薏苡仁又称薏米，为禾本科植物薏苡的干燥成熟种仁[1]，广泛种植在我国各地，辽宁、福建、湖北为主产地[2]。薏苡仁富含蛋白质、碳水化合物、脂肪、粗纤维、维生素、矿物质、氨基酸等多种营养物质[3-4]，其营养价值较高[5]。研究表明，薏苡仁具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖、降血压、抗病毒等多方面生物活性[6]。因此，薏苡仁具有很高的开发利用价值。随着人们生活质量逐渐提高，对功能性食品的关注也逐渐增加。具有增强免疫力等生理功能的乳酸饮料成为研究热点。
近年来，利用乳酸菌发酵制备饮料已在食品研究领域引起了广泛关注。乳酸菌发酵饮料是将原料严格消毒后，经乳酸菌发酵后调制而成的产品[7]。乳酸菌呈革兰氏阳性，具有无孢子、触酶阴性、耐酸及兼性厌氧等特性，其最佳pH值在4.0～4.5[8]。乳酸菌产生的乳酸能抑制有害微生物的生长繁殖、起到抑菌和抗感染作用[9]。此外，经发酵后的乳酸菌饮料对降低胆固醇、促进胃肠蠕动，提高钙、磷的利用率也有较好的作用。乳酸菌发酵还有助于结合酚类物质的释放，产生多种风味物质[10]。目前，研究报道使用的主要发酵菌种有双歧杆菌（Bifidobacterium）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）等。发酵的原料主要有糙米、荞麦、大米、胡萝卜、西蓝花、黑木耳、石斛、山楂、红豆、紫薯和玉米等原料或者采用两种或两种以上原料混合[11]。乳酸发酵是世界上具有较高经济价值的发酵方法[12]。薏苡仁乳酸菌发酵饮料是推出的一款新型功能饮料，其制作工艺复杂，与直接用原料烹饪的食物相比，发酵谷物食品通常更美味、更容易消化，富含多种营养物质，如维生素、有机酸和各种游离氨基酸等[13-14]。因此，发酵饮料的制作工艺尤为关键，工艺流程中的每个环节都极其重要，最优的菌种发酵工艺成为饮料加工的重要保证[15]。
本试验以目前主要使用的菌种（植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌）作为薏苡仁浆液的发酵菌种，并对其发酵工艺进行探讨。目前，薏苡仁中的活性成分在发酵过程中的变化研究较少，因此本试验选择总酚和β-葡聚糖作为测定对象，探究其在乳酸菌发酵薏苡仁浆液发酵前后的变化规律，为薏苡仁发酵饮料的开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
薏苡仁：市售；嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌：广东省微生物菌种保藏中心；α-淀粉酶（3 700 U/g）：湖北常奥药业有限公司；亚铁氰化钾、无水碳酸钠、乙酸锌、酒石酸钾钠、硫酸铜、磷酸氢二钠、没食子酸、氯化钠、无水磷酸二氢钠、硫酸钾、福林酚试剂（均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；葡萄糖标准品（纯度≥98%）：莫克化工技术有限公司；MRS肉汤培养基：上海迈邦生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-2F洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；BOXUN高压蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SHP-160恒温培养箱：上海三发科学仪器有限公司；JINGHUA紫外分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；FA2004B pH计：上海雷磁厂家；TD5Z高速离心机：上海重逢科学仪器有限公司；YMC-306Q烤箱：广州市番禺成功烘焙设备制造有限公司；HH-8恒温水浴锅：广州市典锐化玻实验仪器有限公司；IST-3075/4075（R）恒温摇床：上海沉汇仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 样品前处理
称取1 200 g薏苡仁，经烤箱（180℃、40 min）烘烤后取出，待薏苡仁冷却后将其磨粉，过100目筛，装袋并做好标记，备用。
1.3.2 菌种活化
称取MRS肉汤培养基49.3 g，加蒸馏水1 L，加热煮沸直至完全溶解，高压蒸汽灭菌（121℃、20 min），移取适量培养液放入保藏菌种的安瓿管中，使菌种充分溶解，在摇床中培养24 h。
1.3.3 薏苡仁样液发酵
称取40 g烘烤过的薏苡仁粉，按1∶6（g/mL）的料液比进行调配，添加0.01%α-淀粉酶，在60℃水浴锅中酶解10 min。将薏苡仁浆液在83℃下巴氏杀菌30 min。在无菌操作台中将3种菌种分别接种（接种量3%）到薏苡仁浆液中，将其分别放入最适生长温度（植物乳杆菌37℃、保加利亚乳杆菌42℃、嗜热链球菌42℃）恒温培养48 h，通过测定发酵液中的菌落总数、总酸、总还原糖及pH值，确定最优菌种。
