血管紧张素转化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）在血压调节方面具有极其重要的作用[1]。血管紧张素I（angiotensin I，Ang I）不能使血压升高，但它能被ACE酶转变为有强升压活性的血管紧张素II（angiotensin II，Ang II），同时能阻止降压物质缓激肽的释放，最终促使血压升高[2]。
目前，制备ACE抑制肽的方法有酶水解法、化学合成法、基因重组法等。因为操作简便、反应条件易控[3-5]，酶解法得到普遍使用。不同的酶存在不同的切割位点[6]，因而会产生不同功能活性的肽，所以筛选最适合产生高活性的ACE抑制肽的酶非常重要。然而传统的酶解方法效率低、水解产物ACE抑制率低。制备ACE抑制肽仅用单一方法的效果是非常有限的，已有不少研究发现通过复合方法[7-8]，可明显提高提取率并降低成本。
检测ACE抑制肽活性的体内法主要是动物实验，体外法采用紫外分光光度法、荧光测定法[9]、液相色谱串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[10]、酶偶联法[11]等。最常用的是 Cushman等[12]建立的紫外分光光度法，该方法以马尿酰组氨酰亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL）为底物，按照一定的顺序先后加入ACE酶和ACE抑制肽发生反应，然后用乙酸乙酯萃取生成的马尿酸（hippuric acid，Hip），在228 nm波长下测定Hip的吸光度。
脱脂豆粕中的蛋白质含量高[13]，作为大豆油加工的副产品[14]，是生产食源性ACE抑制肽的优质原料。传统制备ACE抑制肽的方法是蛋白酶水解法，加入超声波预处理辅助酶解，利用超声波的空化效应及机械剪切对原料的破碎作用[15-16]，可缩短酶解时间、提高效率。超声波辅助酶解法制备豆粕ACE抑制肽的研究鲜见报道。本文以脱脂豆粕为原料，通过响应面法对超声波辅助酶解法水解条件进行优化，旨在为ACE抑制肽的深入研究提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
脱脂豆粕、新鲜猪肺：市售。
碱性蛋白酶（10万 U/g）、中性蛋白酶（10万 U/g）和酸性蛋白酶（10万U/g）：河南仰韶生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（10万U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；胰蛋白酶（10万U/g）：河南万邦实业有限公司；马尿酰组氨酰亮氨酸（色谱纯）：上海麦克林生化科技有限公司；牛血清白蛋白（分析纯）：合肥博美生物科技公司；考马斯亮蓝G250、甘氨酸（分析纯）：天津大茂化学试剂厂；磷酸、硼酸、四硼酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、乙醇95%、乙酸乙酯（分析纯）：天津市红岩化学试剂厂；盐酸（分析纯）：烟台远东精细化工有限公司。
1.2 仪器与设备
DS-1高速组织捣碎机：上海标本模型厂；HH-6数显恒温水浴锅：常州荣华仪器制造有限公司；UV-5500紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；Alpha 1-4 LDplus真空冷冻干燥器：德国Christ公司；BGZ-Ⅱ电热鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司；KS800KDV液晶超声波清洗器：昆山洁力美超声仪器有限公司；ST3100 pH计：奥豪斯仪器（常州）有限公司；TGL-16M台式高速冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。
1.3 方法
1.3.1 ACE粗酶的制备
新鲜猪肺4℃冷藏10 h，将血管、脂肪、黏膜清除，于高速组织捣碎机间歇研磨5 min，使浆液充分混匀。每5 g匀浆中加入6 mL硼酸缓冲液，置4℃冰箱内浸提18 h～24 h，然后8 000 r/min离心15 min，倒出已分层的上清液，冷冻干燥密闭保藏备用[17]。
