地参为唇形科地笋属植物硬毛地笋（Lycopus lucidus var.hirtus Regel.）的干燥根茎，其性平、味甘，有化瘀止血、益气利水的功效，对产后腹痛、黄疸、水肿、带下和气虚乏力有较好的疗效[1]。在我国云南、江苏、山东、四川、陕西和重庆等地均有栽培[2]。现代研究表明地参主要含有酚酸类、多糖类、挥发油、三萜类、黄酮类[3-5]等活性成分，具有抗氧化、抗炎、增强免疫、降血糖血脂、抗肿瘤等多种生物活性[6-7]，同时地参还含有丰富的氨基酸、蛋白质、矿物质等营养素[8-9]，营养价值高，有“蔬菜珍品”、“山中之王”的美誉[7]。
核苷是核酸的主要成分，是构成生命活动的基本单元，不仅参与机体DNA代谢，且存在广泛的药理活性[10-11]。研究表明，核苷类物质对人体免疫系统、肝脏、心血管和神经系统具有很好的调节能力[12]，已被作为功能强化剂添加到食品中[13]。关于地参水溶性提取物的研究多在地参多糖的提取、纯化和生理活性上，而地参中水溶性核苷类成分的研究鲜见报道，因此，对其进行测定分析有助于挖掘潜在的保健功能。
高效液相色谱法[10-11，14-15]为核苷类物质的常用分析法，但此法在复杂基质中存在定性能力差、分析时间长的问题，不利于稳定性差的核苷类物质[14]含量的准确测定。而采用液相色谱-质谱联用法（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）测定核苷类成分，不仅定性定量准确、灵敏度高，而且分析时间短[16-17]。因此，本试验建立超高效液相色谱-串联质谱法（ultra performance liquid chromatograph tandem mass spectrometer，UPLC-MS-MS）测定地参中核苷类成分，并对10个不同产地地参进行定性定量分析、聚类分析和相关性分析，不仅可为地参质量标准提供参考，还可为今后进一步探索地参的生物活性指明方向。
1 材料与方法
1.1 主要仪器与设备
TSQ Quantum Access Max型液相质谱联用仪：美国赛默飞世尔科技有限公司；SB-5200DTN型超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；ML204型万分之一分析天平、MS105型十万分之一分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HDL-4型离心机：江苏省金坛市鸿科科技有限公司。
1.2 材料与试剂
尿嘧啶、腺嘌呤、腺苷、胞苷：南京都莱生物技术有限公司；鸟苷、尿苷：成都普思生物科技股份有限公司；甲醇（质谱纯）：美国Fisher公司；其余试剂均为分析纯。
地参自采或委托采集于云南、江苏、重庆、山东和广西等我国地参主要栽培基地，共10批次，编号为重庆万州（S1）、云南大理（S2）、云南腾冲（S3）、云南昆明（S4）、广西玉林（S5）、山东菏泽（S6）、江苏徐州（S7）、江苏盐城（S8）、江苏沛县（S9）、江苏宿迁（S10），经重庆三峡学院生物与食品工程学院周浓教授鉴定为唇形科地笋属植物硬毛地笋（Lycopus lucidus var.hirtus Regel.）的根茎。将地参洗净泥沙，晾干水分，置于恒温干燥箱45℃烘干至恒重，粉碎过35目筛，备用。
1.3 试验方法
1.3.1 单因素试验
精密称取地参粉末（S1）0.5 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，按照1∶20（g/mL）的料液比分别加入纯水、2%氯化钠溶液、10%甲醇溶液、20%甲醇溶液和0.1 mol/L氢氧化钠溶液，超声辅助提取30 min，合并2次提取液，以提取到的核苷种类多少为评价指标，确定提取溶剂。
以上述确定的溶剂提取，采用本文建立的方法测定核苷总量。基础提取试验条件：地参粉末与提取溶剂料液比 1∶20（g/mL）、超声时间 30 min，提取2 次。考察单因素变量为超声时间（10、20、30、40、50、60 min）、料液比[1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）]、提取次数（1、2、3次）。
1.3.2 色谱柱的选择
以甲酸水溶液（pH4.0）-甲醇作为流动相，在柱温40℃、流速0.2 mL/min条件下分别考察3种色谱柱Waters BEH C18、亲水作用色谱柱（hydrophilic interaction chromatography，HILIC）和 Agilent SB-C18的分离效果。
1.3.3 对照品储备液的配制
