啤酒是世界上最受消费者欢迎的酒精饮料之一。水、麦芽、谷物、啤酒花和酵母菌是酿造啤酒的主要原料，在酿造过程中，谷物中的可利用糖类被酵母菌转化成乙醇、二氧化碳，同时生成复杂的风味物质[1]。啤酒中的风味物质含量虽然相对较低，但种类丰富，目前已检测出了约1 000种[2]。普遍认为高级醇和酯类物质是啤酒中的主要风味物质，对啤酒的香气与品质具有重要的影响[3-5]。高级醇使啤酒的酒体更加醇厚、丰满，提高酒的品质；酯类物质赋予了啤酒特殊的芳香气味，有助于提高酒的香气[6]。相关研究表明，啤酒中高级醇与酯类含量比例在3∶1～4∶1之间较为适宜[7]。醇酯比过高或过低均会引起风味失调，继而对啤酒的品质产生负面影响[8]。
为了提高啤酒的口感与品质，许多学者通过改变啤酒发酵的工艺参数来调整高级醇与酯类物质的生成量和比例。刘连成[9]和刘明丽等[10]的研究均证明了提高啤酒酵母的接种量会降低高级醇生成量，从而间接降低啤酒的醇酯比。钟成等[11]利用浓度为11°P和14°P的麦汁分别进行啤酒发酵，发现麦汁浓度的提升有助于乙酸乙酯含量的提高。Sun等[12]将啤酒的发酵温度由10℃提升至25℃后，正丙醇、异丁醇、异戊醇和苯乙醇的含量明显提高，同时发酵周期从192h缩短为72h。
除改变工艺参数外，刘玉兰等[13]选育出一株过表达醇乙酰基转移酶编码基因ATF1，同时缺失支链氨基酸转氨酶编码基因BAT2的啤酒酵母菌株，其总酯生成量较出发菌株提高了7.9倍。然而，突变株酿造的啤酒醇酯比仅为0.9∶1，这带来了醇酯比失调的隐患。为了更好地调控啤酒醇酯比，本研究利用3种不同的启动子（TEF1p、VPS8p、ATF1p）分别构建过表达 ATF1基因的啤酒酵母突变株。对3株突变株的生长性能和发酵性能进行全面评估，通过啤酒发酵试验，探究不同启动子对啤酒醇酯比的调控效果，为啤酒酵母工程菌株的选育与应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种与质粒
下面发酵酵母（Saccharomyces pastorianus）S5、大肠杆菌Escherichia coli DH5α、质粒：天津市工业微生物重点实验室保存。本研究涉及到的菌株与质粒信息见表1。
表1 本研究中的菌株与质粒
Table 1 Strains and plasmids in this study
菌株或质粒 相关特性啤酒酵母 S5 下面发酵工业啤酒酵母菌株（Saccharomyces pastorianus）大肠杆菌 E.coli DH5α supE44 ΔlacU169（φ 80lacZΔM15）hsdr17 recAl endAl gyrA96 thi1 relA质粒 pUC19 Ampr，克隆载体pUC-BB Apr，Kanr，BA-BB 重组盒pUG6 Apr，Kanr，loxP-KanMX-loxP 重组盒pUC-PABBK Apr，Kanr，PGKp-ATF1-PGKt重组盒
1.1.2 引物
本研究中的引物均列于表2。引物由Primer 5.0软件进行设计，引物中的酶切位点以下划线标注。
表2 本研究涉及的引物
Table 2 Primers used in this study
序列（5′→3′） 酶切位点扩增引物 TEF1-F CGGGATCCTAGTCAGAGGCAGGAACAG引物名称BamH I TEF1-R TCCCCCGGGGTAACGAACGCAGAATTTTC KT-U CGGGGTACCCAGCTGAAGCTTCGTACGC Kpn I KT-D CGGGGTACCGCATAGGCCACTAGTGGATCTG BamH I VP-R TTCTCATCGATTTCATTCATTCTAGGTGTAATGAGTAATG AP-F TCCCCCGGGGGTGAAGATAAGGAGGACAGCC Kpn I VP-F CGGGATCCTGTCACTCTAGATGTCAAGCC Sma I AP-R TCCCCCGGGGGAGAGCTGATAAATTGATGG Sma I
