆子水提取液可以通过抑制POD活性从而抑制鲜切苹果褐变的发生。
PAL可参与苯丙氨酸代谢过程中酚类物质的形成，与鲜切果蔬的褐变密切相关[23]。如图3D所示，CK样品在贮藏过程中，PAL活性无显著变化。覆盆子水提取液处理后的PAL活性随贮藏时间的延长呈现先升高后下降的趋势，在储藏第4天达到最大值。这可能是因为贮藏前期环境的变化以及苹果处理时对细胞的损伤导致酶活性增强。随储藏时间的延长，0.5%VC处理下的PAL活性呈先升高后降低的趋势，并在第2天达到最高值。在整个贮藏期间，覆盆子水提取液处理组样品PAL活性显著低于CK，但高于0.5%VC处理组。这与林青等[24]的研究结果相似。因此，覆盆子水提取液可以抑制PAL活性，延缓鲜切苹果的褐变。
DPPH自由基清除活性与鲜切果蔬的抗氧化能力密切相关。如图3E所示，随着贮藏时间的延长，CK和覆盆子水提取液处理组、0.5%VC处理组的样品DPPH自由基清除率均呈下降趋势。但是覆盆子水提取液处理组中样品的DPPH自由基清除率显著（P＜0.05）高于CK和0.5%VC处理组。这与连文绮等[25]研究维生素C处理鲜切苹果的结果相似。覆盆子水提取液富含酚类、黄酮类、有机酸等抗氧化活性物质，提高了鲜切苹果的抗氧化活性，间接抑制鲜切苹果的褐变。
酚类物质作为褐变反应的底物参与鲜切苹果的褐变[1]。如图3F所示，随贮藏时间的延长，3个处理组的鲜切苹果总酚含量逐渐下降。并且在整个贮藏期间，覆盆子水提取液处理组和0.5%VC处理组中总酚的含量均高于CK，这可能是由于植物提取物作为外源酚类物质增加鲜切苹果的总酚含量。
2.4 覆盆子水提取液的高效液相色谱分析
覆盆子水提取液的高效液相色谱图及酚类物质含量如图4、图5所示。
图4 覆盆子水提取液高效液相色谱图
Fig.4 HPLC chromatogram of raspberry water extract
图5 覆盆子水提取液中酚类物质的含量
Fig.5 Content of phenolic substances in raspberry water extract
小写字母不同表示存在显著性差异（P＜0.05）。
如图4、图5所示，在覆盆子水提取液中发现了多种活性物质成分，包括儿茶素、p-香豆酸、芦丁、金丝桃苷、阿魏酸等成分，其中阿魏酸、儿茶素含量较高。研究表明米糠提取物可以抑制苹果汁的褐变，抑制作用可能与其含有的p-香豆酸、阿魏酸等酚类物质有关[26]，Li等[14]研究也发现芦丁具有抑制马铃薯褐变的作用。综合来看，覆盆子水提取液的抗褐变作用可能与这些物质的协同作用有关。
3 结论
本研究结果表明，覆盆子水提取液可以显著抑制鲜切苹果的褐变，通过高效液相色谱分析发现覆盆子水提取液中含有儿茶素、绿原酸、芦丁、p-香豆酸、阿魏酸等活性成分。对处理技术进一步优化发现，其最佳浸提时间为2 h，最佳处理浓度为覆盆子粉末与蒸馏水1∶100（g/mL）混合，最佳处理时间为10 min。覆盆子水提取液可通过抑制鲜切苹果中PPO、POD相关褐变酶的活性，提高DPPH自由基清除活性，增强鲜切苹果的抗氧化能力，进而提高鲜切苹果的抗褐变能力。该研究为今后研究植物提取物抑制鲜切苹果的褐变、延长鲜切苹果货架期提供了参考。
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