1.3.4 乳酸菌菌落总数的测定
利用生理盐水将发酵液进行梯度稀释至适宜浓度，采用MRS固体培养基平板计数，每种菌进行3次平行试验，结果取平均值，单位CFU/mL。
1.3.5 总酸测定
参考GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》[16]中的方法进行测定，总酸酸度以乳酸计。
1.3.6 还原糖测定
参考GB 5009.7—2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》[17]中的方法进行测定。
1.3.7 pH值测定
薏苡仁发酵浆液样品在设定条件下发酵结束，用pH计测出其对应的值，并记录数据。
1.3.8 感官评定
采用描述性检验法[18]。评定小组由10名人员组成，对薏苡仁发酵浆液样品的色泽、香味及组织形态进行描述性评价，得出每个样品的总分值，确定最优发酵条件。感官评价标准见表1。
表1 薏苡仁乳酸菌发酵浆液的感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standard of lactic acid bacteria fermentation broth of Coix seed
评价项目 评价要点 得分色泽（35分） 均一米黄色 29～35米黄色，有絮凝颗粒 21～28色调不协调 11～20色调极不协调 0～10香味（35分） 香味浓馥幽郁，协调悦人 29～35香味适中，但无异香 21～28香气不足或偏淡或有异香 11～20香气不足，使人厌恶 0～10组织形态（30分） 无分层现象，无沉淀 26～30无分层现象，少许沉淀 18～25有分层现象，有沉淀 9～17完全分层 0～8
1.3.9 薏苡仁发酵浆液工艺优化
1.3.9.1 单因素试验
选取发酵时间（15、20、25、30、35 h）、接种量（1%、2%、3%、4%、5%）、发酵温度（33、35、37、39、40 ℃）和料液比[1 ∶5、1 ∶6、1 ∶7、1 ∶8、1 ∶9（g/mL）]作为考察因素，以pH值及感官评分为指标，每个因素重复3次。
1.3.9.2 正交试验
在单因素试验的基础上，选取发酵时间、接种量、温度以及料液比进行四因素三水平正交试验，正交试验因素水平如表2所示。
表2 L9（34）正交试验因素水平
Table 2 Level factors of L9（34）orthogonal test
水平D发酵温度/℃1 1∶7 1 15 33 2 1∶8 2 20 35 3 1∶9 3 25 37因素A料液比/（g/mL） B接种量/% C发酵时间/h
1.3.10 薏苡仁发酵浆液中活性成分测定及分析
总酚采用福林酚法稍作修改进行测定[19]。标准品的配制：准确称取0.1 g没食子酸，用50 mL蒸馏水溶解、定容至100 mL，得到质量浓度为1 000 mg/L的没食子酸标准储备液，分别取标准储备液0、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 mL 于 100 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，配制质量浓度为0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 mg/L的系列标准溶液。样品处理：称取2 g薏苡仁浆液，加入蒸馏水20 mL，溶解。以3 000 r/min离心10 min，取其上清液，稀释50倍。取1 mL薏苡仁浆液于15 mL试管中，分别加入1 mL福林酚显色剂及3 mL 20%碳酸钠，混匀，于50℃水浴反应30 min。在765 nm波长下测定吸光度。以总酚含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制总酚标准曲线，得到线性回归方程为y=0.004 8x（R2=0.996 1）。
β-葡聚糖采用刚果红测定法测定[20]。以β-葡聚糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制β-葡聚糖标准曲线，得到线性回归方程为y=0.402 6x（R2=0.992 5）。
1.3.11 数据处理
所有试验重复3次后取平均值，并用平均值±标准差表示，将试验测定的数据整理后，用SPSS 25.0统计软件进行相关性分析。
2 结果与分析
2.1 发酵菌种选择
2.1.1 薏苡仁发酵浆液中总酸含量的测定
薏苡仁发酵浆液中总酸含量的测定见图1。
图1 发酵液中总酸含量的测定