续表2 本研究涉及的引物
Continue table 2 Primers used in this study
引物名称 序列（5′→3′） 酶切位点扩增引物 BQ-F AACATCTTCGAACGTGAAAACC BQ-R CCCTCTAAAGATTCATCGGCTA APT-F ATCTAAGTTTTAATTACAAAATGAATGAAATCGATGAGAA APT-R TCCCCCGGGGTAACGAACGCAGAATTTTC Sma I VBP-F CATTACTCATTACACCTAGAATGAATGAAATCGATGAGAA ATF-F AACTGCAGATGAATGAAATCGATGAGAA Pst I PT-R AACTGCAGTAACGAACGCAGAATTTTC Kpn I BB-R CGAGCTCGCCCTCTAAAGATTCATCGGCTACT Pst I K-F CGGGGTACCCAGCTGAAGCTTCGTACGC Sac I验证引物 B-U ATGTCGCCGCCGTCAATA T-D TGTTGGCAAGGCTGGACG P-U GTTCGGGTTCAGCGTATT B-D TGACAAAGGGAGTAGCAT V-D GAGCACCCCAGGTCAAAC PT-U GAAAGGGGTAGGAAATGCG KP-D CTGAGCGAGACGAAATAC
1.1.3 主要培养基
LB培养基：氯化钠10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L，121℃灭菌15 min。
YEPD培养基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L，121℃灭菌15 min。筛选酵母重组菌株时，在YEPD培养基中添加硫酸盐遗传霉素溶液（G418）至400 μg/mL。
麦芽汁培养基：称取500 g粉碎后的麦芽，加入2 000 mL蒸馏水，料水比为 1∶4（g/mL），65℃糖化 2 h后过滤并离心，用糖度计调至12°Brix，115℃、0.1 MPa灭菌20 min。
1.1.4 试剂与仪器
限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、Primer STAR DNA聚合酶、连接酶：TaKaRa（大连）公司；质粒提取试剂盒、DNA回收试剂盒：Omega Bio-Tek（美国）公司；乙酸乙酯、正丙醇、异丁醇、异戊醇标准品：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
TgL-16C高速离心机：上海安亭科技仪器厂；Bioscreen C全自动生长曲线分析仪：芬兰OY GrowthCurves公司；7890A型气相色谱仪：安捷伦科技有限公司；TD32糖度计：上海力辰邦西仪器科技有限公司；ZXJD-A1270恒温培养箱：上海智城分析仪制造有限公司。
1.2 方法
1.2.1 重组质粒载体的构建
以啤酒酵母菌株S5基因组为模板，使用引物TEF1-F/TEF1-R、VP-F/VP-R和AP-F/AP-R进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR），分别得到启动子片段TEF1p、VPS8p、ATF1p。以质粒pUC-PABBK和pUG6为模板，经PCR扩增后分别得到片段ATF1-PGK1t和KanMX。将启动子TEF1p和VPS8p分别与片段ATF1-PGK1t进行融合，构建片段TEF1p-ATF1-PGK1t和 VPS8p-ATF1-PGK1t。
利用限制性内切酶BamH I和Sma I对片段TEF1p-ATF1-PGK1t和 VPS8p-ATF1-PGK1t进行酶切处理，与经相同酶切处理的质粒pUC-BB进行连接，分别构建重组质粒pUC-BBTP和pUC-BBVP。最后这两个质粒经内切酶Kpn I线性化后分别与片段KanMX相连接，PCR验证后即获得了重组质粒pUCBBTPK与pUC-BBVPK。