精密称取减压干燥至恒重的胞苷0.005 54 g、尿嘧啶 0.005 56 g、腺嘌呤 0.004 37 g、尿苷 0.004 89 g、鸟苷0.004 46 g、腺苷0.005 69 g，分别置于6个10 mL棕色容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸溶液溶解并定容，即得质量浓度分别为 554.0、556.0、437.0、489.0、446.0、569.0 μg/mL的对照品储备液。
1.3.4 样品溶液的制备
精密称取地参粉末0.5 g置于100 mL具塞锥形瓶中，加纯水10 mL，混匀，室温（25℃）下超声辅助提取30 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液于20 mL棕色容量瓶中，按上述条件复提1次，合并上清液并定容至刻度，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得样品溶液。
1.3.5 色谱条件
色谱柱：Agilent SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相：A相为甲酸水溶液（pH4.0），B相为甲醇，梯度洗脱（0～1.5 min，97%A；1.5 min～6.0 min，97%～60%A；6.0 min～11.0 min，60%A；11.0 min～11.1 min，60%～97%A；11.1 min～15.0 min，97%A）；柱温 40 ℃；流速0.2 mL/min；进样量 2 μL。
1.3.6 质谱条件
离子源：电喷雾离子源（electrospray ion source，ESI）；电离模式：正离子模式；电离电压：3 500 V；毛细管温度：270℃；鞘气流量：35 Arb；辅助气温度：280℃；辅助气流量：10 Arb；检测模式：多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）。6种核苷类成分具体的质谱参数见表1。
表1 6种核苷类成分的质谱参数
Table 1 Mass spectrometry parameters of 6 nucleosides
核苷成分 定量离子对/（CE/eV）镜筒透镜电压/V胞苷 244.0→114.6（13） 244.0→98.2（37） 66尿嘧啶 113.2→99.3（16） 113.2→74.3（16） 77定性离子对/（CE/eV）
续表1 6种核苷类成分的质谱参数
Continue table 1 Mass spectrometry parameters of 6 nucleosides
核苷成分 定量离子对/（CE/eV）镜筒透镜电压/V腺嘌呤 136.1→121.3（22） 136.1→95.3（29） 81尿苷 245.4→115.7（14） 245.4→74.3（32） 71鸟苷 284.5→153.3（13） 284.5→136.9（37） 75腺苷 268.0→137.7（18） 268.0→121.3（44） 82定性离子对/（CE/eV）
1.3.7 方法学考察
1.3.7.1 线性范围和检出限
分别取1.3.3所得的胞苷、尿嘧啶、腺苷对照品储备液各0.20 mL，腺嘌呤、尿苷、鸟苷对照品储备液各0.60 mL于同一10 mL棕色容量瓶中，加纯水定容至刻度，摇匀得混合对照品溶液。分别吸取混合对照品溶液0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 于 7 个 10mL棕色容量瓶中，加纯水定容至刻度，摇匀，得系列混合对照品溶液。以1.3.5和1.3.6方法中的条件进样分析，记录色谱峰峰面积，以各成分的峰面积（Y）与其相应的质量浓度（X）绘制回归方程，并以3倍信噪比对应的质量浓度作为检出限。
1.3.7.2 精密度试验
取1.3.7.1中的同一混合对照品溶液，按1.3.5和1.3.6中的条件测定6次，计算6种核苷峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值，验证仪器精密度。
1.3.7.3 重复性试验
平行称取6份样品（S1），每份0.500 0 g，以1.3.4中的方法制备样品溶液，并按1.3.5和1.3.6中的条件测定，将6种核苷成分峰面积分别代入回归方程计算含量，求得6份样品不同核苷含量的RSD值，验证方法的重复性。
1.3.7.4 稳定性试验
取样品（S1），按照1.3.4的条件制备样品溶液，室温（25℃）下分别在 0、2、4、6、8、10 h内进样测定，记录各核苷的色谱峰面积并计算RSD值，验证样品的稳定性。
1.3.7.5 加标回收率试验
精密称取已测得含量的地参粉末0.250 0 g（S1），平行6份，分别依次精密加入1.3.3所得的各核苷对照品储备液适量，按1.3.4的方法制备样品溶液，按1.3.5和1.3.6中的方法进样，计算各成分的加标回收率和RSD值，验证方法的准确性。