1.3.2 水解度的测定
1.3.2.1 牛血清白蛋白标准曲线的绘制
量取蛋白质标准溶液 0、0.03、0.06、0.12、0.24、0.48、0.72、0.84、0.96mL于10mL比色管中（以上各管蛋白质含量分别为 0、0.003、0.006、0.012、0.024、0.048、0.072、0.084、0.096 mg），分别加入蒸馏水 1.00、0.97、0.94、0.88、0.76、0.52、0.28、0.16、0.04 mL，再补加 5 mL 考马斯亮蓝G250溶液，充分混匀，将比色管稳定2 min后测定吸光度。用蒸馏水调零，设定紫外可见分光光度计波长595 nm，测定吸光度[18]。以横坐标为牛血清白蛋白浓度（mg/mL），纵坐标为吸光度，制作标准曲线。
1.3.2.2 水解度的计算
准确吸取样液1.0 mL，稀释一定的倍数，加入5 mL考马斯亮蓝G250溶液，同1.3.2.1操作测定吸光度，然后根据1.3.2.1中的回归方程，计算水解度（degree of hydrolysis，DH）。
1.3.3 ACE抑制率的测定
取 50 μL 5 mmol/L HHL 与 50 μL ACE 抑制肽混匀，37℃水浴预热5 min，然后再加入40 μL12.5 mg/mL ACE溶液摇匀，37℃水浴反应30 min，加入 200 μL 1 mol/LHCl使反应停止，再加入4℃1mL预冷过的乙酸乙酯分离出马尿酸，漩涡振荡混匀，4℃、4 000 r/min条件下离心15 min，吸取酯层750 μL到另一试管，120℃烘箱烘15 min，冷却后再加入3 mL蒸馏水，漩涡振荡20 s，用50 μL硼酸缓冲溶液代替ACE抑制肽作为空白。设定紫外分光光度计波长228 nm，测定吸光度，并计算ACE抑制率。
式中：A为加入ACE抑制肽时的吸光度；B为未加入ACE抑制肽时的吸光度，即对照；B0为空白反应的吸光度，即空白。
1.3.4 最适蛋白酶的选择
利用传统酶解法，选用5种蛋白酶分别酶解豆粕蛋白，以ACE抑制率和水解度为衡量指标，来确定最适蛋白酶。5种蛋白酶的最佳水解条件见表1。
表1 5种蛋白酶的最佳水解条件
Table 1 The optimum hydrolysis conditions of five proteases
酶的种类 最适pH值 最适温度/℃碱性蛋白酶 10.0 45中性蛋白酶 7.0 40酸性蛋白酶 3.0 40木瓜蛋白酶 6.5 55胰蛋白酶 8.0 40
1.3.5 酶法制备豆粕ACE抑制肽
将豆粕按料液比1∶10（g/mL）加入50 mL离心管中，调节pH值至蛋白酶的最适pH值，于该酶的最适温度下水浴保温5 min，添加5%蛋白酶混匀，酶解一段时间后，沸水加热15 min使酶失活，4 000 r/min离心5 min，取上清液测定ACE抑制率和水解度。
1.3.6 超声波辅助酶解法制备豆粕ACE抑制肽
准备干燥洁净的50 mL离心管，将豆粕按料液比1∶10（g/mL）加入其中，设定超声波功率100 W，在55℃超声30 min，后面试验操作同1.3.5。
1.3.7 单因素试验
准确称量5份质量为2.000 0 g的豆粕，在超声温度 40、50、60、70、80 ℃，超声时间 20、30、40、50、60 min，料液比 1 ∶4、1 ∶6、1 ∶8、1 ∶10、1 ∶12（g/mL），加酶量5%、6%、7%、8%、9%，酶解时间 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，超声波功率100 W的条件下提取ACE抑制肽，以水解度和ACE抑制率为衡量指标，考察超声温度、超声时间、料液比、加酶量、酶解时间对ACE抑制率、水解度的影响。
1.3.8 响应面试验设计
响应值为ACE抑制率（Y），基于单因素试验结果，选择对响应值有较大影响的因素（超声温度、超声时间、加酶量、酶解时间），依据Box-Behnken，做四因素三水平响应面试验。试验设计的因素水平见表2。
表2 响应面试验的因素和水平