利用限制性内切酶Sma I对片段ATF1-PGK1t和质粒pUC-BB进行酶切并连接，获得质粒pUC-BBAP。用Pst I对片段ATF1p进行单酶切后，与线性化质粒pUC-BBAP连接，构建重组质粒pUC-BBAAP。最后，经Kpn I酶切后的质粒pUC-BBAAP与经相同处理的片段KanMX连接，PCR验证后即获得了重组质粒pUC-BAAPK。
1.2.2 啤酒酵母菌株的转化
分别以质粒pUC-BBTPK、pUC-BBVPK和pUCBAAPK为模板，BQ-F/BQ-R为引物，经PCR扩增获得表达盒BA-TEF1p-ATF1-PGK1t-loxP-KanMX-loxPBB（5 219 bp）、BA-VPS8p-ATF1-PGK1t-loxP-KanMX-loxP-BB（5 251 bp）、BA-loxP-KanMX-loxP-ATF1p-ATF1-PGK1t-BB（5 502 bp）。利用醋酸锂转化法将目的片段转化至啤酒酵母中，经稀释后涂布于含有G418抗性（400μg/mL）的YEPD平板上，30℃静置培养48h[14]。培养结束后，对转化子进行PCR验证，正确的转化子经纯化后保存于YEPD固体斜面中。根据重组菌株中启动子元件的不同，将菌株分别命名为S5-T（TEF1p）、S5-V（VPS8p）、S5-A（ATF1p）。
1.2.3 啤酒发酵
首先取斜面菌种一环，接种于含有5 mL麦汁培养基的试管中，于30℃培养箱中静置培养24 h。随后将5 mL培养液倾倒至含有45 mL麦汁培养基的锥形瓶（150 mL规格）中，16℃静置培养36 h。最后按10%接种量（体积比）将二级种子液接入含有135 mL麦汁的250 mL三角瓶内，10℃静置发酵7 d。发酵期间每12 h称重一次，当CO2失重量小于0.1 g时视为发酵终止。发酵结束后对发酵液进行蒸馏，检测馏出酒样的酒精度及风味物质含量。
1.2.4 基本发酵性能分析
采用称重法测定CO2释放量；采用斐林试剂法[15]测定发酵液中剩余还原糖含量；采用密度瓶法测定酒样中的酒精度；采用次甲基蓝染色法检测酵母死亡率。
1.2.5 风味物质含量检测
主要风味物质含量通过气相色谱进行检测[16]。气相色谱仪的色谱柱采用Agilent HP-INNOWAX（30 m×320 μm×0.25 μm），载气为高纯氮气，柱流速为0.8 mL/min，进样口温度200℃，检测器温度150℃。升温程序：起始温度50℃，保持8 min，以5℃/min升至150℃，保持15 min；分流进样，分流比为10∶1。
1.2.6 生长曲线的检测
利用全自动生长曲线分析仪检测出发菌株与重组菌株的生长曲线，具体操作参考葛峻伶等[17]的方法。
1.2.7 数据分析
每组试验均设置3组平行，数据以平均值±标准误差的形式表示。使用Student’s t-test检验分析重组菌株和出发菌株之间的差异，P＜0.05被认为具有统计学意义。
2 结果与讨论
2.1 重组菌株的获得
重组表达盒中包含BAT2基因的上游同源臂BA与下游同源臂BB，通过酵母同源重组机制，重组表达盒能够整合至BAT2基因位点处，实现对BAT2基因的敲除和ATF1基因的过表达。根据敲除BAT2后的酵母基因组序列，设计上下游引物，以阳性转化子与出发菌株S5的基因组为模板进行PCR验证，验证结果如图1所示。
图1 重组菌株S5-T、S5-V、S5-A的PCR验证
Fig.1 The PCR verification of recombinant strains S5-T，S5-V，S5-A
M 代表DL5 000 DNA Marker。a.引物 B-U/T-D；1.S5；2.S5-T。b.引物 P-U/B-D；1.S5；2.S5-T。c.引物 B-U/V-D；1.S5；2.S5-V。d.引物 P-U/B-D；1.S5；2.S5-V。e.引物 B-U/PT-D；1.S5；2.S5-A。f.引物 KP-F/B-D；1.S5；2.S5-A。