1.3.8 样品的含量测定
取10批地参粉末按照1.3.4的方法进行样品溶液的制备，每批平行3份，注入UPLC-MS-MS测定6种核苷类成分的含量。
1.3.9 数据处理
采用Microsoft Excel 2019软件对测定数据进行处理，计算核苷含量以平均值±标准偏差表示。采用SPSS 20软件对数据进行差异性分析、相关性分析和聚类分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 提取溶剂的确定
通过测得核苷成分的种类发现：0.1 mol/L氢氧化钠溶液除提取到少量的腺嘌呤外，其他核苷成分不明显，且基线噪声较大；10%甲醇溶液和20%甲醇溶液仅能提取到胞苷、鸟苷、尿苷和腺苷4种核苷；纯水和2%氯化钠溶液均能有效提取6种核苷成分，但考虑到无机盐可能对液质联用仪造成污染，最终选择纯水作为提取溶剂。
2.1.2 超声时间对地参核苷总量的影响
不同超声时间对核苷总量的影响见图1。
图1 超声时间对地参核苷总量的影响
Fig.1 Effect of ultrasonic time on the total content of nucleosides
由图1可知，随着超声时间的延长，地参中核苷总量呈先大幅度增加后趋于稳定的趋势，当超声时间超过30 min后，核苷总量变化不明显。因此，本试验选择超声时间为30 min。
2.1.3 料液比对地参核苷总量的影响
不同料液比对核苷总量的影响见图2。
图2 料液比对地参核苷总量的影响
Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on the total content of nucleosides
由图2可知，溶剂体积过小，物质和溶剂不能充分接触，核苷总量较低。随着溶液体积的增大，核苷总量明显上升，但当料液比达到1∶20（g/mL）后，上升趋势不明显。因此，本试验选择料液比为1∶20（g/mL）。
2.1.4 提取次数对地参核苷总量的影响
不同的提取次数对核苷总量的影响见图3。
图3 提取次数对地参核苷总量的影响
Fig.3 Effect of extraction times on the total content of nucleosides
由图3可知，核苷总量随着提取次数的增加而上升，但提取3次的含量相较2次增幅不大，考虑到时间成本，因此最终确定提取2次。
根据单因素试验结果，最终确定以纯水作为提取溶剂，地参粉末与纯水的料液比1∶20（g/mL），超声提取30 min，重复提取2次的效果最好。
2.2 色谱柱的选择
由于核苷类化合物含有碱基，极性较强，对色谱柱的适应性有一定要求。本试验比较了3种不同的色谱柱 Waters BEH C18、HILIC 和 Agilent SB-C18，结果见图4。
图4 混合对照品溶液在不同色谱柱上的MRM离子流图
Fig.4 MRM ion chromatograms of mixed reference solution on different columns
1.胞苷；2.尿嘧啶；3.腺嘌呤；4.尿苷；5.鸟苷；6.腺苷。
由图4可知，目标物在高惰性色谱柱Waters BEH C18上的保留效果较差，出峰快导致保留时间过于集中且重现性差；HILIC亲水型色谱柱上虽然目标物保留效果较好，但部分核苷类化合物的峰形较差；而未封端的Agilent SB-C18色谱柱不仅可以在反相条件下消除因高水相引起的色谱柱疏水塌陷带来的保留时间漂移等问题，且峰形较好，同时也保证了低pH值流动相条件下色谱柱的稳定性和使用寿命。故本试验最终选择色谱柱Agilent SB-C18。
2.3 方法学考察
2.3.1 线性范围、检出限的确定
地参中6种核苷成分的回归方程、线性范围及检出限见表2。
表2 6种核苷成分的回归方程、线性范围、相关系数
Table 2 Regression equations，linear ranges，and correlation coefficients of 6 nucleosides
核苷成分保留时间/m i n回归方程线性范围/（n g/m L）相关系数检出限/（n g/m L）胞苷 1.4 7 Y=2 2 9 4 X+1 1 5 7 0 0 5 5.4 0～1 1 0 8.0 0 0.9 9 6 4 0.0 7尿嘧啶 1.7 5 Y=1 3 1 1 X-7 2 7 3 0 5 5.6 0～1 1 1 2.0 0 0.9 9 9 0 8.3 4腺嘌呤 1.7 8 Y=2 5 3 6 0 X+9 3 0 1 0 0 1 3 1.1 0～2 6 2 2.0 0 0.9 9 5 2 1.3 8尿苷 2.6 2 Y=3 8 0 7 X-7 1 1 4 0 1 4 7.0 0～2 9 4 0.0 0 0.9 9 8 9 1.3 8鸟苷 4.8 4 Y=3 5 0 8 0 X+5 4 2 5 0 0 1 3 3.8 0～2 6 7 6.0 0 0.9 9 7 8 0.4 8腺苷 5.2 3 Y=2 2 7 8 X+1 7 3 8 0 0 5 6.9 0～1 1 3 8.0 0 0.9 9 9 9 0.5 2