Fig.1 Determination of total acid content in fermentation broth
由图1可知，用植物乳杆菌发酵的薏苡仁浆液中总酸含量最高，为（5.94±0.06）g/100 g，而用嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌发酵的薏苡仁浆液中总酸含量相对较少，分别为（3.60±0.40）g/100 g和（5.40±0.60）g/100 g，可推断植物乳杆菌的产酸能力高于嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌。
2.1.2 薏苡仁发酵浆液中还原糖的测定
薏苡仁发酵浆液中还原糖含量的测定见图2。
图2 发酵浆液中还原糖含量的测定
Fig.2 Determination of reducing sugar content in fermentation broth
由图2可知，用保加利亚乳杆菌发酵的薏苡仁浆液中还原糖含量最高，为（0.55±0.45）g/100 g，其次为植物乳杆菌（0.51±0.49）g/100 g，最后为嗜热链球菌（0.44±0.56）g/100 g。因此，可以推断3种菌中消耗还原糖的能力由弱到强的顺序依次为保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌。
2.1.3 薏苡仁发酵浆液中菌落总数的测定
薏苡仁发酵液中的菌落总数见表3。
表3 菌落总数的测定
Table 3 Determination of total bacterial count
菌种菌落总数/（C F U/m L）植物乳杆菌 2.3 8×1 0 11嗜热链球菌 1.8 0×1 0 5保加利亚乳杆菌 1.1 4×1 0 7
由表3可知，用植物乳杆菌发酵的薏苡仁浆液中菌落总数最多，达到了2.38×1011CFU/mL，而用嗜热链球菌发酵的薏苡仁浆液中菌落总数只有1.80×105CFU/mL，保加利亚乳杆菌中的菌落总数为1.14×107CFU/mL。因此，可以推断在相同的生长条件下，植物乳杆菌的繁殖能力较其它两种乳酸菌强。
2.1.4 薏苡仁发酵浆液中pH值的测定
薏苡仁发酵液pH值的测定见图3。
图3 pH值的测定
Fig.3 Determination of pH
由图3可知，用嗜热链球菌发酵的薏苡仁浆液中pH值最高，为4.62±0.38，而用植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌发酵的薏苡仁浆液pH值较低，分别为3.42±0.58和4.24±0.76，说明在相同条件下，嗜热链球菌产生乳酸的能力最弱，其次为保加利亚乳杆菌，最后为植物乳杆菌。
综上所述，用植物乳杆菌发酵的薏苡仁浆液中总酸含量较高、还原糖含量较低、pH值较低、菌落总数较多。因此，以总酸含量高、还原糖含量低、pH值低、菌落总数多为判定标准[21]筛选出最优的发酵菌种为植物乳杆菌。
2.2 单因素试验
2.2.1 料液比对发酵液的影响
料液比对发酵液的影响结果见图4。
图4 料液比对发酵液的影响
Fig.4 Effects of solid-to-liquid ratio on fermentation broth
由图4可知，在5个梯度的料液比中，料液比为1 ∶8（g/mL）的感官评分最高，其中，料液比 1∶8（g/mL）和 1∶7（g/mL）pH 值较低，因此，当料液比为 1∶8（g/mL）时，薏苡仁发酵浆液的感官效果最佳。
2.2.2 发酵时间对发酵液的影响
发酵时间对发酵液的影响结果见图5。
图5 发酵时间对发酵液的影响
Fig.5 Effects of fermentation time on fermentation broth
由图5可知，发酵时间20 h时，感官评分最高，达到了（82.6±7.4）分。其中发酵时间15 h时，pH值最高，其余发酵时间下的pH值均较低。因此，当发酵时间20 h时，薏苡仁发酵浆液的感官效果最佳。
2.2.3 接种量对发酵液的影响
接种量对发酵液的影响结果见图6。
图6 接种量对发酵液的影响
Fig.6 Effects of inoculation amount on fermentation broth
由图6可知，接种量为2%时感官评分最高，并且pH值也较低，因此，当接种量为2%时，薏苡仁发酵浆液的感官效果最佳。
2.2.4 发酵温度对发酵液的影响
发酵温度对发酵液的影响结果见图7。
图7 发酵温度对发酵液的影响
Fig.7 Effects of fermentation temperature on fermentation broth
由图7可知，发酵温度为35℃时，感官评分最高。发酵温度35℃时，pH值最低。因此，当发酵温度为35℃时，薏苡仁发酵浆液的感官效果最佳。