由图1可知，以重组菌株S5-T、S5-V、S5-A基因组为模板时，能够扩增出单一明亮的条带，且长度与预期一致；以出发菌株S5基因组为模板则无法扩增出条带。验证结果证明了重组盒已经成功替代了BAT2基因，实现了BAT2基因的敲除与ATF1基因的过表达。
2.2 重组菌株生长性能的比较
为了确定不同启动子过表达ATF1基因对菌株的生长性能是否存在影响，检测了出发菌株S5及重组菌株S5-T、S5-V、S5-A的生长曲线，结果如图2所示。
图2 出发菌株S5与重组菌株S5-T、S5-V、S5-A的生长曲线
Fig.2 Growth curve of parental strain S5 and recombinant strain S5-T、S5-V、S5-A
由图2可知，在0～1 h时，酵母处于停滞期，生长速度较缓慢；2 h～10 h处于对数生长期，酵母大量增殖，菌体浓度明显增加；10 h后，酵母处于稳定期，酵母数量基本保持不变。3株重组菌株与出发菌株S5的生长曲线无明显差异，这证明不同启动子对ATF1基因的过表达和BAT2基因的敲除对菌株的生长性能没有造成负面影响。
2.3 重组菌株基本发酵性能的比较
出发菌株S5与重组菌株S5-T、S5-V、S5-A发酵性能分析见表3，啤酒酵母菌株的CO2释放量曲线见图3。
表3 出发菌株S5与重组菌株S5-T、S5-V、S5-A发酵性能分析
Table 3 The fermentation performances of strains S5，S5-T，S5-V，S5-A
菌株 残糖/（g/1 0 0 m L） 死亡率/% 外观发酵度/% 真正发酵度/%S 5 1.4 0±0.0 8 1.2 3±0.0 8 7 1.3 2±1.3 1 6 1.5 3±1.2 8 S 5-T 1.3 7±0.1 2 1.1 2±0.0 9 7 0.3 7±1.7 2 6 1.6 1±1.3 5 S 5-V 1.3 5±0.1 5 1.7 7±0.1 3 7 0.6 3±1.5 8 6 3.3 4±1.2 1 S 5-A 1.3 0±0.1 1 1.4 9±0.0 6 7 0.2 0±1.6 5 6 1.1 8±1.9 0
图3 啤酒酵母菌株的CO2释放量曲线
Fig.3 The CO2weight loss curve of brewer's yeast strain
在啤酒发酵过程中，剩余还原糖含量、细胞死亡率与发酵度是衡量酵母菌株基本发酵性能的几种常规指标。由表3可知，出发菌株S5发酵液的剩余还原糖含量为1.40 g/100 mL，死亡率为1.23%，外观发酵度与真正发酵度分别为71.32%和61.53%。与出发菌株相比，重组菌株S5-T、S5-V、S5-A的基本发酵性能均未见明显差异。此外，通过发酵期间CO2的释放量来检测啤酒酵母菌株的发酵速率。由图3可知，出发菌株S5与重组菌株S5-T、S5-V、S5-A的CO2释放量趋势基本一致，发酵周期为7 d，总失重均为4.9 g。这些结果表明，利用启动子TEF1p、VPS8p、ATF1p过表达ATF1基因不会影响啤酒酵母菌株的基本发酵性能。
2.4 产酒精能力的测定
啤酒酵母菌株生成酒精的能力对啤酒的发酵有着重要的影响，采用密度瓶法检测酒样中的酒精度，结果见表4。
表4 出发菌株与重组菌株的乙醇含量
Table 4 The ethanol contents produced by parental strain and recombinant strains
菌株 酒精度/%vol S5 3.80±0.07 S5-T 3.75±0.05 S5-V 3.79±0.03 S5-A 3.76±0.02