Table 2 Factors and levels of response surface experiment
水平 A超声温度/℃时间/m i n C加酶量/% D酶解时间/h-1 6 0 3 0 6 3.0 0 7 0 4 0 7 3.5 1 8 0 5 0 8 4.0 B超声
1.4 数据处理
试验数据为3次平行试验的平均值，运用Design Expert 8.0.6软件拟合回归方程，并对数据模型进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的确立
按1.3.2.1方法制作标准曲线，结果见图1。
图1 牛血清白蛋白标准曲线
Fig.1 Standard curve of bovine serum albumin
由图1可知，回归方程为y=7.275 1x+0.029 9，R2=0.992 2，牛血清白蛋白标准溶液在0～0.096 mg/mL范围，呈良好的线性关系。
2.2 最适蛋白酶的确定
不同酶水解物的ACE抑制率和水解度见表3。
表3 不同酶水解物的ACE抑制率和水解度
Table 3 ACE inhibition rate and degree of hydrolysis of different enzymatic hydrolysates
酶种类 加酶量/% A C E抑制率/% 水解度/% 酶解时间/h碱性蛋白酶 5 5 9.3 8 9 2.9 9 4.0中性蛋白酶 5 5 4.2 4 9 2.2 6 0.5酸性蛋白酶 5 1 8.8 1 9 0.5 5 1.0木瓜蛋白酶 5 4 1.3 6 9 2.1 3 4.0胰蛋白酶 5 4 6.4 4 9 0.1 0 0.5
由表3可知，单一蛋白酶酶解结果最佳的是碱性蛋白酶，经4.0 h的水解反应，水解度为92.99%，ACE抑制率为59.38%。碱性蛋白酶是一种内切酶，大多结合疏水性氨基酸，产生大量具有ACE抑制活性的小肽[19]，所以本试验选择碱性蛋白酶水解豆粕。虽然中性蛋白酶也是内切酶，但碱性蛋白酶活性高于中性蛋白酶[20]；木瓜蛋白酶具有较广的作用范围以及中等水解能力[21]；或许是由于胰蛋白酶抑制剂存在于豆粕中，胰蛋白酶酶解液的ACE抑制率相对较小；豆粕蛋白在碱性环境下溶出率较高，而酸性蛋白酶的最适pH值较低，所以酸性蛋白酶水解产物的ACE抑制率最低。
2.3 单因素试验结果
2.3.1 超声温度对ACE抑制率和水解度的影响
超声温度对ACE抑制率和水解度的影响见图2。
图2 超声温度对ACE抑制率和水解度的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on ACE inhibition rate and degree of hydrolysis
由图2可知，超声温度为70℃时，ACE抑制率达到最大值59.66%，水解度为91.44%，温度高于70℃时，水解度和抑制率都开始减小，因此选定超声温度60、70、80℃开展后续试验。
2.3.2 超声时间对ACE抑制率和水解度的影响
超声时间对ACE抑制率和水解度的影响见图3。
图3 超声时间对ACE抑制率和水解度的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic time on ACE inhibition rate and degree of hydrolysis
由图3可知，超声时间为40 min时，ACE抑制率达最大，为58.53%，水解度为91.79%。水解度的总体变化较小。ACE抑制率先降低后升高再缓慢降低，分析是因为超声波对豆粕蛋白的空化作用，疏散了蛋白质结构，展现出隐藏在蛋白质里面的活性部位，但超声处理时间过长，会损坏展现的ACE抑制活性部位，导致活性降低或失去活性。因此选择超声时间30、40、50 min进行后续试验。
2.3.3 料液比对ACE抑制率和水解度的影响
料液比对ACE抑制率和水解度的影响见图4。
图4 料液比对ACE抑制率和水解度的影响
Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on ACE inhibition rate and degree of hydrolysis