综上所述，当料液比为1∶8（g/mL）、发酵时间为20 h、接种量为2%，发酵温度为35℃时，感官评分较高，pH值相对较低，说明此时的薏苡仁发酵浆液香味适中，协调悦人，分层和沉淀较少，色调也较为协调。
2.3 正交试验
在单因素试验基础上，以感官评分和pH值为指标，采用L9（34）进行正交试验，对薏苡仁乳酸菌发酵工艺条件进行优化，正交试验结果见表4。
表4 发酵条件优化正交试验结果
Table 4 Orthogonal test results of fermentation condition optimization
试验号温度/℃ pH值 感官评分1 1∶7 1 15 33 4.65 84 2 1∶7 2 20 35 5.49 79 3 1∶7 3 25 37 4.73 85 4 1∶8 1 20 37 4.71 84 5 1∶8 2 25 33 4.89 82 6 1∶8 3 15 35 5.46 79 7 1∶9 1 25 35 5.25 82 8 1∶9 2 15 37 4.98 82 9 1∶9 3 20 33 5.48 82 K1 82.667 83.333 81.667 82.667 感官评分K2 81.667 81.000 81.667 80.000 K3 82.000 82.000 83.000 83.667 k1 27.556 27.778 27.222 27.556 k2 27.222 27.000 27.222 26.667 k3 27.333 27.333 27.667 27.889 R 0.223 0.778 0.445 1.222 K1 14.87 14.61 15.09 15.02 pH值K2 15.06 15.36 15.68 16.20 K3 15.71 15.67 14.87 14.42 k1 4.96 4.87 5.03 5.01 k2 5.02 5.12 5.23 5.40 k3 5.24 5.22 4.96 4.81 R 0.28 0.35 0.27 0.59 A料液比/（g/mL）B接种量/%C发酵时间/h D发酵
由表4可知，影响顺序为发酵温度＞接种量＞发酵时间＞料液比，最佳方案为A1B1C3D3，即工艺为料液比1 ∶7（g/mL）、接种量 1%、发酵时间 25 h、发酵温度37℃时最有利于发酵浆液的感官评分及酸的形成。在此条件下进行重复试验，对发酵制得的浆液进行感官评定和理化分析，所得产品的感官评分为86分，pH值为5.01。
2.4 发酵前后活性成分分析
2.4.1 β-葡聚糖含量测定
薏苡仁浆液中β-葡聚糖在发酵后35 h内的含量变化如图8所示。
图8 β-葡聚糖在不同发酵时间下的含量变化
Fig.8 Changes of β-glucan content in different fermentation time
由图8可知，乳酸发酵液中的β-葡聚糖含量有所增加，原因是发酵液中的乳酸水解了含β-糖苷键的寡糖[22]，从而导致β-葡聚糖含量偏低。但在发酵过程中发酵浆液中可能以葡萄糖为原料形成了一些β-葡聚糖物质[23]，发酵后乳酸达到一定含量，β-糖苷键的寡糖不在或较少被乳酸水解[24]，因此导致β-葡聚糖的含量有所增加。薏苡仁发酵浆液中，β-葡聚糖含量在发酵 25 h时达到最高，为（0.56±0.44）g/mL。
2.4.2 总酚含量变化
薏苡仁浆液中总酚在发酵35 h内含量变化如图9所示。
图9 总酚在不同发酵时间的含量测定
Fig.9 Determination of total phenols in different fermentation time
由图9可知，总酚含量随着发酵时间延长呈先上升后平缓的趋势，原因是在发酵前某些结合酚的羟基部分与某些醇类物质相结合，总酚的含量较低[25]。另外，在发酵过程中产生了乳酸，部分酚类物质被乳酸分解所致含量偏低。经过植物乳杆菌发酵后，乳酸达到一定含量，酚类物质不在或较少被乳酸分解，某些可溶性的结合酚被释放，从而使总酚含量有所增加[26]。薏苡仁发酵浆液中，总酚含量在发酵25 h时达到最高，为169.10 mg/mL。
3 结论
本试验筛选出最适宜发酵薏苡仁浆液的乳酸菌为植物乳杆菌，在单因素试验的基础上，最终优化了其发酵工艺，确定了发酵条件为料液比1∶7（g/mL）、接种量1%、发酵时间25 h、发酵温度37℃，为后续制作乳酸菌发酵饮料提供参考。另外，测定了薏苡仁发酵液在不同发酵时间内活性成分总酚和β-葡聚糖的含量变化，两种活性成分均在发酵25 h时达到最高，分别为169.10 mg/mL和0.56 g/mL。因此，此试验筛选出的植物乳杆菌增加了原发酵浆液中的生理活性成分含量，提高其营养价值。
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