由表4可知，菌株S5-T、S5-V和S5-A的酒精度分别为 3.75%vol、3.79%vol和 3.76%vol，与出发菌株S5的酒精度（3.8%vol）相比无明显差别。在啤酒酵母的酯类物质代谢中，虽然部分乙醇在醇乙酰基转移酶的催化下会被转化为乙酸乙酯，但研究结果证明过表达ATF1基因不会对菌株的产酒精能力造成负面影响。在Zhang等[18]的研究中，利用磷酸甘油酸激酶基因启动子PGK1p过表达ATF1基因的菌株，其乙醇生成能力同样未受到影响，这支持了本文的研究结果。
2.5 风味物质含量的测定
酵母菌株S5、S5-T、S5-V、S5-A经过麦芽汁啤酒发酵后，利用气相色谱检测了主要风味物质含量，结果见图4。
图4 菌株S5、S5-T、S5-V和S5-A的风味物质生成量
Fig.4 The concentration of flavor substance produced by strain S5，S5-T，S5-V and S5-A
与出发菌株相比，*表示差异显著（P＜0.05），**表示差异极显著（P＜0.01）。
由图4可知，菌株S5-T、S5-V、S5-A的乙酸乙酯生成量较出发菌株S5分别提高了2.56倍、1.21倍和1.24倍。高级醇类物质中，异丁醇与异戊醇的含量出现了较为明显的变化。与出发菌株S5相比，菌株S5-T、S5-V、S5-A的异丁醇生成量分别降低了12.17%、17.93%、16.85%；异戊醇生成量分别降低了10.2%、5.79%、8.21%；正丙醇含量没有明显变化。
结果表明，利用启动子TEF1p、VPS8p、ATF1p对ATF1基因进行过表达能够小幅度调控乙酸乙酯的生成量。在前期的研究中，发现过表达ATF1基因会提高醇乙酰基转移酶的酶活力，这是乙酸乙酯含量提高的主要原因[19-21]。Fischer等[22]利用启动子UBI4p过表达ATF1基因，冷激条件下乙酸乙酯含量较亲本菌株增加1.3倍，这与本文的研究结果相似。另外，BAT2基因的缺失导致了支链氨基酸转氨酶的酶活力降低，阻碍了缬氨酸、亮氨酸转化为α-酮异戊酸和α-酮异己酸，这两种α-酮酸合成受阻使异丁醇和异戊醇的生成量降低[23-24]。
2.6 重组菌株醇酯比的比较
乙酸乙酯是啤酒中含量最高的酯类物质，因此用乙酸乙酯含量来代表总酯含量[3]。菌株S5、S5-T、S5-V和S5-A的醇酯比见图5。
图5 菌株S5、S5-T、S5-V和S5-A的醇酯比
Fig.5 Ratio of higher alcohols to esters in strains S5，S5-T，S5-V and S5-A
由图5可知，出发菌株S5的醇酯比为8.1∶1，远高于拉格啤酒的最适醇酯比[7]。由于菌株S5-T、S5-V、S5-A的总高级醇生成量下降，总酯生成量提高，因此醇酯比发生了变化。当VPS8p和ATF1p调控ATF1基因时，菌株S5-V和S5-A的醇酯比略有下降，分别为6.2∶1和5.9∶1。菌株S5-T的醇酯比为2.9∶1，最接近最适醇酯比。结果证明利用TEF1p、VPS8p和ATF1p对ATF1基因进行过表达能够有效地调控总高级醇和总酯的含量，优化醇酯比，从而达到提高啤酒品质的目的。
3 结论
以啤酒酵母S5为出发菌株，利用启动子TEF1p、VPS8p和ATF1p分别过表达ATF1基因，选育出重组菌株S5-T、S5-V和S5-A。通过啤酒发酵试验，探究了不同启动子元件对啤酒醇酯比的调控效果和影响。结果显示，菌株S5-V和S5-A的醇酯比偏高，分别为6.2∶1和5.9∶1，这可能是由于VSP8p和ATF1p的启动子强度较低，导致乙酸乙酯含量提升幅度较低；菌株S5-T的醇酯比为2.9∶1，接近啤酒的醇酯比要求，具有一定的工业应用潜力。后续研究可以采用启动子工程，对启动子元件进行改造，进一步选育符合啤酒醇酯比要求的啤酒酵母菌株。本研究证实了利用不同启动子元件调控啤酒醇酯比的可行性，为选育具有优良工业啤酒酵母菌种提供了新的改造策略和参考。
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