由表2可知，6种核苷成分在各自的质量浓度范围内相关系数为0.995 2～0.999 9，检出限为0.07 ng/mL～8.34 ng/mL，表明该方法线性关系良好且灵敏度高。
2.3.2 精密度的确定
胞苷、尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷峰面积的RSD值分别是 2.41%、1.85%、2.05%、3.00%、2.74%和2.42%，表明仪器精密度良好。
2.3.3 重复性的确定
地参样品（S1）中胞苷、尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷含量的RSD值分别为2.71%、1.58%、2.41%、2.73%、1.24%和2.18%，表明本方法重复性良好。
2.3.4 稳定性的确定
地参样品（S1）中胞苷、尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷峰面积的RSD值分别为1.78%、1.35%、2.05%、0.97%、1.54%和2.84%，表明样品溶液在室温（25℃）下10 h内稳定性良好。
2.3.5 加标回收率的确定
地参中胞苷、尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷的平均回收率分别为103.71%、96.30%、101.54%、98.67%、97.52%和 102.38%，RSD值分别为 1.96%、2.32%、1.10%、0.68%、1.52%和2.09%，表明本方法加标回收良好，准确度高。
2.4 样品含量分析
10个产地地参中核苷成分含量结果见表3。
表3 不同产地地参中6种核苷成分含量（n=3）
Table 3 Content of 6 nucleosides in dried rhizome of Lycopus lucidus var.hirtus Regel.from different habitats（n=3）μg/g
注：-表示低于检出限；同列不同字母表示差异显著，p＜0.05。
样品号 产地 胞苷 尿嘧啶 腺嘌呤 尿苷 鸟苷 腺苷 总量S1 重庆万州 49.84±1.35b 3.95±0.07e 31.95±0.77e 113.20±3.09c 97.37±1.21d 8.40±0.18b 304.71 S2 云南大理 18.41±0.89g 3.43±0.05f 4.30±0.12h 52.63±0.77h 88.59±0.60e 2.50±0.07e 169.86 S3 云南腾冲 21.86±0.12ef 3.17±0.04f 3.34±0.02hi 50.91±0.18h 91.28±0.69e 1.65±0.02f 172.21 S4 云南昆明 23.65±0.60e 3.28±0.05f 7.95±0.44f 68.00±1.02g 116.74±1.13c 1.82±0.05ef 221.45 S5 广西玉林 20.24±0.35fg - 2.68±0.15i 47.69±1.37i 80.61±0.26f 3.64±0.05d 154.86 S6 山东菏泽 34.69±0.67d 6.16±0.08d 6.17±0.53g 77.63±1.62f 139.42±2.36b 5.37±0.08c 269.44 S7 江苏徐州 89.80±3.51a 22.55±0.13b 87.53±1.68a 228.85±2.10a 187.68±1.95a 14.38±0.13a 630.79 S8 江苏盐城 42.22±1.55c - 46.73±0.01c 150.68±0.65b 38.50±1.80h 4.34±0.04d 282.47 S9 江苏沛县 10.77±0.31i 16.40±0.41c 33.33±2.07d 85.57±1.84e 49.72±1.38g 1.33±0.04f 196.95 S10 江苏宿迁 13.89±0.79h 79.71±0.18a 76.59±1.17b 91.81±2.22d 50.11±1.30g 1.72±0.21f 313.83