由图4可知，料液比为1∶6（g/mL）时，ACE抑制率达最大，为53.03%，水解度为90.65%。水解度总体变化较小。溶剂体积小时，溶液浓度过大，流动性差，不利于搅拌，酶与底物接触不充分，致使酶解不完全；溶剂体积大时，溶液稀释，酶浓度降低，影响了反应的进行。因此选定料液比为1∶6（g/mL）。
2.3.4 加酶量对ACE抑制率和水解度的影响
加酶量对ACE抑制率和水解度的影响见图5。
图5 加酶量对ACE抑制率和水解度的影响
Fig.5 Influence of enzyme dosage on ACE inhibition rate and degree of hydrolysis
由图5可知，当加酶量达到7%时，ACE抑制率达最大，为55.93%，水解度为91.13%。水解度总体变化较小。ACE抑制率先升高再降低，这是因为一种酶在特定的蛋白质分子中有固定数量的活性位点，当酶的浓度较高时，溶液中的酶与底物之间的活性位点达到饱和[22]。因此选择加酶量6%、7%、8%进行后续试验。
2.3.5 酶解时间对ACE抑制率和水解度的影响
酶解时间对ACE抑制率和水解度的影响见图6。
图6 酶解时间对ACE抑制率和水解度的影响
Fig.6 Influence of enzymatic hydrolysis time on ACE inhibition rate and degree of hydrolysis
由图6可知，酶解时间为3.5 h时，水解液的ACE抑制率达最大值，为56.95%，水解度为91.98%。随着酶解时间的延长，能与酶结合并作用的特异性肽键数量下降，ACE抑制率开始变小，水解度总体变化较小。因此选择酶解时间3.0、3.5、4.0 h进行后续试验。
2.4 响应面结果及方差分析
响应面试验设计及结果见表4。
表4 响应面试验设计及结果
Table 4 Experimental design and results of response surface
序号 A超声温度Y A C E抑制率/%1 -1 -1 0 0 5 3.1 1 2 1 -1 0 0 4 9.8 8 3 -1 1 0 0 4 4.8 8 4 1 1 0 0 5 1.2 0 5 0 0 -1 -1 5 0.8 7 6 0 0 1 -1 4 5.6 0 7 0 0 -1 1 4 8.3 8 8 0 0 1 1 5 5.6 9 9 -1 0 0 -1 5 2.4 1 1 0 1 0 0 -1 4 4.8 6 1 1 -1 0 0 1 4 6.8 1 1 2 1 0 0 1 5 8.2 0 1 3 0 -1 -1 0 5 0.8 9 1 4 0 1 -1 0 5 0.8 6 1 5 0 -1 1 0 5 4.6 8 1 6 0 1 1 0 4 8.5 4 1 7 -1 0 -1 0 4 9.2 2 1 8 1 0 -1 0 4 9.3 4 1 9 -1 0 1 0 4 8.1 2 2 0 1 0 1 0 5 3.4 2 2 1 0 -1 0 -1 5 2.2 2 2 2 0 1 0 -1 4 5.8 9 2 3 0 -1 0 1 5 3.5 3 2 4 0 1 0 1 5 4.4 3 2 5 0 0 0 0 6 0.7 3 2 6 0 0 0 0 6 0.9 8 2 7 0 0 0 0 6 1.7 3 2 8 0 0 0 0 6 0.9 6 2 9 0 0 0 0 6 0.9 7 B超声时间 C加酶量 D酶解时间
利用Design-Expert 8.0.6处理试验数据，得到三元二次回归拟合方程如下。
回归模型的方差分析见表5。
表5 回归模型的方差分析
Table 5 Analysis of variance of regression model
注：*为差异显著（P＜0.05）；**为差异极显著（P＜0.01）。
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 7 4 3.3 5 1 4 5 3.1 0 1 0 7.4 0 ＜0.0 0 0 1 **A 1 2.7 1 1 1 2.7 1 2 5.7 1 0.0 0 0 2 **B 2 8.5 5 1 2 8.5 5 5 7.7 5 ＜0.0 0 0 1 **C 3.5 1 1 3.5 1 7.1 0 0.0 1 8 5 *D 5 2.8 8 1 5 2.8 8 1 0 6.9 6 ＜0.0 0 0 1 **A B 2 2.8 0 1 2 2.8 0 4 6.1 2 ＜0.0 0 0 1 **A C 6.7 1 1 6.7 1 1 3.5 7 0.0 0 2 5 **A D 8 9.6 8 1 8 9.6 8 1 8 1.4 0 ＜0.0 0 0 1 **B C 9.3 3 1 9.3 3 1 8.8 8 0.0 0 0 7 **B D 1 3.0 7 1 1 3.0 7 2 6.4 3 0.0 0 0 1 **C D 3 9.5 6 1 3 9.5 6 8 0.0 3 ＜0.0 0 0 1 **A 2 2 2 5.6 9 1 2 2 5.6 9 4 5 6.5 1 ＜0.0 0 0 1 **B 2 1 5 0.4 6 1 1 5 0.4 6 3 0 4.3 3 ＜0.0 0 0 1 **C 2 1 8 7.6 5 1 1 8 7.6 5 3 7 9.5 7 ＜0.0 0 0 1 **D 2 1 6 0.1 4 1 1 6 0.1 4 3 2 3.9 1 ＜0.0 0 0 1 **残差 6.9 2 1 4 0.4 9失拟项 6.3 4 1 0 0.6 3 4.3 6 0.0 8 4 3纯误差 0.5 8 4 0.1 5总变异 7 5 0.2 7 2 8相关系数R 2=0.9 9 0 8校正决定系数R 2 Adj=0.9 8 1 5
由表5可知，该模型差异极显著（P＜0.000 1）。该模型的相关系数R2=0.990 8，校正决定系数R2Adj=0.981 5，说明预测值与实际值拟合较好。该模型的失拟项P=0.084 3＞0.05表示失拟不显著，说明试验误差较小。方程中一次项A、B、D以及二次项和交互项均对ACE抑制率影响极显著，C影响显著。
运用Design Expert 8.0.6软件优化参数，各因素交互作用的响应面图及等高线图见图7。
图7 4个因子交互作用的响应面图以及等高线图
Fig.7 Response surface and contour plot of the interaction of the four factors
若响应曲面坡度越大，说明对水解液ACE抑制率影响越大，等高线为椭圆形，说明因子间交互作用越强。由图7可知，超声温度（A）、超声时间（B）、加酶量（C）和酶解时间（D）的等高线均为椭圆形，表明两因素之间交互作用较强。由加酶量（C）与超声温度（A）、超声时间（B）和酶解时间（D）的交互响应面图可以看出，加酶量对应的响应曲面相对比较平滑，说明该因素对水解液ACE抑制率的影响作用相比其它3个因素较小。
为求得模型极值点，用Design Expert 8.0.6软件解出回归方程，确定脱脂豆粕ACE抑制肽的最优提取工艺条件为超声温度72.53℃、超声时间39.42 min、加酶量7.20%、酶解时间3.69 h，理论上预测ACE抑制率为61.71%。
2.5 验证优化结果
为使操作可行，将影响ACE抑制率的4个主要因素的最佳水平调整为超声温度73℃、超声时间39 min、加酶量7.20%、酶解时间3.6 h，并进行3次平行试验得出ACE抑制率的平均值为61.02%，同预测值相差较小，说明该模型准确性和重复性高，在实际应用中具有很好的可操作性。
3 结论
ACE底物特异性较广，水解度大并不代表ACE抑制率大，因此水解度与ACE抑制率二者之间没有关联性。本文采用超声波辅助酶解法制备豆粕ACE抑制肽，超声空化作用能暴露出蛋白分子更多活性部位，使ACE抑制率得到提高。经过响应面优化试验，最终确定最佳工艺为在超声温度73℃、超声时间39 min、料液比1∶6（g/mL）的条件下加入7.20%碱性蛋白酶水解3.6 h。在此条件下所制备的豆粕ACE抑制肽的ACE抑制率为61.02%。该方法使豆油加工副产品豆粕实现高值化综合利用，但对水解产物具体成分的分离纯化和作用机制尚待深入研究。
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