由表3可知，不同产地地参中均不同程度检出了胞苷、尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷，与川党参[15]、银线莲[17]中核苷类成分种类相似，但含量存在显著差异（p＜0.05），核苷总量为 154.86 μg/g～630.79 μg/g，从高到低排序为江苏徐州（S7）＞江苏宿迁（S10）＞重庆万州（S1）＞江苏盐城（S8）＞山东菏泽（S6）＞云南昆明（S4）＞江苏沛县（S9）＞云南腾冲（S3）＞云南大理（S2）＞广西玉林（S5），含量最高的江苏徐州（S7）约为广西玉林（S5）的4倍。从南北产区上看，南方产区（S2～S5）含量较低且接近，而北方产区（S6、S8～S10）与西南方产区（S1）含量略高且接近，表明地参中核苷类物质的积累存在一定的地域性。
地参中6种核苷成分之间含量差异也较大，胞苷、尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷的含量分别为10.77 μg/g～89.80 μg/g、3.17 μg/g～79.71 μg/g、2.68 μg/g～87.53 μg/g、47.69 μg/g～228.85 μg/g、38.50 μg/g～187.68 μg/g和 1.33 μg/g～14.38 μg/g，平均含量由高到低排序为尿苷＞鸟苷＞胞苷＞腺嘌呤＞尿嘧啶＞腺苷，含量最高的尿苷和鸟苷分别为96.70 μg/g和94.00 μg/g，占核苷总量的35.60%和34.60%，为地参主要的核苷类成分。这一研究结果与浙贝母[18]、泽泻[19]中主要核苷类成分一致。据报道，鸟苷对细胞损伤有抗凋亡作用，对脑缺血具有神经保护作用[20]；尿苷作为一种具有嘧啶环结构的天然核苷，在抗癫痫方面有明显作用[21]；其次含量较高的胞苷是合成抗病毒、抗肿瘤药物的良好中间体，也是核苷酸类功能性食品的重要原料[22]。因此，地参中核苷类成分的含量分析为其在生物活性关联性研究上奠定了基础。
2.5 相关性分析
不同产地地参中6种核苷类成分的相关性分析结果见表4。
表4 地参中核苷成分的相关性分析
Table 4 Correlation of nucleosides in dried rhizome of Lycopus lucidus var.hirtus Regel.
注：*表示显著相关（p＜0.05）；**表示极显著相关（p＜0.01）。
核苷成分 胞苷 尿嘧啶 腺嘌呤 尿苷 鸟苷 腺苷胞苷 1.000尿嘧啶 -0.113 1.000腺嘌呤 0.547 0.679* 1.000尿苷 0.888** 0.160 0.818** 1.000鸟苷 0.707* -0.179 0.098 0.420 1.000腺苷 0.970** -0.063 0.535 0.835** 0.727* 1.000
由表4可知，不同产地地参中6种核苷类成分存在一定的相关性，整体表现为正相关。如尿苷与胞苷（r=0.888，p＜0.01）、尿苷和腺嘌呤（r=0.818，p＜0.01）、腺苷和胞苷（r=0.970，p＜0.01）、腺苷和尿苷（r=0.835，p＜0.01）之间均为极显著正相关，腺嘌呤和尿嘧啶（r=0.679，p＜0.05）、鸟苷和胞苷（r=0.707，p＜0.05）、腺苷和鸟苷（r=0.727，p＜0.05）之间表现为显著正相关。由此说明，地参中6种核苷类成分在合成或转化过程中相互促进，彼此协同。
2.6 聚类分析
利用SPSS 20软件对10个不同产地地参中核苷类成分进行聚类分析，结果见图5。
图5 样品的聚类分析
Fig.5 Cluster analysis of samples
由图5可知，在欧式距离为10时，10个不同产地可以聚为3类，产地江苏徐州（S7）为第I类；江苏宿迁（S10）为第II类；剩余8个产地为第III类。表明不同产地核苷类成分含量差异性较大，其中江苏徐州产地参核苷类成分含量最高，其次是江苏宿迁产地，而其他产地成分差异不明显。
3 结论
准确定性定量分析是开展地参品质评价的技术基础，本研究采用纯水超声辅助提取地参中核苷成分，利用Agilent SB-C18色谱柱梯度洗脱，正离子多反应监测（MRM）模式检测，建立了同时测定地参中胞苷、尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷的UPLC-MSMS法。该方法相关系数均大于0.995 2，线性关系良好；检出限为 0.07 ng/mL～8.34 ng/mL，灵敏度高；加标回收率为96.30%～103.71%，准确度高，可用于地参中核苷类成分的定性定量分析，为地参质控标准的完善以及生物活性探索提供参考；同时比较了不同产地地参中核苷类成分差异性，为优势地参种源提供参考。
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